專利名稱：miR-45調控線蟲壽命的應用和方法
技術領域：
本發明涉及miR-45調控線蟲壽命的應用，以及調控線蟲壽命的方法和調節線蟲體內微小RNA表達量的方法。
背景技術：
多年來，科學家們對衰老的機理一直眾說紛紜。現在人們普遍認為:衰老主要是由于身體的正常防衛及修復機能衰退導致的。隨著遺傳學和分子生物學的發展，生物衰老機理的研究在分子水平上獲得了突破性的進展。目前人們通過對一些模型生物如秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)、果蜆(Drosophila)和小鼠的單一基因突變研究發現，一些基因能夠使這些生物的壽命顯著延長達6倍以上。并且人們還發現，許多對某一物種(如果蠅)有延長壽命作用的基因在其它物種(如秀麗線蟲、小鼠等)中具有相似的作用或者可以找到同源基因。既然生物在進化過程中許多與壽命相關的基因信號通路是非常保守的，那么通過對模型動物秀麗線蟲體內與衰老相關的信號通路和基因的研究便有可能幫助我們從基因水平認識和理解人類衰老的原因。秀麗線蟲是一種可以獨立生存的線蟲，長度約1mm，生活在16°C _25°C溫度恒定的環境中。線蟲由于個體小、結 構簡單、細胞定數、生活周期短、發育迅速、易于得到突變體、蟲體透明、易于在實驗室培養，已成為研究生物發育和衰老的經典模式生物。在實驗室20°C的環境下，秀麗線蟲平均壽命為二、三周，發育一個世代僅約為4天。近年來以線蟲為模型來研究與衰老相關基因的功能以及相關的信號通路取得了長足的發展，讓我們對衰老過程有了更深入的了解。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一類小的核酸分子，由核基因編碼，其具有頸環結構的前體經過Dicer等酶的加工之后形成 21_23nt的非編碼的成熟的小RNA分子maturemiRNA ;隨后mature miRNA在相關蛋白的協助下通過5’第2_8號堿基與靶基因mRNA 3’UTR完全互補的方式識別靶基因，誘導靶基因mRNA的降解或翻譯的抑制。lin-4是1993年在秀麗線蟲中發現的第一個miRNA，功能研究發現它能階段性調控線蟲胚胎后期發育。隨著2000年第二個調控線蟲時序性發育的miRNA (let-7)的發現，miRNA的研究掀起熱潮。miRNA及miRISC(RNA-蛋白質復合物)在動物和植物中廣泛表達，并且在物種進化中相當保守，目前已有一小部分miRNA生物學功能得到闡明，這些miRNA參與調節細胞生長，組織分化，生長發育等諸多方面。可以相信，隨著研究的深入，miRNA必將在生命起源和物種進化、基因表達調控的復雜性、疾病發生和發展的機制等方面起到更為深遠的作用。機體衰老是一個多因素多基因參與的復雜過程，人類對衰老過程的了解還知之甚少。已知在衰老信號通路中，daf-2與sirt-2.1是線蟲衰老調控的兩個關鍵蛋白，在物種間相當保守。此外，耶魯大學分子發育生物學和細胞發育生物學系證實miRNA對衰老和死亡的調控作用，miRNA可以阻止細胞過早死亡；參與線蟲發育時序調控的miRNA lin_4也被證實參與調節線蟲的衰老。
發明內容
如本文中所使用的，術語“miR”、“miRNA”、“miCix)RNA”與“微小核糖核酸”具有相
同的含義，其在全文中可互換地使用。因此，本發明的目的是提供一種微小RNA及其反義核苷酸在線蟲壽命調控中的應用。本發明的另一個目的是，提供一種調控線蟲壽命的方法。本發明的又一個目的是，提供一種調節線蟲體內微小RNA表達量的方法。本發明的目的是采用以下技術方案來實現的。一方面，本發明提供一種微小RNA及其反義核苷酸在線蟲壽命調控中的應用，其中所述微小RNA為包含miRNA-45的序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體，所述的miRNA-45 的序列為:序列 1，5' -UGACUAGAGACACAUUCAGCU-3 ’。優選地，所述的微小RNA為miRNA-45。優選地，其中所述微小RNA及其反義核苷酸是通過調控靶基因H)9F7.5的表達而實現對線蟲壽命的調 控。優選地，其中所述微小RNA及其反義核苷酸是通過抑制H)9F7.5蛋白翻譯而調控靶基因R)9F7.5的表達。優選地，其中所述線蟲壽命的調控依賴于sirt-2.1基因的活性。另一方面，本發明提供一種調控線蟲壽命的方法，通過調控線蟲體內的miR-45而實現。優選地，通過在線蟲體內增加miR-45的表達量或加入miRNA類似物而實現延長線蟲的壽命。優選地,通過在線蟲體內缺失突變miR-45或降低miR-45的表達量而實現縮短線蟲的壽命。優選地，所述調控線蟲體內的miR-45是通過以下方法來實現的:1)喂食線蟲含有miR-45編碼序列或其反義核苷酸序列，或miRNA-45類似物編碼序列的載體；或者2)用含有miR-45編碼序列類似物或抑制劑的脂質體混合液浸泡線蟲。又一方面，本發明提供一種調節線蟲體內微小RNA表達量的方法，所述方法包括:I)喂食線蟲能夠表達需要調節的微小RNA序列的載體；或者2)用含需要調節的微小RNA的類似物或抑制劑的脂質體混合液浸泡線蟲。此外，本發明還提供了一種微小RNA在人類壽命調控中的應用，其中所述微小RNA為包含下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體:hsa-miR-134 序列 2 5，-UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG-3，；hsa-miR-708* 序列 3 5’ -CAACUAGACU⑶GAGCUUCUAG-3，。由此可見，本發明主要的發明內容包括以下幾點:I)發現將miRNA編碼序列連接到L4440載體喂食線蟲的方法和miRNA類似物/抑制劑浸泡線蟲的方法，在線蟲體內均能有效過表達或抑制表達miRNA (實時PCR和RNA印跡法結果驗證)。傳統的在線蟲體內過表達或抑制miRNA表達的轉基因注射法費用昂貴，操作復雜；本研究創新運用的方法，方便簡單，實驗成本低，可以大大促進在線蟲整體模型上研究miRNA功能。2)發現miR-45缺失突變、miRNA抑制劑浸泡均導致線蟲壽命縮短，miR-45過表達、miRNA類似物均能是線蟲壽命延長。miR-45缺失突變線蟲平均壽命為14.78天，miRNA抑制劑線蟲平均壽命為15.02天，miR-45過表達平均壽命為20.01天，miRNA類似物平均壽命為19.98天，而野生型平均壽命為17.46天，可見miR-45可以調控線蟲壽命，并且miR-45過表達或抑制表達對線蟲的形態均無影響。注:本申請文件中的壽命數值如無特別說明，單位均為天。3)體外雙熒光素酶活性檢測、實時PCR和蛋白質印跡檢測均證明:miR-45可以調控R)9F7.5的表達。將R)9F7.53’UTR連接到PGL3載體上，伴Iipofectamine共轉染HEK293細胞，發現miR-45可以顯著抑制帶有H)9F7.53’ UTR的PGL3的表達，而不用抑制帶有突變的R)9F7.53’UTR的PGL3表達。實時PCR結果表明，過表達miR-45線蟲R)9F7.5mRNA的水平要比野生型略低，而miR-45抑制表達組的線蟲H)9F7.5mRNA的水平要比野生型略高，但均無顯著差異；這表明miR-45誘導R)9F7.5mRNA的降解不是miR-45調控R)9F7.5表達的主要方式。蛋白質印跡分析顯示過表達miR-45的線蟲R)9F7.5蛋白水平要比野生型高，而miR-45表達抑制的線蟲H)9F7.5蛋白水平要比野生型低，這證明miR-45通過抑制R)9F7.5蛋白翻譯調控H)9F7.5的表達。4)F09F7.5缺失突變及RNAi均能使線蟲壽命延長。H)9F7.5缺失突變線蟲平均壽命為21.1天，F09F7.5RNAi線蟲壽命為20.4天，均比野生型平均壽命長。5) miR-45和R)9F7.5調控線蟲壽命均依賴于sirt_2.1的活性。在miR-45過表達的線蟲體內RNAi sirt-2.1的表達使得線蟲壽命縮短，平均壽命由20.02天縮短至16.25天，與單獨sirt-2.1RNAi的線蟲壽命接近；miR_45缺失突變的線蟲RNAi sirt-2.1的表達對線蟲壽命無影響。F09F7.5缺失突變的線蟲在RNAi sirt-2.1的表達后壽命亦縮短，平均壽命由21.1天縮短至15.92天，與單獨sirt-2.1RNAi的線蟲壽命接近。由上可見miR-45和R)9F7.5調控線蟲壽命均依賴于sirt-2.1的活性。6)miR_45在daf-2缺失突變的背景上過表達不能額外延長線蟲壽命。在daf-2 (-/-)線蟲體內過表達miR-45，線蟲平均壽命為26.12天，與daf-2 (-/-)線蟲平均壽命25.34天接近；在daf-2 (-/-)線蟲體內抑制miR-45的表達，卻使線蟲壽命略微縮短，平均壽命為23.87天。7)通過序列比對，發現miR-45在人種里存在兩個種子區域序列保守的miRNA，分別為 hsa-miR-134 和 has-miR-708*。綜上所述，本發明創新了在線蟲體內過表達和抑制miRNA的方法，并發現miR-45可以調節線蟲壽命。線蟲缺失突變miR-45會使得壽命縮短，平均壽命為15.02±0.54天；在線蟲體內過表達miR-45會使得壽命延長，平均壽命為20.1±0.48天。分子機制研究結果顯示，miR-45是通過調控靶基因H)9F7.5的表達調節線蟲壽命，基因H)9F7.5的表達缺失亦使壽命延長，其平均壽命為21.1 ±0.51天，接近miR-45過表達線蟲的壽命。miR-45過表達及H)9F7.5突變缺失延長線蟲壽命均依賴于sirt-2.1的活性，在miR-45過表達的線蟲體內及H)9F7.5突變缺失的線蟲體內抑制sirt-2.1的表達均使線蟲壽命縮短。miR-45在daf-2缺失突變背景上無額外延長線蟲壽命的能力。0035]可見，本發明研究其它參與調控線蟲衰老的miRNA及相關分子機制，毫無疑問將有助于揭開生物體衰老的神秘面紗，甚至找到干預衰老過程的方法，延長生物體壽命，給社會和人民生活帶來福音；這也必定給miRNA的應用帶來更廣闊的前景。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:圖1A為用載體喂食法在線蟲體內過表達miRNA的實驗流程圖；圖1B為具體的實
驗參數。圖2為實時PCR檢測L4440:miR-45載體喂食和miR-45類似物浸泡方法過表達miR_45 效率。圖3為RNA印跡RNA印跡法檢測L4440:miR-45載體喂食和miR-45類似物浸泡方法過表達miR-45效率。圖4為檢測miR-45過表達、抑制和缺失突變對線蟲形態的影響。在體視顯微鏡下45X觀察線蟲形態和大小，A為野生型線蟲形態，B為miR-45過表達的線蟲形態，C為miR-45類似物浸泡的線蟲形態圖，D為miR-45 (-/-)線蟲形態圖，E為miR-45抑制的線蟲形態圖，圖片顯示miR-45過表達和抑制均未使線蟲形態大小發生改變。圖5為檢測miR-45對線蟲壽命的影響。miR-45過表達使線蟲壽命顯著延長，平均壽命為20.01天；miR-45類似物亦使線蟲壽命延長，平均壽命為19.98天；miR_45缺失突變使線蟲壽命縮短，平均壽命為14.78 ；miR-45抑制劑浸泡亦使線蟲壽命縮短，平均壽命為
15.0天，對照野生型線蟲平均壽命為17.46天，daf-2 (-/-)為daf-2缺失突變型，平均壽命為25.34天。
圖6為HEK293轉染PGL3-F09F7.53’ UTR及miR-45類似物，熒光素酶活力檢測miR-45對R)9F7.5的調控。將PGL3-對照熒光素酶活性劃歸為I，miR-45使得PGL3-F09F7.53’UTR熒光素酶活性降低到0.59，其他陽性對照組活性均接近1，空細胞陰性對照熒光素酶活性為0.08，表明miR-45可顯著抑制帶R)9F7.53’ UTR的PGL3的表達。圖7為實時PCR檢測miR-45對R)9F7.5mRNA水平的影響。miR-45過表達組是通過L4440:miR-45喂食線蟲，miR-45類似物組是通過miR-45類似物浸泡線蟲，miR-45 (-/-)組為miR-45缺失突變線蟲，miR-45抑制劑組是通過miR-45抑制劑抑制線蟲，分別提取RNA進行實時PCR檢測發現，miR-45過表達組和miR-45類似物組線蟲體內H)9F7.5mRNA水平略低于野生型，miR-45 (-/-)組與miR-45抑制劑組線蟲體內H)9F7.5mRNA水平都略高于野生型，但均無顯著差異。圖8為蛋白質印跡檢測miR-45對R)9F7.5蛋白水平的影響。與圖7—樣，miR-45過表達組是通過L4440:miR-45喂食線蟲，miR-45類似物組是通過miR-45類似物浸泡線蟲，miR-45 (-/-)組為miR-45缺失突變線蟲，miR-45抑制劑組是通過miR-45抑制劑抑制線蟲，Western blot檢測發現，miR-45過表達組和miR-45類似物線蟲體內H)9F7.5蛋白水平顯著低于野生型，而miR-45 (-/-)與miR-45抑制劑線蟲體內H)9F7.5蛋白水平顯著高于野生型。圖9為檢測R)9F7.5RNAi的干擾效率。F09F7.5 (-/-)組為R)9F7.5缺失突變型線蟲，F09F7.5RNAi組為R)9F7.5RNA干擾線蟲，實時PCR和western結果均顯示R)9F7.5在F09F7.5 (-/-)和H)9F7.5RNAi線蟲體內表達水平極低。
圖10為檢測R)9F7.5對線蟲壽命的影響。H)9F7.5 (-/-)組為R)9F7.5缺失突變型線蟲，F09F7.5RNAi組為R)9F7.5RNA干擾線蟲，daf-2 (-/-)組為daf-2缺失突變型線蟲，miR-45 (-/-)組為miR-45缺失突變型線蟲，表明H)9F7.5表達抑制延長線蟲壽命至與miR-45 (-/-)接近。圖11為證明miR-45與R)9F7.5對線蟲壽命的調節均依賴于sirt-2.1。在miR-45過表達的線蟲體內RNAi sirt-2.1的表達使得線蟲壽命縮短，與單獨sirt-2.1RNAi的線蟲壽命接近；在miR-45缺失突變的線蟲體內RNAisirt-2.1的表達對線蟲壽命無影響；F09F7.5缺失突變的線蟲在RNAi sirt-2.1的表達后壽命亦縮短，與單獨sirt-2.1RNAi的線蟲壽命接近。圖12為證明miR-45在daf-2突變背景上過表達無額外延長壽命能力。在daf-2-/-)線蟲體內過表達miR-45不能額外延長線蟲壽命,與daf-2 (-/-)線蟲壽命曲線接近；在daf-2-/-)線蟲體內抑制miR-45的表達，卻使線蟲壽命略縮短。圖13為說明在targetscan中R)9F7.5是miR-45的靶基因的圖。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。以下各實施例中使用的主要材料、儀器信息如下:
L4440 載體:購自 addgene,貨號為 Addgene plasmid 1654)PBST-1I載體:購自長沙愛科博生物科技有限公司大腸桿菌0P50:購自中國科學院生物物理研究所。大腸桿菌HTl 15 (DE3):購自中國科學院生物物理研究所。F09F7.5抗體:購自上海優寧維生物科技有限公司雙熒光素梅檢測試劑盒:購自普洛麥格公司，產品編號E1910。體式顯微鏡型號為zeiss, Discovery V20,可購自位于德國的卡爾蔡司公司。生化培養箱:上海樹立儀器廠，型號150C。多功能酶標儀，購自Biotek，型號為SYNERCY 4。本案實施例中涉及的相關引物序列如下:表I實施例中涉及的相關引物序列。
權利要求
1.種微小RNA及其反義核苷酸在線蟲壽命調控中的應用，其中: 所述微小RNA為包含miRNA-45的序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體， 所述的miRNA-45的序列為:序列 1:5’ -UGACUAGAGACACAUUCAGCU-3’ ； 優選地，所述的微小RNA為miRNA-45。
2.據權利要求1所述的應用，其中所述微小RNA及其反義核苷酸是通過調控靶基因F09F7.5的表達而實現對線蟲壽命的調控。
3.據權利要求2所述的應用，其中所述微小RNA及其反義核苷酸是通過抑制F09F7.5蛋白翻譯而調控靶基因H)9F7.5的表達。
4.據權利要求1至3中任一項所述的應用，其中所述線蟲壽命的調控依賴于sirt-2.1基因的活性。
5.種調控線蟲壽命的方法，通過調控線蟲體內的miRNA-45而實現。
6.據權利要求5所述的方法，通過在線蟲體內增加miRNA-45的表達量或加入miRNA類似物而實現延長線蟲的壽命。
7.據權利要求5所述的方法，通過在線蟲體內缺失突變miRNA-45或降低miR-45的表達量而實現縮短線蟲的壽命。
8.據權利要求5至7中任一項所述的方法，所述調控線蟲體內的miR-45是通過以下方法來實現的:1)喂食線蟲能夠表達需要調節的微小RNA序列的載體；或者2)用含需要調節的微小RNA的類似物或抑制劑的脂質體混合液浸泡線蟲。
9.種調節線蟲體內微小RNA表達量的方法，所述方法包括:1)喂食線蟲能夠表達需要調節的微小RNA序列的載體；或者2)用含需要調節的微小RNA的類似物或抑制劑的脂質體混合液浸泡線蟲；優選地需要調節的微小RNA是miRNA-45。
10.種微小RNA在人類壽命調控中的應用,其中所述微小RNA為包含下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體:hsa-miR-134 5， -UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG-3，；hsa-miR-708* 5’ _CAACUAGACUGUGAGCUUCUAG_3’。
全文摘要
本發明提供了miR-45及其反義核苷酸在線蟲壽命調控中的應用，以及調控線蟲壽命的方法和調節線蟲體內微小RNA表達量的方法。本發明提供的調控線蟲壽命的方法是通過調控線蟲體內的miR-45而實現的，通過在線蟲體內增加miR-45的表達量或加入miRNA類似物而實現延長線蟲的壽命，通過在線蟲體內缺失突變miR-45或降低miR-45的表達量而實現縮短線蟲的壽命，miR-45的表達量可通過喂食或浸泡的方法來完成。
文檔編號C12N15/85GK103088021SQ20111033789
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月31日 優先權日2011年10月31日
發明者李培峰, 丁素玲 申請人:中國科學院動物研究所