一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法

專利名稱：一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法。尤其涉及用修飾組蛋白基因jhdmlb和jhdmla提高誘導生成多能性干細胞效率的方法。
背景技術：
我國是世界人口大國，每年因為創傷、疾病、衰老、以及遺傳所導致的器官缺損、衰竭、功能障礙也居世界之首，以藥物和手術治療為基本支柱的經典醫學治療手段已不能滿足臨床醫學的巨大需求，所以對干細胞與再生醫學的研究受到了相當多科研單位以及社會各界的普遍重視。細胞移植治療是再生醫學研究的一個重要方向，特定類型的細胞移植可被用來治療心臟損傷，神經系統退行性疾病，脊髓損傷，腎衰竭、血液系統疾病等等。然而，細胞移植治療面臨著異體排斥、細胞來源有限等很多難以解決的問題。干細胞是一類具有自我復制能力的細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據干細胞的發育潛能分為三類全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫學界稱之為“萬用細胞”。為了解決細胞移植治療面臨的問題，細胞命運的轉化受到越來越多科學家的重視。雖然細胞分化和命運的決定一直認為是發育過程中不可逆轉而且是穩定的過程，而在體外，越來越多的證據表明，這一過程是可以被逆轉的。對于細胞命運調節的研究還只是處于實驗室研究狀態，離臨床實驗還有很長的距離。這些通過轉錄因子過表達獲得的轉化的細胞還存在很多應用上的難題，比如說，病毒插入、潛在致瘤性、獲得轉分化細胞的純度、在機體內能否彌補正常細胞發揮應有的功能等寸。誘導多能性干細胞(iPS，Induced pluripotent stem cell)是一種類似于胚胎干細胞、具有發育全能性的細胞，通過導入特定的基因誘導體細胞使其獲得干細胞特性。 2006年日本科學家Yamanaka將M個候選基因用逆轉錄病毒一起導入小鼠成纖維細胞， 通過G418抗性篩選FBX15陽性細胞從而分離出類似胚胎干細胞的iPS克隆，最終鑒定出 0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4這4個因子足以誘導小鼠FBX15_iPS細胞產生，這些細胞具有與胚胎干細胞相似的形態、增殖能力以及形成畸胎瘤的能力，但是在基因表達以及甲基化模式方面卻與胚胎干細胞不同，也不能夠得到活體的嵌合體小鼠；隨后，該小組和其他兩個小組改變篩選方法，他們以Nanog陽性細胞作為標準，得到了在多個方面均與胚胎干細胞相似的iPS，這種細胞能夠產生嵌合體后代。最近，三個研究組應用四倍體互補試驗分別獨立證明了小鼠的iPS細胞能夠發育成一個個體，具有發育全能性。遵循誘導小鼠iPS試驗的方法，2007年Yamanaka [8]和俞君英[9]兩個小組分別成功地將人的體細胞重編程為iPS細胞，前者應用逆轉錄病毒將0ct3/4，SoX2，C-MyC，Klf4 轉導入人的表皮成纖維細胞，后者則是應用慢病毒將0ct3/4，Sox2, Nanog, Lin28導入包皮細胞。基因表達譜分析，0ct3/4，NanOg基因啟動子區域甲基化分析都表明人的iPS細胞系與相應的胚胎干細胞系非常相似，將這些細胞注射到裸鼠體內，都能夠發育成3個胚層組織。此外，能夠成功誘導體細胞轉變成iPS不僅限于小鼠和人，還有大鼠、豬和猴。能夠成功重編程的細胞不僅限于成纖維細胞，很多其他類型的成體細胞也能夠被誘導成為iPS細胞，包括胰腺beta細胞、成體神經干細胞、肝細胞、胃細胞、成熟B細胞、造血細胞、腦膜細胞、脂肪干細胞、臍帶血細胞、外周血CD34陽性細胞、角質細胞。處于分化不同階段的細胞，誘導其重編程為iPS的難易程度也不同，以小鼠的造血細胞為例造血干細胞和造血祖細胞的重編程效率可以達到觀％，是末端分化T細胞、B細胞的300倍。在誘導iPS過程中常借助于逆轉錄病毒、慢病毒將外源基因導入細胞，通過這種方式可以得到很高的基因轉導效率，但是由于病毒序列整合到細胞的基因組中，會導致基因插入突變發生，甚至具有致癌性，所以這種具有潛在危險性的基因導入方法顯然不利于iPS技術在再生醫學領域的應用，因此不同的研究小組采用了非整合載體來誘導 iPS并取得了成功，這些載體包括腺病毒載體、普通表達載體、轉座子、附加體載體、小環 DNA(minicircle DNA)載體。Sox2, Klf4, 0ct3/4, c-Myc 和 Sox2，0ct3/4, Nanog, Lin28 兩種組合都能夠成功誘導iPS產生，進一步的研究發現c-Myc不是重編程所必需的，僅有三個轉錄因子Sox2， Klf4, 0ct3/4足以推動人和小鼠的體細胞重編程。神經干細胞內源表達高水平的Sox2、 Klf4,c-Myc,因此只需要導入外源0ct3/4就足以成功誘導iPS。重編程所用的轉錄因子中， Sox2、Klf4和c-Myc都能夠被同家族的其他成員所替代，例如Klf2和Klf5能夠替代Klf4 ； Soxl和Sox3能夠替代Sox2 ；N-Myc和L-Myc能夠替代c_Myc ；但是Octl和0ct6并不能替代0ct4。Esrrb直接與0ct3/4蛋白相結合調控干細胞自我更新和全能性，在重編程過程中 Esrrb能夠替代Klf4，與Sox2、0ct3/4組合即能夠誘導iPS ；0ct3/4是重編程過程中極為重要的一個轉錄因子，最近研究發現核受LRH-I (Nr5a2)和Nr5al能夠替代0ct3/4，其與 Klf4、Sox2組合即能夠誘導小鼠成體細胞轉變成iPS。但是，目前能夠重編程的轉錄因子組合有0ct4，Klf4，Sox2, c-Myc ；0ct4, Nanog, Lin28, Sox2 ；Sox2, Klf4和Lrhl ；0ct4, bmil等幾種不同的組合以及esrrb, tbx3等與重編程相關的基因，現有的重編程方法所需要的轉錄因子組合需要導入的轉錄因子多達三個或四個，而且誘導效率低下，如何減少轉錄因子并且保持較高的重編程效率對于減少重編程細胞突變的積累，提高重編程技術的可操作性具有重要的意義。而且，尋找替代常用轉錄因子的基因有利于重編程機理的研究和重編程技術的改進。

發明內容
本發明的目的是提供一減少轉錄因子并且保持較高的重編程效率對于減少重編程細胞突變的積累，提高重編程技術的可操作性的方法。為實現該目的，采用如下技術方案提供一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，包括如下步驟a、將轉錄因子與Jhdmlb轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Klf4和Sox2的組合，或 0ct4、Klf4、c-Myc 和 Sox2 的組合；
b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增。本發明的另一個技術方案為提供一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，包括如下步驟a、將轉錄因子與Jhdmlb轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，所述誘導培養基包含維生素C，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為單獨的0ct4，或0ct4 和Sox2的組合，或0ct4、Klf4的組合，或0ct4、Klf4和Sox2的組合，或0ct4和Klf4和 Sox2和c-myc的組合；b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增，。優選的，以上步驟為a、將轉錄因子與Jhdmlb轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Sox2的組合，或0ct4和Klf4 的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增。優選的，所述轉錄因子和Jhdmlb為具有多能干細胞誘導功能的編碼或非編碼 RNA、蛋白質或多肽。優選的，所述將Jhdmlb轉入哺乳動物的成體細胞是以包含能夠表達Jhdmlb的載體導入細胞中來實現的。優選的，所述載體為病毒載體、質粒載體、外隨體載體、mRNA載體或直接化學合成。優選的，所述病毒載體為逆轉錄病毒，所述逆轉錄病毒為pMXs載體。優選的，所述Jhdmlb是進行去甲基化修飾的多肽，其功能性變體以及其功能性片段。優選的，所述哺乳動物的成體細胞為成纖維細胞、神經細胞、造血細胞和神經膠質細胞。優選的，所述哺乳動物的成體細胞為小鼠胚胎成纖維細胞。本發明還提供又一個技術方案為提供一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，包括如下步驟a、將轉錄因子與Jhdmlb和Jhdmla轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Sox2的組合，或 0ct4和Klf4的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增。優選的，上述方法包括如下步驟a、將轉錄因子與Jhdmlb和Jhdmla轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，所述誘導培養基包含維生素C，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為0ct4 ；b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增，所述干細胞培養基包含維生素C。本發明的有益效果為利用對組蛋白進行修飾的多肽Jhdmlb、Jhdmla和干細胞誘導因子提高了誘導多能干細胞的效率，提高了誘導多能干細胞的質量。相比于現有的誘導多能干細胞的方法，本發明的方法用較少的干細胞誘導因子種類實現了更好的效果，優選地本發明的方法使用0ct4、Klf4和Sox2, 0ct4和Klf4，0ct4和Sox2,以及單獨的0ct4。本發明的方法還包括將所述細胞暴露于維生素C，其相比于不使用維生素C進一步提高了誘導多能干細胞的效率。本發明的方法通過使用較少的干細胞誘導因子降低了潛在的致癌性，同時獲得了較高的誘導效率，并可以得到高質量的具有生殖系傳遞能力的誘導多能干細胞。


圖1顯示了 Jhdmla或Jhdmlb提高SKO介導的誘導多能性干細胞效率的數據，其中對照是沒有插入任何基因序列的pMXs-FLAG空載體；圖2為Jhdmla或jhdmlb促進SKOM介導的重編程效率數據圖；圖3顯示了在維生素C存在的條件下，jhdmla和jhdmlb共同作用能夠在只有SO、 KO以及0ct4的條件下進行重編程；圖4中a，d為0ct4+jhdmlb (簡寫為0B)最終形成的誘導多能干細胞的顯微照片； b，e為OB最終形成的誘導多能干細胞注射囊胚后發育形成的嵌合體后代照片；c，f為OB最終形成的誘導多能干細胞注射囊胚后發育形成的嵌合體與野生型小鼠個體交配后產生的后代的照片；圖5顯示了對多能干細胞克隆的基因組DNA進行PCR擴增的結果表明OB誘導的多能干細胞克隆C4、C14、C15和C16基因組中只有0ct4和Jhdmlb整合，對照是感染Sox2、 klf4.oct4.cMyc和Jhdmlb的細胞提取的基因組DNA，MEF表示從小鼠胚胎成纖維細胞中提取的基因組DNA;圖6顯示了定量PCR結果，表明OB誘導的多能性干細胞克隆C4、C14、C15和C16 外源基因被沉默表達，其中OB D4對照是從感染0ct4和Jhdmlb并培養4天后的細胞中提取的mRNA反轉錄得到的cDNA模板，MEF是小鼠胚胎成纖維細胞；圖7顯示了實時定量PCR結果，其表明OB誘導的多能干細胞克隆C4、C14、C15和 C16表達胚胎干細胞特異性基因，其中Rl是小鼠胚胎干細胞系，MEF是小鼠胚胎成纖維細胞；圖8顯示了免疫熒光的結果，其表明OB誘導的多能干細胞克隆C14表達胚胎干細胞特異性基因Rexl和胚胎干細胞特異性表面標記物SSEA-1，其中Marker表示干細胞特異性標記分子(即Rexl或SSEA-1)；圖9顯示了小鼠胚胎成纖維細胞和誘導的多能性干細胞的0ct4鄰近啟動子區域里Cpk甲基化實測程度分析結果；圖10顯示了小鼠胚胎成纖維細胞和誘導的多能性干細胞的Nanog鄰近啟動子區域里Cpk甲基化實測程度分析結果；圖11顯示了 0ct4和Jhdmlb誘導產生的多能干細胞的核型圖；圖12顯示了 Jhdmlb的不同突變體誘導多能性干細胞的效率。Jmjc突變是將221 位的組氨酸、222位的異亮氨酸、223位的天冬氨酸均突變為丙氨酸；CxxC突變是將586、589 和592位的半胱氨酸突變為丙氨酸；圖13顯示了 pMXs-FLAG質粒圖譜。
具體實施方式
本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同含義。關于本領域的定義及術語，專業人員例如具體可參考Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel，et al, John Wiley & Sons，2009。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。盡管本發明的廣義范圍所示的數字范圍和參數近似值，但是具體實施例中所示的數值盡可能準確的進行記載。然而，任何數值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自的測量中存在的標準偏差所致。另外，本文公開的所有范圍應理解為涵蓋其中包含的任何和所有子范圍。本文中所使用的術語“多肽”、“蛋白質”可互換地表示通過共價鍵(例如肽鍵)相互連接的一串至少兩個氨基酸殘基，其可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽。特別地，本文所述多肽是人和/或小鼠來源的多肽。本文使用的術語“變體”、“多肽變體”或“類似物”表示通過一個或多個取代、缺失、插入、融合、截短或其任意組合在氨基酸序列上有所不同的多肽。變體多肽可以是完全功能性的或者可缺乏一種或多種活性的功能。本文使用的術語“功能性變體”表示含有例如僅僅保守性改變或非關鍵殘基或非關鍵區域的改變，并且保留原始多肽的功能。功能性變體還可包含相似氨基酸的替換，其導致功能未改變或不顯著的改變。可以通過本領域已知的方法鑒定對于功能來說重要的氨基酸，所述方法例如定點誘變或甘氨酸掃描誘變 (Cunningham, B. ^P Wells, J. ,Science, 244 :1081-1085，1989)。可以例如通過結構分析如結晶、核磁共振或光親和標記來確定對于多肽活性來說關鍵的位點(Smith，L.等，J. Mol. Biol.，224 :899-904,1992 ；de Vos, A.等，Science,255 :306-312,1992)。在本發明的實施方案中，Jhdmla的變體選自包含與SEQ ID NO 1所編碼的氨基酸序列有至少70%同源性(優選80%、90%、95%、98%、99%)的氨基酸序列的多肽。在本發明的另一些實施方案中，Jhdmlb的變體選自包含與SEQ ID NO :2所編碼的氨基酸序列有至少70%同源性(優選80%、90%、95%、98%、99%)的氨基酸序列的多肽。所述Jhdmla 編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :7，所述Jhdmlb編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :8.本文使用的術語“片段”指僅有全長序列一部分的分子。例如，Jhdmlb多肽片段是截短的Jhdmlb。片段可含有來自全長序列任一端的序列，或者它們可含有來自全長序列中間的序列。片段可以是“功能性片段”，例如保留全長多肽的一種或多種功能的片段。本文使用的術語“功能性片段”表示所述片段保留了全長多肽的功能，例如誘導多能性干細胞或者提高誘導多能性干細胞效率。除非另外指明，在本文中提到多肽、核酸或其它分子時，其含義包括了功能性變體和功能性片段。例如，Jhdmlb和Jhdmla還分別表示天然Jhdmlb和Jhdmla的功能性變體和功能性片段。本文使用的術語“Jhdmlb”可以表示含JmjC結構域的組蛋白去甲基化酶 (JmjC-domain-containing histone demethylase, JHDM)家族中一個進化上保守且普遍表達的成員，其也被稱為!^ 110。特別地，所述多肽是人和/或小鼠來源的。本文使用的術語“Jhdmla”可以表示含JmjC結構域的組蛋白去甲基化酶 (JmjC-domain-containing histone demethylase, JHDM)家族中的另一個成員，其也被稱為i^bxlll。特別地，所述多肽是人和/或小鼠來源的。
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本文使用的術語“誘導的多能干細胞”、“誘導的多能性干細胞”、“誘導性多能干細胞”、“誘導多能干細胞”或者“iPS”(induced pluropotent stem cells)可互換地使用，表示人工地將非多能性細胞(例如體細胞)誘導而成的多能性干細胞。所述誘導通常是通過強制(forced)表達特定基因來實現的，這一過程在本文中也稱為“將細胞誘導成多能性干細胞”。本文使用的術語“干細胞誘導因子”表示能夠單獨地或與其他因子相組合地將細胞誘導成多能性干細胞的因子，例如蛋白質、多肽、編碼或非編碼RNA等。優選地，所述干細胞誘導因子是轉錄因子，包括Oct-3/4、Sox家族成員、Klf家族成員、Myc家族成員、Nanog, LIN28等。優選地，所述干細胞誘導因子選自0ct4、Klf4、Sox2和c_myc中的一種或多種。 更優選地，所述干細胞誘導因子至少包括0ct4。特別地，所述多肽是人和/或小鼠來源的。本文使用的術語“0ct4”表示八聚體轉錄因子家族(the family of octamer transcription factors)的一個成員，其在維持細胞的多能性上起到關鍵作用。在文獻中， 0ct4也曾被稱為0ct3。本文使用的術語“Klf4”表示Kriippel樣轉錄因子家族(Kriippel-like family of transcription factors)的一個成員。本文使用的術語“Sox2”表示Sox轉錄因子家族的成員之一。本文使用的術語“c-myc”表示本領域技術人員熟知的一種轉錄因子，其調控許多基因的表達，募集組蛋白乙酰基轉移酶，并且其突變與許多癌癥有關。本文使用的術語“組蛋白修飾”表示多種對組蛋白的修飾，例如乙酰化、甲基化、去甲基化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等。特別地，所述組蛋白修飾包括組蛋白的去甲基化。本文所使用的術語“對象”是指哺乳動物，如人類，但也可以是其它動物，如家養動物(如狗、貓等)，家畜(如牛、羊、豬、馬等)或實驗動物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠
寸乂 O本文使用的術語“一致性”、“百分比一致性”、“同源性”或“同一性”指兩個氨基酸序列之間或者核酸序列之間的序列同一性。可以通過比對兩個序列來確定百分比一致性， 百分比一致性指所比較的序列共有位置相同殘基(即氨基酸或核苷酸)的數量。可使用本領域的標準算法(例如 Smith 和 Waterman，1981，Adv. App 1. Math. 2 :482 ；Needleman 和 Wunsch,1970，J.MoI. Biol. 48 :443 ；Pearson 禾口 Lipman，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. ，USA, 85 :2444)或者通過這些算法的計算機化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release 7. O, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)進行序列比對和比較，所述計算機化版本公開可用為BLAST和FASTA。另外，通過美國國家衛生研究院 (Bethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比較。當使用BLAST和缺口 BLAST程序時，可使用各個程序(例如BLASTN，在美國國家生物技術信息中心的因特網站點上可用)的缺省參數。在一個實施方案中，可使用缺口權重為1的GCG來確定兩個序列的百分比同一性，使得每個氨基酸缺口給予權重如同它是兩個序列間的單氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程序(2. O版)，其是GCG(Accelrys，San Diego, CA)序列比對軟件包的一部分。本文中的術語“載體”以本領域技術人員熟知的意義使用，其可以是表達載體。所述載體可包括病毒(例如痘病毒、腺病毒、桿狀病毒等)；酵母載體、噬菌體、染色體、人工染色體、質粒、粘粒、附加體載體、mRNA載體或直接化學合成。優選的，所述病毒載體為逆轉錄病毒和/或慢病毒載體。更優選地，所述逆轉錄病毒為PMXs載體。本文中使用的術語“過量的”表示顯著地高于正常水平，特別地表示多肽的表達量統計學顯著地高于正常細胞中的表達量。優選地，高出20%、50%、100%、200%或者甚至5 倍、10倍或100倍。本文中使用的術語“過表達”表示表達水平顯著地高于正常水平，特別地表示多肽的表達量統計學顯著地高于正常細胞中的表達量。優選地，高出20 %、50 %、100 %、200 %或者甚至5倍、10倍或100倍。本文使用的術語“導入”表示將外源物質(如核酸或蛋白質)引入細胞的過程，例如通過磷酸鈣轉染、病毒感染、脂質體轉染、電穿孔或基因槍等方式進行。在本文中，將外源的多肽遞送進細胞可通過多種方式進行，例如通過運載體和/ 或轉運因子進行，優選通過脂質體、細菌多肽片段等(可參見W02002/079417，其內容通過引用并入本文)。本發明方法可使用的細胞優選地是哺乳動物細胞，更優選人和小鼠細胞。特別地， 所述細胞是體細胞，例如上皮細胞、神經細胞、成纖維細胞、內皮細胞、肌細胞、造血細胞、 免疫細胞、淋巴細胞等。更特別地，所述細胞是胰腺beta細胞、成體神經干細胞、肝細胞、胃細胞、成熟B細胞、造血細胞、腦膜細胞、脂肪干細胞、臍帶血細胞、外周血⑶34陽性細胞、角質細胞等。實施例1 1、包含Jhdmla和Jhdmlb編碼區的載體的構建a.克隆引物設計從 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed 獲取 Jhdmla 禾口 Jhdmlb 的 cDNA 的序列信息。其中Jhdmla cDNA克隆區序列為SEQ ID NO 1, Jhdmlb cDNA克隆區序列為SEQ ID NO :2，通過設計特異性的引物擴增Jhdmla和Jhdmlb的編碼序列。Jhdmla上游引物堿基序列如SEQ ID NO 3所示；Jhdmla下游引物堿基序列如SEQ ID NO 4所示；Jhdmlb上游引物堿基序列如SEQ ID NO 5所示；Jhdmlb下游引物堿基序列如SEQ ID NO 6所示。b.通過RT-PCR擴增編碼序列從分離的ICR小鼠的胚胎成纖維細胞(MEF)和人Hl胚胎干細胞中按照下述方法提取總mRNA 去除培養盤中的培養基，以3-5毫升的生理鹽水(PBS) (Gibco公司)清洗細胞并棄去漂洗液然后向培養盤中加入1毫升細胞裂解液Trizol (Takara公司)，用移液槍吸取混合液并輕柔吹打細胞使其完全溶解在裂解液中，隨后將其轉移至干凈的1. 5毫升離心管中于負80°C保存或立即進行下面的提取步驟。接下來，加入200微升的三氯甲烷，顛倒混勻約30秒，然后于4°C 12000轉離心5分鐘。小心吸取上清轉移至潔凈的1. 5毫升離心管中，隨后加入等體積的異丙醇并混勻，室溫放置5分鐘后12000轉4°C離心5分鐘，管底可見白色小塊沉淀；小心棄去上清，接著加入80%乙醇溶液500微升用于漂洗掉殘余的異丙醇， 12000轉離心，去除乙醇溶液，室溫放置30分鐘使管底的白色總mRNA充分干燥。隨后，向離心管中加入30-50微升的雙蒸水于55°C孵育，30分鐘后取出，用分光光度計測定總mRNA濃
10度。所提取的總mRNA于負80°C保存或直接用于反轉錄制備cDNA備用。反轉錄具體過程和方法如下所述。通常取1微克的總mRNA進行反轉錄，加入寡聚脫氧核糖脲嘧啶核苷酸(oligodT，takara公司)，dNTP (takara公司)，RTace (Toyobo公司)，RT buffer和RRI (RNAse抑制劑，takara公司)和不含RNase/DNase的水，于PCR儀上42°C反應60分鐘，然后98°C孵育五分鐘，隨后冷卻至室溫。反轉錄成功后，從中取出0. 5 微升作為模板，使用上述方法設計的引物，采取聚合酶鏈式反應擴增目的基因，所用的試劑有高保真聚合酶KOD及其緩沖液(Toyobo公司)，dNTP (Takara公司)，引物，在PCR儀上運行下述程序96°C變性5分鐘，95°C 30秒，60°C退火25秒，68°C延伸3. 5分鐘，2_4步循環 32次。c.質粒構建請參閱圖13，完成擴增反應后，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠回收試劑盒(天根公司，DP214-0;3)提取PCR片段。pMXs載體(載體購自addgene，插入多克隆位點和FLAG標簽序列)，改造后的pMXs載體被稱為pMXs-FLAG，其質粒圖參見圖13。以pmel 酶切，應用CIAP小牛腸堿性磷酸酶對其去磷酸化以防止載體自連。用凝膠回收試劑盒(天根公司，DP214-03)回收處理好的載體備用。pMX-FLAG載體和Jhdmla/Jhdmlb的基因片段應用連接試劑盒(Takara公司，DNA Ligation Kit)進行，然后將連接產物轉化大腸桿菌感受態細菌，挑選陽性克隆，提取質粒，測序確定，最后大量制備質粒。2、將Jhdmla/Jhdmlb以及多能性干細胞誘導因子(轉錄因子)的編碼序列導入小鼠胚胎成纖維細胞。如無特殊說明，基于小鼠的體細胞重編程均采用如下方式進行。培養基飼養層細胞、MEF細胞和PlatE細胞的培養基組成為高糖基礎培養基 DMEM(gibco)，外加 10% 胎牛血清(FBS，PAA)。誘導培養基本發明使用實驗室常規的誘導培養基，優選使用的誘導培養基成分包括DMEM高糖培養基(Gibco)、15%的胎牛血清(FBS，Gibco)、0. ImM非必需氨基酸(NEAA， Gibco)，2mML-谷氨酰胺(Glutamax，Gibco)，ImM 丙酮酸鈉(sodium pyruvate, Gibco), 55μΜβ巰基乙醇(β-ME, Gibco)，青霉素(50U/mL)和鏈霉素(50 μ g/mL)，白血病抑制因子1000U/ml (LIF，Millipore)，根據需要添加維生素C (sigma)，其濃度是50微克每毫升。干細胞培養基本發明使用實驗室常規的干細胞培養基，優選mES干細胞培養基，其組分為高糖DMEM培養基添加15%胎牛血清、0. ImM非必需氨基酸(NEAA，Gibco), 2mML-谷氨酰胺(Glutamax，Gibco)，ImM 丙酮酸鈉(sodium pyruvate, Gibco),55 μ Μβ 巰基乙醇(gibco)、青霉素(50U/mL)和鏈霉素(50 μ g/mL)，白血病抑制因子1000U/ml (LIF, Millipore)。根據需要添加維生素C(sigma)，其濃度是50微克每毫升。KSR無血清培養基KSR為Knockout Serum R印lace的縮寫，為一種商品化代血清干細胞培養添加劑，用于培養干細胞或iPS克隆的完全KSR無血清培養基，其組成成分為KN0CK0UT DMED (—種滲透壓經過優化的適于干細胞培養的基礎培養基)，15% KSR添加齊[J，0. ImM 非必需氨基酸(NEAA，Gibco)，2mML_ 谷氨酰胺(Glutamax，Gibco)，ImM 丙酮酸鈉 (sodium pyruvate, Gibco), 55 μ Μβ 巰基乙醇(β-ME，Gibco)，青霉素(50U/mL)和鏈霉素 (50 μ g/mL)，白血病抑制因子1000U/ml (LIF,Millipore)，。所有iPS過程與克隆培養基都添加鼠白細胞抑制因子LIF(millip0re，商品名為ESGR0，為一種抑制小鼠干細胞分化的生長因子)，添加的終濃度為1000U/ml。3、用于重編程的細胞重編程采用的體細胞類型均為0G2小鼠胚胎成纖維細胞(由實驗室自制)，傳代數不超過三代。0G2小鼠的一個特點是在干細胞特異表達基因0ct4基因的啟動子后連有綠色熒光蛋白(GFP)。在重編程過程中，當0G2小鼠胚胎成纖維細胞內源0ct4被激活時，綠色熒光蛋白伴隨表達，在熒光顯微鏡下，可見成功重編程的細胞或克隆細胞團塊呈現綠色，通過直接統計重編程克隆即綠色熒光克隆數或采用流式細胞儀分析綠色熒光細胞的比率，可以容易地比較不同條件下的重編程效率。如下所述準備重編程細胞。以20000個細胞/孔的密度種植細胞于12孔培養板 (Corning)，細胞種植6_18小時后，視其密度和狀態用帶有小鼠重編程因子的病毒進行感
^fe ο4、病毒的制備用于重編程的轉錄因子包括小鼠0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc的cDNA的逆轉錄病毒載體pMXs(來自 Addgene 公司，編號分別為 Plasmid 13366，Plasmid 13367，Plasmidl3370 和 Plasmid 13375) ；0ct4, NCBI 登錄號為 NM_013663 ；Sox2, NCBI 登錄號為 NM_011443 ；Klf4, NCBI登錄號為010637 ；c_Myc，NCBI登錄號為NM_001177353。應用自制的磷酸鈣轉染試劑將 PMX載體上的重編程因子質粒轉染進病毒包裝細胞(PlatE)，具體過程接種750萬PlatE 細胞于10厘米直徑的培養盤(Corning)，12小時后以7. 5毫升不含青霉素/鏈霉素的培養基更換掉舊的培養基，隨后將細胞放進培養箱。接下來準備轉染混合物取25微克質粒加入15毫升離心管，按序依次加入156. 25微升2M的氯化鈣溶液，補加適量水使三者的總體積為1. 25毫升，混合均勻，然后加入1. 25毫升HBS溶液，立即混合均勻，然后靜置2分鐘， 隨后逐滴加入PlatE培養盤中，混合均勻。轉染后9-12小時，更換10毫升新鮮培養液，轉染后48小時收集培養液并以0. 45微米濾膜過濾培養液，作為第一次感染用病毒液，添加新鮮培養液M小時后如此再收集培養液作為第二次感染病毒液。5、用病毒感染MEF細胞感染分兩輪進行，所用的誘導因子均同時感染細胞，12孔板的每個孔感染病毒用量為1毫升，第一輪感染后M小時后進行第二輪感染，第二輪感染后M小時將病毒液更換成mES培養基(前述)。換液當天記為第0天(DO)；感染后不同時間點，按實驗需要在原孔內數GFP熒光克隆數或采用流式細胞儀分析GFP熒光細胞的比率。6、對感染后的細胞進行培養直到干細胞克隆形成使用玻璃針將形態隆起，邊緣清晰的胚胎干細胞樣的單個克隆挑選出來，直接轉移至提前鋪好飼養層細胞(飼養層細胞為絲裂霉素處理過的ICR小鼠成纖維細胞)的培養板(Corning)中以KSR培養基進行培養。感染后的第2天，將培養體系更換為新鮮的誘導培養基，之后每天更換誘導培養基直到實驗完成。按上文所述干細胞克隆形成的方法，用不同的多能干細胞誘導因子組合進行實驗。各多能干細胞誘導因子組合說明如下Kif4, Sox2, c-Myc, 0ct4 的組合簡寫為 SK0M。
Kif4, Sox2, 0ct4 的組合簡寫為 SK0。Kif4，0ct4的組合簡寫為K0。Sox2，0ct4的組合簡寫為SO。0ct4與Jhdmlb的組合簡寫為OB。C4、C14、C15、C16是從OB誘導的重編程細胞中挑選的四株克隆。選用各干細胞誘導因子組合實驗結果如下請參閱圖1，無論是否有維生素C的存在，Jhdmla或Jhdmlb對于重編程的效率都有明顯地提高，在維生素C存在的條件下，增加幅度更為顯著，圖1顯示了 Jhdmla或 Jhdmlb提高SKO介導的誘導多能性干細胞效率的數據，其中對照是沒有插入任何基因序列的pMXs-FLAG空載體；請參閱圖2，無論是否有維生素C的存在，Jhdmla或Jhdmlb對于重編程的效率都有明顯地提高，在維生素C存在的條件下，增加幅度更為顯著，圖2顯示了 Jhdmla或Jhdmlb 提高SKOM介導的誘導多能性干細胞效率的數據，其中對照是沒有插入任何基因序列的 pMXs-FLAG 空載體；請參閱圖3，在維生素C存在的條件下，Jhdmla和Jhdmlb共同作用，能夠使得在只有S0、K0或者0ct4的條件下誘導多能性干細胞，mESC+Vc表示誘導過程中所用的培養基是干細胞培養基mES，并且添加了 50 μ g/ml的維生素C，其中對照是pMXs-FLAG空載體。因此，本發明得出，Jhdmla和Jhdmlb能夠顯著改善誘導多能性干細胞的效率，在保持較高的重編程效率大大減少所需導入的轉錄因子的種類，從而對于減少重編程細胞突變的積累，減少其致癌性提供了重大的益處。另外，本發明的方法也提高重編程技術的可操作性，降低了操作的難度，為后續的醫藥用途提供了便利。實施例2:對實施例1所得誘導性多能干細胞的鑒定如圖3以及圖6至圖10所示，對0ct4和Jhdmlb誘導的多能干細胞克隆進行一系列鑒定實驗，以證明其是否為iPS細胞(誘導性多能干細胞)，鑒定實驗包括定量PCR、免疫熒光分析其表面標記物、啟動子甲基化程度分析、核型鑒定、嵌合體形成等。定量PCR實驗所有定量PCR實驗均應用Takara公司的試劑盒在Biorad公司CFX-96型定量PCR 儀上完成，所用反應條件是95°C 2分鐘；95°C 10秒，60°C 30秒，讀取熒光值，如此重復40個循環。啟動子區域甲基化狀況分析該分析通過亞硫酸氫鈉測序方法進行測定。提取目的細胞中的基因組 DNA(Promega 公司，Wizard Genomic DNA Purification Kit)，測定濃度值，將約 2ugDNA 于1. 5mlEP管中使用ddH20稀釋至50 μ 1，加入5. 5ul新鮮配制的3M NaOH并于42°C水浴 30min ；隨后取出溶液，加30 μ 1體積的IOmM對苯二酚(氫醌)(sigma)至上述水浴后混合液中，然后再加520 μ 1體積的3. 6Μ亞硫酸氫鈉(Sigma，S9000)至上述水浴后溶液中，EP 管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液；加200 μ 1石蠟油，防止水分蒸發，防制氧化并于50°C避光水浴16h。隨后，將移液器槍頭伸入石蠟油層下，吸取混合液至一潔凈1.5ml離心管中，使用Promega Wizard Cleanup DNA純化回收系統(Promega，A7280)對修飾后DNA進行回收，-20°C保存或進行下一步的實驗。取50ng上述提取的DNA作為模板進行PCR反應，隨后對PCR產物進行凝膠回收(天根公司，DP214-03)，然后將PCR產物與T載體(Takara公司) 進行連接和轉化，挑選陽性克隆送測序公司進行測序，得到結果進行比對，統計CpG島的甲基化狀態。iPS細胞的核型鑒定iPS細胞的核型鑒定按照下述方法進行待做核型分析的細胞在收獲前2-3小時加入0. Iml 5ug/ml秋水仙素(市售，終濃度0. lug/ml)混勻后繼續培養2_3小時，轉入IOml 離心管中，以1500-2000轉/分鐘離心10分鐘，去上清液，加入8ml低滲液(0. 075M Kcl, 37°C預熱)將細胞沉淀吹打均勻，放入溫箱中37°C半小時，加入Iml新配制的固定液(甲醇冰醋酸體積比為3 1的混合物，原料市售)，輕輕混勻后以與前面相同的轉速和時間離心，吸去上清液。加入8mL固定液并充分將細胞混勻，室溫固定至少半小時，重復離心后， 去掉上清液，加入新鮮固定液再次固定至少半小時(最好過夜)經離心和去上清液后的細胞沉淀中加入約0. 2ml新鮮固定液混勻，細胞懸液滴于預冷的載玻片上(以每張玻片3滴細胞懸液為宜)，酒精燈烘烤滴片，冷卻后進行分帶處理。囊胚嵌合體試驗囊胚嵌合體試驗，將iPS細胞注射到供體小鼠的囊胚腔中，再將注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宮中制作嵌合體小鼠，出生的小鼠根據毛色來判定是否產生嵌合。按以上方法進行實驗，結果分析為請參閱圖5，顯示了對多能干細胞克隆的基因組DNA進行PCR擴增的結果表明OB 誘導的多能干細胞克隆C4、C14、C15和C16基因組中只有0ct4和Jhdmlb整合，對照是感染 Sox2、klf4、oct4、cMyc和Jhdmlb的細胞提取的基因組DNA，MEF表示從小鼠胚胎成纖維細胞中提取的基因組DNA;請參閱圖6，顯示了定量PCR結果，表明OB誘導的多能性干細胞克隆C4、C14、C15 和C16外源基因被沉默表達，其中OB D4對照是從感染0ct4和Jhdmlb并培養4天后的細胞中提取的mRNA反轉錄得到的cDNA模板，MEF是小鼠胚胎成纖維細胞；請參閱圖7，如圖7所示，顯示了實時定量PCR結果，其表明OB誘導的多能干細胞克隆C4、C14、C15和C16表達胚胎干細胞特異性基因，其中Rl是小鼠胚胎干細胞系，MEF是小鼠胚胎成纖維細胞；使用0ct4和Jhdmlb組合得到的干細胞的內源性胚胎干細胞轉錄因子等表達量與胚胎干細胞表達基本一致。表明OB誘導的多能干細胞克隆C4、C14、C15和 C16表達胚胎干細胞特異性基因，因此說明通過本發明方法誘導得到的多能性干細胞具有多能性干細胞的特征。請參閱圖8，如圖8所示，免疫熒光結果顯示OB得到的多能干細胞表面表達 SSEA-I，而且表達Rexl。請參閱圖9，顯示0ct4啟動子區域的CpG島甲基化狀態分析，供體細胞的CpG島未甲基化，而誘導多能干細胞相應位置的CpG島發生顯著的去甲基化。請參閱圖10，顯示Nanog啟動子區域的CpG島甲基化狀態分析，0B-C14、0B_C15和 0B-C16分別是由0ct4和Jhdmlb誘導產生的多能干細胞的三株多能干細胞。黑色部分為表示已甲基化，白色表示沒有甲基化。供體細胞的CpG島未甲基化，而誘導多能干細胞相應位置的CpG島發生顯著的去甲基化；Nanog和0ct4是胚胎干細胞特異性表達的基因，表達狀態與細胞的命運密切相關，這些結果說明，使用OB組獲得的細胞其命運發生了改變，也就是說被誘導成為了多能性干細胞。請參閱圖11，顯示通過本發明方法得到的干細胞的核型正常，0B-C14、0B-C15和 0B-C16分別是由0ct4和Jhdmlb誘導產生的多能干細胞的三株多能干細胞，它們都具有正常的核型。請參閱圖4，如圖4所示a，d為0ct4+jhdmlb(簡寫為0B)最終形成的誘導多能干細胞的顯微照片；b，e為OB最終形成的誘導多能干細胞注射囊胚后發育形成的嵌合體后代照片；c，f為OB最終形成的誘導多能干細胞注射囊胚后發育形成的嵌合體與野生型小鼠個體交配后產生的后代的照片；顯示了通過本發明方法得到的干細胞可以形成嵌合體，其中供體細胞為誘導的多能干細胞，其細胞來源是0G2/U9細胞，而假孕小鼠是實驗飼養的ICR 小鼠。得到的嵌合體具有將原來供體細胞通過生殖系傳遞到下一代，說明此干細胞具有良好的質量。Jhdmlb變體的功能性測定請參閱圖12，如圖12所示，在中發生突變的Jhdmlb變體不具有提高重編程效率的活性，因此Jhdmlb的DNA結合結構域(CXXC)和催化結構域(Jmjc)對于重編程是必須的， 缺少任何一個均不能促進重編程。而且，0ct4和Jhdmlb的組合在普通的培養基條件下就可以完成重編程，在維生素C存在的條件下效果更加顯著。以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
權利要求
1.一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉錄因子與Jhdmlb轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Klf4和Sox2的組合，或0ct4、 Klf4、c-Myc 和 Sox2 的組合；b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增。
2.一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉錄因子與Jhdmlb轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，所述誘導培養基包含維生素C，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和 Sox2的組合，或0ct4和Klf4的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增。
3.根據權利要求2所述的提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉錄因子與Jhdmlb轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，所述誘導培養基包含維生素C，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和 Sox2的組合，或0ct4和Klf4的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增，所述干細胞培養基包含維生素C。
4.根據權利要求2所述的提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，所述轉錄因子和Jhdmlb為具有多能干細胞誘導功能的編碼或非編碼RNA、蛋白質或多肽。
5.根據權利要求3或4任一項所述的提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，所述將Jhdmlb轉入哺乳動物的成體細胞是以包含能夠表達Jhdmlb的載體導入細胞中來實現的。
6.根據權利要求5所述的提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，所述載體為病毒載體、質粒載體、外隨體載體、mRNA載體或直接化學合成。
7.根據權利要求5所述的提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，所述病毒載體為逆轉錄病毒，所述逆轉錄病毒為PMXs載體。
8.根據權利要求1所述的提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，所述 Jhdmlb是進行去甲基化修飾的多肽。
9.根據權利要求1所述的提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，所述哺乳動物的成體細胞為成纖維細胞、神經細胞、造血細胞和神經膠質細胞。
10.根據權利要求1所述的提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，所述哺乳動物的成體細胞為小鼠胚胎成纖維細胞。
11.一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉錄因子與Jhdmlb和Jhdmla轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為單獨的0ct4，或0ct4和Sox2的組合，或0ct4和 Klf4的組合，或0ct4和Klf4和Sox2的組合；b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增。
12.根據權利要求11所述的提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，其特征在于，包括如下步驟a、將轉錄因子與Jhdmlb和Jhdmla轉入哺乳動物的成體細胞，在誘導培養基中培養，所述誘導培養基包含維生素C，誘導獲得多能性干細胞克隆，所述轉錄因子為0ct4 ；b、將誘導獲得的多能性干細胞克隆在干細胞培養基中培養擴增，所述干細胞培養基包含維生素C。
全文摘要
本發明涉及一種提高誘導生成多能性干細胞效率的方法，尤其涉及用修飾組蛋白基因jhdm1b和jhdm1a提高誘導生成多能性干細胞效率的方法。本發明利用Jhdm1b、Jhdm1a和干細胞誘導因子提高了誘導多能干細胞的效率，提高了誘導多能干細胞的質量。所述干細胞誘導因子為Oct4、Klf4的組合，或Sox2、Oct4和Klf4的組合，或Oct4和Sox2的組合，以及單獨的Oct4。本發明的方法還包括將所述細胞暴露于維生素C，其相比于不使用維生素C進一步提高了誘導多能干細胞的效率。本發明的方法通過使用較少的干細胞誘導因子降低了潛在的致癌性，同時獲得了較高的誘導效率，并可以得到高質量的具有生殖系傳遞能力的誘導多能干細胞。
文檔編號C12N5/10GK102417894SQ201110323779
公開日2012年4月18日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者王濤, 裴端卿 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院