專利名稱：：一種擬麗突線蟲的培養方法
技術領域：
：本發明涉及生物培養，具體為一種擬麗突線蟲的培養方法。
背景技術：
：線蟲是土壤中最為豐富的無脊推動物，在土壤生態系統腐屑食物網中占有重要地位。線蟲作為食物鏈中的重要成員廣泛存在于土壤中，因其形態特殊性、食物專一性、分離鑒定相對簡單，以及對環境的各種變化能做出較迅速的反應等特點，可將線蟲作為土壤污染毒理效應研究的模式生物，為環境污染評價提供有價值的信息。擬麗突線蟲(Jcra6e/o/cfeswam^)對土壤及水體中重金屬污染具有很好的生物指示作用，采用室內培養該種線蟲可用于污染環境的生物檢測。擬麗突線蟲是一種單性生殖的土壤居住的食細菌線蟲(Laugsch,M.&Schierenberg,E.Differencesinmaternalsupplyandearlydevelopmentofcloselyrelatednematodespecies.InternationalJournalofDevelopmentalBiology,2004,48:655-662)。擬麗突線蟲成蟲體長0.5mm左右。在世界不同地區的土壤中，擬麗突線蟲是線蟲群落的主要組成部分，它占據了大范圍的土壤生活環境，占線蟲群落的20%左右(DeGoede,R.G.M.&Bongers，T.NematodeCommunitiesofNorthernTemperateGrasslandEcosystems.Focus,Giessen,Germany.1998)。擬麗突線蟲以腐生和植物病原細菌為食，通過在土壤中傳播細菌和病毒間接作用于有機質分解(Ikonen,E.K.LifehistorystudiesofthehermaphroditenematodeJcroZ>e/o/<iessp.withPsew(i國owas1cepaciaasafoodsourceonagar.Nematology,2001,3:759-766)。擬麗突線蟲的培養一般釆用在培養基中加入EscherichiacoliOP50品系細菌菌株，此菌株的培養采用的是LB培養基。但由于EscherichiacoliOP50品系細菌菌株的繼代培養和保存較難，而且易染雜菌，同時LB培養基較其他普通的營養基來說，成本較高。因此需要選擇成本相對較低且易培養的菌株和培養基來培養擬麗突線蟲。
發明內容3本發明的目的在于提供一種擬麗突線蟲的培養方法；以大腸桿菌菌株為生長菌，接種培養得到細菌液，細菌液加入到線蟲培養基，挑入擬麗突線蟲，恒溫培養得到純種線蟲。本發明操作簡單，成本低廉，容易實施，解決環境污染的生物檢測問題。為實現上述目的，本發明釆用的技術方案如下一種擬麗突線蟲的培養方法，將大腸桿菌Eco"菌株接入液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，在36.5~37.5。C下165~175次/分鐘搖床振蕩培養23~25小時得到細菌液；然后，將細菌液加入到線蟲培養基，再挑入消過毒的無菌的擬麗突線蟲，置于恒溫恒濕培養箱，在濕度50~60%、溫度20~30°C條件下培養511天，即可得到所培養的線蟲。所述大腸桿菌五.//菌株為普通野生型大腸桿菌，菌株屬于革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5x1~3微米，周身鞭毛，能運動，無芽孢。所述的細菌液是將大腸桿菌菌株用接種環挑取，接入40~60mL液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，每次接種大腸桿菌數量為^107~3><107個，放進具有恒溫功能的搖床，調節搖床溫度36.537.5。C、搖動次數設置為165~175次/分鐘，振蕩培養2325小時，得到細菌液。所述的液體牛肉膏蛋白胨培養基按重量計為牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaCl5g、蒸餾水1000mL,最后用2mol/LNaOH調節pH為6.5~7.5。所述的線蟲培養基按重量計為3gNaCl、17g瓊脂、2.5g蛋白胨，溶于975mL蒸餾水中，120122。C滅菌，29.5-30.5分鐘后分別加入5mg/mL膽固醇貯存液1mL、1mol/LCaCl21mL、1mol/LMgS041mL、pH為5.9-6.1的lmol/L磷酸緩沖液25mL，搖動均勻，即得線蟲培養基。所述的擬麗突線蟲的培養步驟為，取干凈的直徑為6cm的培養皿，將線蟲培養基46mL平鋪在培養皿中，靜置810小時，用微量移液器按細菌液/培養基為1/50的體積比例，將細菌液80~120pL倒入培養皿，靜置3~5分鐘，用接種針挑入無菌擬麗突線蟲10~20條，均句放置在培養基上，蓋上培養皿蓋子；然后，將培養皿置于恒溫恒濕培養箱，在濕度50~60%、203(TC培養511天，即可得到所培養的線蟲。本發明具有如下優點1.本發明擬麗突線蟲的室內培養方法，首先對大腸桿菌￡.//的培養，然后對擬麗突線蟲進行大量培養，最后是對培養后的線蟲進行毒理實驗，確定此線蟲的生物指示作用。本發明操作簡單，成本低廉，容易實施。2.本發明釆用一般的野生型大腸桿菌菌株為生產菌，菌株培養基為普通的牛肉膏蛋白胨培養基。3.本發明中擬麗突線蟲本身容易培養，特別是培養時間較短。4.本發明培養得到的擬麗突線蟲，可作為環境污染生態毒理診斷的一種有效指示生物，解決環境污染的生物檢測問題。具體實施例方式本發明以大腸桿菌E//菌株為生長菌，將大腸桿菌菌株接入液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，在36.537.5'C下165~175次/分鐘搖床振蕩培養23~25小時得到細菌液；然后，將細菌液加入到線蟲培養基，再挑入經無菌消毒的擬麗突線蟲，在濕度50~60%、203(TC培養5~11天，即可收獲所培養的線蟲。具體方法詳述如下1)大腸桿菌獲取本發明選用普通野生型大腸桿菌，菌株屬于革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5xl3微米，周身鞭毛，能運動，無芽孢。大腸桿菌菌株在一般的微生物菌種實驗室即可獲取，也可以從巿場上購買到。2)細菌液的獲取將步驟1)得到的大腸桿菌菌株用接種環挑取，接入40~60mL液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，每次接種大腸桿菌數量為lxl(T3xl(^個，放進具有恒溫功能的搖床，調節搖床溫度36.537.5。C、搖動次數設置為165~175次/分鐘，振蕩培養2325小時，得到細菌液(細菌液中大腸桿菌濃度為lxl()S5xl0S個/mL)。備用。所述的液體牛肉膏蛋白胨培養基按重量計為牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaCl5g、蒸餾水1000mL，最后用2mol/L的NaOH調節pH為6.5~7.5。3)線蟲培養基的制備取1000mL實驗用三角瓶，加入975mL蒸餾水、3gNaCl、17g瓊脂、2.5g蛋白胨，用玻璃棒攪拌均勻，置入滅菌鍋內，在120~122。C和常壓條件下，滅菌29.5~30.5分鐘后，加入5g/L的膽固醇貯存液lmL、lmol/LCaCl2lmL、lmol/LMgS04lmL、pH為5.9—6.1的1mol/L磷酸緩沖液25mL,搖動均勻，即得線蟲培養基。4)擬麗突線蟲的獲取和表面消毒土壤線蟲用改進的貝曼漏斗法分離提取，就是把土壤樣品放在鋪有2層面巾紙或紗布的小篩盤中，然后把小篩盤放入裝滿水的漏斗中，24小時后，用小培養皿或試管接在乳膠管下，松開止水夾，收集線蟲懸浮液。然后在解剖鏡下根據線蟲的形態結構挑取擬麗突線蟲，將其轉入滅菌的離心管中，用消毒液處理20分鐘，3000轉/分鐘離心5分鐘，除去上清夜，再用無菌水反復清洗5次。每次清洗時充分震蕩，3000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液。消毒劑用重量百分比為0.1%的硫酸鏈霉素和重量百分比為0.002%的放線菌酮的混合液(李輝信，陳小云，胡鋒.土壤食細菌線蟲的分離和富集培養方法.南京農業大學學報,2002，25(2):71-74)。5)擬麗突線蟲的培養取干凈的直徑為6cm的培養皿，將步驟3)得到的線蟲培養基4~6mL平鋪在培養皿中，靜置8~10小時，用微量移液器按細菌液/培養基為1/50的體積比例，將步驟2)得到的細菌液80-120^L倒入培養皿，靜置3-5分鐘，用接種針挑入步驟4)得到的無菌擬麗突線蟲1020條，均勻放置在培養基上，蓋上培養皿蓋子。上述操作步驟均在無菌超凈工作臺上進行。然后將培養皿置于恒溫恒濕培養箱，在濕度50~60%、溫度203(TC培養511天，即可得到所培養的線蟲。所述牛肉膏為巿售產品。是用新鮮牛肉經過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而得到的一種棕黃色的膏狀物，含有肌酸、肌酸肝、氨基酸類、礦物質類及維生素的水溶性物質。所述蛋白胨為巿售產品。是用新鮮牛骨及牛肉混合提取，經過消化、過濾、濃縮、噴霧干燥而得到的一種淺黃色至類白色的干燥粉末。易溶于水，水溶液呈淡黃色。所述NaCl為實驗室用分析純NaCl。所述2mol/L的NaOH的制備取100mL燒杯，加入8g實驗室用分析純NaOH,加入50mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌，使之充分溶解，溶液轉移到100mL容量瓶，每次用68mL蒸餾水清洗燒杯45次，清洗液轉移到容量瓶，最后定容至100mL,搖動均勻。備用。所述搖床為具有溫度控制功能裝置的實驗用搖床，如東聯電子技術開發有限公司產的HZQ-R型搖床。所述瓊脂為巿售產品，是從石花菜、江蘺等紅藻植物提制的多糖。其主要成分為多聚半乳糖的硫酸脂。制成的商品有的為條狀，有的為粉狀。瓊脂的最有用特性是它的凝點和熔點之間的溫度相差很大。它在水中需加熱至95'C時才開始熔化，熔化后的溶液溫度需降到4(TC時才開始凝固，所以它是配制固體培養基的最好凝固劑。所述膽固醇貯存液制備取1000mL實驗用容量瓶，加入800900mL乙醇，將5g膽固醇溶入乙醇中，搖動容量瓶使膽固醇溶解，用乙醇定容至1000mL,搖動均勻。備用。所述lmol/LCaCl2的制備取lOOOmL實驗用容量瓶，加入800~900mL蒸餾水，稱量lllg分析純無水CaCl2,搖動容量瓶使CaCV溶解，用蒸餾水定容至1000mL，搖動均勻。備用。所述的1mol/LMgS04備取1000mL實驗用容量瓶，加入800~900mL蒸餾水，稱量120g分析純無水MgS04,搖動容量瓶使MgS04溶解，用蒸餾水定容至1000mL,搖動均勾。備用。所述lmol/L磷酸緩沖液的制備取1000mL實驗用容量瓶，加入800~900mL蒸餾水，加入136g分析純KH2P04,搖動容量瓶使KH2P04溶解，用蒸餾水定容至1000mL，搖動均勻。備用。所述0.1%的硫酸鏈霉素和0.002%的放線菌酮混合液制備取100mL實驗用容量瓶，加入80~90mL蒸餾水，加入10g(精確到O.Olg)醫用白色粉末狀硫酸鏈霉素，搖動容量瓶使硫酸鏈霉素溶解，用蒸餾水定容至100mL,搖動均勻。得重量比為10%硫酸鏈霉素。取100mL實驗用容量瓶，加入8090mL蒸餾水，加入0.5g(精確到O.OOlg)放線菌酮，搖動容量瓶使放線菌酮溶解，用蒸餾水定容至100mL，搖動均勻，配制成重量比為0.5%放線菌酮溶液。取1000mL容量瓶，加入800900mL蒸餾水，加入重量比為10%硫酸鏈霉素溶液10mL、重量比為0.5%放線菌酮溶液4mL,用蒸餾水定容至1000mL,搖動均勻，得重量比為0.1%的硫酸鏈霉素和重量比為0.002%的放線菌酮混合液。所述放線菌酮化學名稱為3-[2-(3,5-二甲基-2-氧代環己基)-2-羧基乙基]戊二酰胺，分子式C15H23N04,分子量281.35。所述微量移液器范圍為100~500|iL,如上海求精生化試劑儀器有限公司生產的100500nL微量移液器。所述的擬麗突線蟲的培養步驟中，放入培養箱前的各搡作步驟需要在無菌工作臺上進行，所述的無菌工作臺為實驗室進行微生物實驗所用的常規無菌超凈工作臺。實施例1:細菌液制備:用接種環挑取大腸桿菌菌株接入50mL液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，所釆用接種環直徑為2.5mm,每次接種大腸桿菌數量為2><107個，在37。C下170轉/分鐘搖床振蕩培養24小時得到細菌液(細菌液中大腸桿菌濃度為3xl()S個/mL),備用。培養基配方為牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaC15g、蒸餾水1000ml，最后調節pH為7。7擬麗突線蟲的培養取18個干凈的直徑為6cm的培養皿，將步驟3)得到的線蟲培養基5mL平鋪在培養皿中，靜置10小時，按細菌液/培養基為1/50的體積比例，將上述得到的細菌液100pL倒入培養皿，靜置5分鐘，在每6個培養皿中分別用接種針挑入步驟4)得到的無菌擬麗突線蟲10條、15條和20條，均勻放置在培養基上，蓋上培養皿蓋子。上述操作步驟均在無菌工作臺上進行。然后將培養皿置于恒溫恒濕培養箱，在濕度50%、20°C培養11天，即可得到所培養的線蟲。實施例2細菌液制備:用接種環挑取大腸桿菌菌株接入40mL液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，所釆用接種環直徑為2.5mm,每次接種大腸桿菌數量為1><107個，在36.5t:下175轉/分鐘搖床振蕩培養25小時得到細菌液(細菌液中大腸桿菌濃度為lxl()S個/mL),備用。培養基配方為牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaC15g、蒸餾水1000ml，最后調節pH為6.5。擬麗突線蟲的培養取18個干凈的直徑為6cm的培養皿，將步驟3)得到的線蟲培養基4mL平鋪在培養皿中，靜置8小時，按細菌液/培養基為1/50的體積比例，將上述得到的細菌液80|iL倒入培養皿，靜置3分鐘，在每6個培養皿中分別用接種針挑入步驟4)得到的無菌擬麗突線蟲10條、15條和20條，均勻放置在培養基上，蓋上培養皿蓋子。上述操作步驟均在無菌工作臺上進行。然后將培養皿置于恒溫恒濕培養箱，濕度55%、21°C培養10天，即可得到所培養的線蟲。實施例3細菌液制備:用接種環挑取大腸桿菌菌株接入60mL液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，所釆用接種環直徑為2.5mm，每次接種大腸桿菌數量為3><107個，在37.5'C下165轉/分鐘搖床振蕩培養23小時得到細菌液(細菌液中大腸桿菌濃度為5xl()S個/mL),備用。培養基配方為牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaC15g、蒸餾水1000ml,最后調節pH為7.5。擬麗突線蟲的培養取18個干凈的直徑為6cm的培養皿，將步驟3)得到的線蟲培養基6mL平鋪在培養皿中，靜置9小時，按細菌液/培養基為1/50的體積比例，將上述得到的細菌液120nL倒入培養皿，靜置4分鐘，在每6個培養皿中分別用接種針挑入步驟4)得到的無菌擬麗突線蟲10條、15條和20條，均勻放置在培養基上，蓋上培養皿蓋子。上述操作步驟均在無菌工作臺上進行。然后將培養皿置于恒溫恒濕培養箱，濕度60%、22°C8培養10天，即可得到所培養的線蟲。實施例4~11:具體實施方式同實施例1，不同之處在于線蟲培養溫濕度和培養時間有所差別(見表1)。表1編號培養濕度(％)培養溫度(°c)培養時間(天)45123952249653258754268856279572810582961159305應用例1:本應用例釆用實施例1(20。C)的培養方法，培養后得到線蟲數量如表2(表中數據為取lcn^平面，觀測線蟲數量，根據培養皿面積，以觀測數據乘以25得到，下同)。表2加入IO條線蟲加入15條線蟲加入20條線蟲培養皿1310034002600培養皿2217538253425培養皿3232523501950培養皿4290032753025培養皿5267528752725培養皿6197516003100平均252528882804根據表2結果，培養前加入擬麗突線蟲IO條、15條和20條處理，經11天培養后平均分別達到2525條、2888條和2804條。9應用例2:本應用例釆用實施例6(25t:)的培養方法，培養后得到線蟲數量如表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>根據表3結果，培養前加入擬麗突線蟲10條、15條和20條處理，經5天培養后平均分別達到3604條、3738條和3954條。應用例3:本應用例采用實施例11(3(TC)的培養方法，培養后得到的線蟲數量如表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>根據表4結果，培養前加入擬麗突線蟲10條、15條和20條處理，經5天培養后平均分別達到3725條、3592條和3654條。權利要求1.一種擬麗突線蟲的培養方法，其特征在于將大腸桿菌E.coli菌株接入液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，在36.5～37.5℃下165～175次/分鐘搖床振蕩培養23～25小時得到細菌液；然后，將細菌液加入到線蟲培養基，再挑入消過毒的無菌的擬麗突線蟲，置于恒溫恒濕培養箱，在濕度50～60％、溫度20～30℃條件下培養5～11天，即可得到所培養的線蟲。2.根據權利要求l所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特征在于所述大腸桿菌五."http://菌株為普通野生型大腸桿菌，菌株屬于革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5xl3微米，周身鞭毛，能運動，無芽孢。3.根據權利要求l所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特征在于所述的細菌液是將大腸桿菌菌株用接種環挑取，接入4060mL液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，每次接種大腸桿菌數量為1"07~3><107個，放進具有恒溫功能的搖床，調節搖床溫度36.537.5"C、搖動次數設置為165-175次/分鐘，振蕩培養2325小時，得到細菌液。4.根據權利要求l所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特征在于所述的液體牛肉膏蛋白胨培養基按重量計為牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaCl5g、蒸餾水1000mL,最后用2mol/LNaOH調節pH為6.5~7.5。5.根據權利要求l所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特征在于所述的線蟲培養基按重量計為3gNaCl、17g瓊脂、2.5g蛋白胨，溶于975mL蒸餾水中，120122。C滅菌，29.5-30.5分鐘后分別加入5mg/mL膽固醇貯存液1mL、1mol/LCaCl21mL、1mol/LMgS041mL、pH為5.9~6.1的lmol/L磷酸緩沖液25mL,搖動均勾，即得線蟲培養基。6.根據權利要求1所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特征在于所述的擬麗突線蟲的培養步驟為，取干凈的直徑為6cm的培養皿，將線蟲培養基46mL平鋪在培養皿中，靜置810小時，用微量移液器按細菌液/培養基為1/50的體積比例，將細菌液8012(HiL倒入培養皿，靜置35分鐘，用接種針挑入無菌擬麗突線蟲10~20條，均勻放置在培養基上，蓋上培養皿蓋子；然后，將培養皿置于恒溫恒濕培養箱，在濕度50~60%、20~3(TC培養511天，即可得到所培養的線蟲。全文摘要本發明涉及生物培養，具體為一種擬麗突線蟲的培養方法。培養步驟為以大腸桿菌E.coli菌株為生長菌，將大腸桿菌菌株接入液體的牛肉膏蛋白胨培養基上，在36.5～37.5℃下165～175次/分鐘搖床振蕩培養23～25小時得到細菌液，然后將細菌液加入到線蟲培養基，再挑入經無菌消毒的擬麗突線蟲(Acrobeloidesnanus)，置于恒溫恒濕培養箱，在濕度50～60％、溫度20～30℃條件下培養5～11天，即可得到所培養的線蟲。本發明操作簡單，成本低廉，容易實施；本發明培養得到的擬麗突線蟲，可作為環境污染生態毒理診斷的一種有效指示生物，解決環境污染的生物檢測問題。文檔編號A01K67/00GK101485300SQ20081001016公開日2009年7月22日申請日期2008年1月18日優先權日2008年1月18日發明者勇姜,琪李,梁文舉,偉郝申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所