專利名稱：生產還原型谷胱甘肽的重組菌株及其制備方法
技術領域：
本發明涉及微生物生物技術領域，涉及發酵產谷胱甘肽的微生物及其制備方法。
背景技術：
谷胱甘肽(GSH)是生物體內一種重要的非蛋白巰基化合物，在醫學和化妝品，食品加工，蛋白純化等領域有著廣泛的應用[Sies H. (1999)Free Rad Biol Med. 27，916-921 ； Henry Jay Forman et, al, (2009)Molecular Aspects of Medicine 30,1-12;鄭云朗 (1995)生物學通報 30，22-24 ；Castro, VM. et, al (1993), Biochem J 292,371-377]。自上世紀70年代日本協和公司(Kyowa Hakko Kogyo Co.)使用發酵法生產谷胱甘肽工業化以后，發酵法生產GSH就成為其工業生產研究的主要方法[Sakato，K. and Tanaka H. 1992，Biotechnol. Bioeng. 40，904-912]。為此，上世紀七十年代后，各國開始對生物法合成GSH進行了大量研究，發表了大量文章和申請并公布了一系列相關專利 [Kimura A. (1986)Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. ,33,1-51, Nanjo, H. , Yamashita, K., et.，al (1986)公開特許公報 61-52299 ；Tezuka, H.，Otake，Y.，Yabushi，et.，al (1987)公開特許公報 62-275685 ；Christine, L.，Ulf, S. (1989) Eur. Pat. Appl. EP 300168 ；王紹校， (2005).中國學位論文全文數據庫；饒志明等O007).應用與環境生物學報，13 :257-260; 饒志明等(2007)，食品與發酵工業.33 1-4 ；蔡宇杰等，食品與機械，23，16-19 ；US Patent 6902912 ；US Patent 4598046 ；US Patent 4582801 ；JP19890032584 ；W02004/003217A1 ； EP1539982 ；US Patent 20050239164 ；CN200810019761. 6] 其中，發酵菌株的選育主要集中在酵母(如 Saccharomyces cervisiae、Pichia pastoris、Candida utilis)禾口大腸桿菌等微生物，通常的方法是在育種中利用基因重組技術使微生物細胞表達GSH相關合成相關基因谷氨酰半胱氨酸合成酶gshl和谷胱甘肽合成酶gsh2基因，打破轉錄調控，使細胞內 GSH合成酶活增加，從而提高GSH產量。谷胱甘肽作為細胞內重要的多功能因子，其合成與調控等機理復雜。Alfafara等人研究表明，胞內半胱氨酸的濃度是GSH合成產量的限制因素 [Alfafara et, al. 1992，Appl. microbiol. biotechol. 36，358-540]。發酵添加半胱氨酸直接提高 GSH 的產量[Wen，S. et, al. 2004，Enzyme Microbial, tech. 35，501-507]。GSH 的生產中如果增加細胞內的半胱氨酸相對含量、就可以減少外源半胱氨酸添加量，提高半胱氨酸轉化率，生產成本將會大大降低。
發明內容
本發明首先提供一種生產谷胱甘肽的重組菌株。本發明還提供所述重組菌株的制備方法。本發明還提供所述重組菌株在發酵生產谷胱甘肽中的應用。本發明提供的生產谷胱甘肽的重組菌株，其谷胱甘肽合成轉錄調控失調，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循環途徑上的基因被失活或敲除。
3
本發明中谷胱甘肽合成轉錄調控失調，可以采用組成型或誘導型啟動子表達谷胱甘肽相關合成酶，也可以表達谷胱甘肽相關合成酶正調控蛋白。谷胱甘肽相關合成酶可以選擇來源各種生物的谷氨酰半胱氨酸合成酶gshl或突變體和谷胱甘肽合成酶gsh2或突變體，如酵母、大腸桿菌、高等動植物等，也可以選擇雙功能酶gshF或其突變體，如多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida)的gshF基因。本發明中谷胱甘肽合成轉錄調控失調，也可以表達谷胱甘肽相關合成酶基因轉錄正調節蛋白(如Yaplp、Met4)啟動谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶基因轉錄。 優選的，所述的重組菌選擇真菌，特別是酵母菌，在本發明中最優選為畢赤酵母。在本發明重組菌株的一個優選實施方案中，其內源的半胱氨酸向高半胱氨酸循環途徑上的基因和/或被失活或敲除，更優選的，Str3基因被失活。本發明提供的所述重組菌株的制備方法，以畢赤酵母為出發菌株為例，表達來源于大腸桿菌gshl和gsh2并且基因失活為例，包括如下步驟1)將大腸桿菌gshl和gsh2的表達盒轉化到畢赤酵母中，獲得表達大腸桿菌gshl 和gsh2基因的畢赤酵母。2)將步驟1)獲得的畢赤酵母通過同源重組失活內源的基因，從而獲得表達谷胱甘肽合成失調，半胱氨酸向高半胱氨酸的循環途徑被切斷的新菌株。本發明中基因表達可以采用商業化表達系統，也可以采用改造表達系統；表達載體可以選擇游離質粒，也可以選擇整合基因組。本發明中基因表達啟動子可以選擇誘導型啟動子，也可以選擇組成型啟動子或其突變體，以酵母菌為出發菌株優選為GAP，YPT1，PGK， ADHl，TEF, HXK2等啟動子中的幾種或一種。在本發明中菌株的相關基因突變或修飾可以通過同源重組-反篩選基因修飾技術，也可以轉座技術來構建多基因突變或修飾。本發明的微生物菌株用于本領域已知的方法在發酵罐內制備谷胱甘肽。舉例言之，所用的碳源可以是葡萄糖、淀粉糖、糖蜜或其他糖類，而所用氮源可以是銨或蛋白水解物。舉例言之，所用的硫源可以是硫酸鹽和含硫氨基酸等。在本發明發現，表達gshl和gsh2基因的重組菌株，在添加外源半胱氨酸的情況下合成谷胱甘肽，雖然可以達到一定產量，但是存在半胱氨酸轉化效率低下。當切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環，在添加外源半胱氨酸的情況下合成谷胱甘肽，同表達gshl和gsh2基因的對照菌株相比達到相同產量時，可以大大提高外源半胱氨酸轉化效率和縮短發酵時間。使用本發明的方法構建的微生物菌株發酵培養，其谷胱甘肽的產量顯著高于目前報道的谷胱甘肽發酵生產的最高水平，提高了原料利用效率，降低了生產成本，可用于工業化生產。
圖1為ρ Pic G1G2的質粒圖譜。圖2所示為失活切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環。圖3所示為str3基因失活突變過程示意圖。圖4所示為切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環途徑對發酵生產GSH的影響。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在下實施例中未注明的具體的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗手冊》、《pichia protocols》(Humana Press)中所說的方法或廠商提供的方案進行。本發明實施例中，畢赤酵母表達系統(包括=Pichia pastoris X33、pPIC3. 5K、 pGAPZB、pGAPZC 等)、合成引物等購于 invitrogen 公司，其中 Pichia pastoris X33 為出發菌株。KOD聚合酶、PCR純化試劑盒、膠回收純化試劑盒、DNA抽提試劑盒、堿性磷酸酶、 部分限制性內切酶、DH5ci、G418、ZeCOin、氨芐等購于上海悅克生物科技有限公司；Taq酶、 T4連接酶、部分限制性內切酶、質粒PMDT-18、質粒PUC18購于Takara公司；同源重組-反篩選系統質粒PPicZ mazF(A0Xl-mazF-Zeocin，圖3)是本實驗室參照文獻[Yunjie Y. et， al. 2009，TEMS Yeast Res. 9，600-609]方法構建。試劑除特殊要求外，均為國產試劑。電轉參照pichia expression Kit手冊中提供方法進行。實施例1谷胱甘肽合成轉錄調控失調菌株X33 (gshl, gsh2)的構建1)引物gshl-Ι tgaaGGTACCTTGATCCCGGACGTATCACAGGC(SEQ ID No. 1)gsh 1-2 :atgaTCTAGAATCAGGCGTGTTTTTCCAGCCAC(SEQ ID No. 2)gsh2-l :atcaGAATTCATGATCAAGCTCGGCATCGTGA(SEQ ID No. 3)gsh 2-2 :attaCTCGAGTTACTGCTGCTGTAAACGTGCTTC xhol(SEQ ID No. 4)GAPG1G2-1 CGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAAC (SEQ ID No. 5)GAPG1G2-2 :GTAACCATGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGGTGT(SEQ ID No. 6)2)方法本實施例采用組成型啟動子GAP表達來源大腸桿菌的gshl和gsh2基因來解除GSH轉錄調控。具體方法如下用引物gshl-Ι和gsh 1-2PCR擴增大腸桿菌Dffia的gsh 1基因(EcoGene登錄號 EG10418)，經過Kpn I、Xba I雙酶切后連接相同酶切的質粒pGAPZB，得到pGAPGl ；用引物gsh2_l和gsh 2-2PCR擴增大腸桿菌Dffia的gsh 2基因(EcoGene登錄號 EG10419) J^lEcoR I、Xho I雙酶切后連接相同酶切的質粒pGAPZB，得到pGAPG2。pGAPG2 用Bgl II, BamH I雙酶切后連接到BamH I酶切并經過堿性磷酸酶處理的pGAPGl，得到 PGAPG1G2。以 pGAPGlG2 為模板，GAPG1G2-1 和 GAPG1G2-2 為引物的 PCR產物經 Bgl II,Nco I 酶切連接到Nco I/BamH I酶切的pPIC3.阢得到質粒pPicGlG2 (圖1)。pPicGlG2經過&ic I酶切線性化后電轉Pichia pastoris X33，G418平板篩選得菌株X33 (gshl，gsh2)。挑取陽性克隆菌落，搖瓶發酵培養保種。將其陽性克隆菌株命名為ZX067。實施例2切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環
切斷半胱氨酉髮向高半胱氨酸循環示意圖如圖2所示。
1)引物
Pst3-1-1:5，TACCAGCAGCAACAGTATGAATGAGATCTC(SEQ ID No. 7)
Pst3-l-2:5，GCGTTCCCGCTCAATAATTACTC(1653-1675)(SEQ ID No. 8)
Pst3-3-l:5，GTCCTGCCTAAACGTTGCAGTC(2724-2745)(SEQ ID No. 9)
Pst3-3-2:5，actactgcaGGGGCATCACAGCTCCCTTCTTG(SEQ ID No. 10)
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Pst3-l-3-l-3，GACTGCAACGTTTAGGCAGGACGCGTTCCCGCTCAATAATTACTCTGAT(SEQ ID No. 11)str3-l-r :TGCCCAGTTCCACCCTTTCC (SEQ ID No. 12)P5AOX-1 :AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTG(SEQ ID No. 13)Pzeo-2 :TGGCCTTTTGCTCACATGTTGGTCTCC(SEQ ID No. 14)2)方法(如圖3，基因突變經過a、b、c、d四個步驟)①Str3 基因克隆(GeneID :8199046 ；NCBI)X33基因組為模板，Pst3-l_l和為引物的PCR產物用Bgl Il.Pst I酶切后，經膠回收試劑盒回收產物連接到BamH I.Pst I酶切的pUC18得pUCstr3。②基因突變體反篩選盒(圖3a)將以pPicZ mazF為模板，以P5Aox_l和Pzeo-2為引物的PCR產物 AOXl-mazF-Zeocin反篩選盒插入經SnaBI酶切并經過堿性磷酸酯酶處理后的質粒pUCstr3 中得質粒 pUCstr3: (AOXl-mazF-Zeocin)。③基因體外突變構建(圖北)以pUCstr3為模板，以和Pst3_l_2為引物擴增得到PCR產物I3StS-I ；以pUCstr3為模板，以和Pst3_3_2為引物擴增得到PCR產物；以I3StS-I為模板，以I3StS-I-I和Ι^ 3-1-3-1-3，為引物擴增得到PCR產物 I^t3-l-3-5’，其3’端帶有I^t3-3的部分5’堿基序列；以 Pst3-l-3_5，和 Pst3_3 為模板，以 Pst3_l_l 和 Pst3_3_2 為引物擴增得到 PCR 產物I^t3-l-3，其為去除部分堿基序列的基因的Δ str3 (SEQ ID No. 15)④基因突變(圖3c和d)以 pUCstr3: (AOXl-mazF-Zeocin)為模板，以 str3-l_l，和 Pst3_3_2 為引物擴增得到 PCR 產物 str3: (AOXl-mazF-Zeocin)。將上述 str3: (AOXl-mazF-Zeocin) PCR產物電轉X33(gshl，gsh2)經hoc in篩選陽性克隆菌落得X33(gshl，gsh2， str3: (AOXl-mazF-kocin))。將 PCR 產物 Pst3_l_3 (SEQ ID No. 15)電轉導入 X33 (gshl， gsh2, str3:: (AOXl-mazF-Zeocin))，在含甲醇為唯一碳源的培養基篩選陽性克隆菌落得 X33(gshl,gsh2, Δ str3) 0挑取陽性克隆菌落，搖瓶發酵培養保種，將其陽性克隆菌株命名為 ZX068。實施例3制備發酵生產GSH培養基1)發酵生產GSH搖瓶種子培養基采用YPD培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。2)搖瓶培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨 5g/L，酵母膏 5g/L，KH2PO4 2. 82g/L，K2HPO4 9. 12g/L，MgSO4 lg/L，(MM)2SO4 2g/L，Nacl 0. 2g/L, Cacl 0. 2g/L, FeS047H20 0. lg/L，生物素 0. 4mg/l，泛酸鈣 0.8mg/l，肌醇 ％ig/l，煙酸 0.8mg/l，對甲苯磺酸 0.%ig/l，V B6 0. 6mg/l,V B2 0. 4mg/ 1，硫胺素 0. 6mg/l，硼酸 lmg/1，CuSO4 0. 6mg/l，KI 0. 2mg/l, MnSO4 0. 8mg/l, Na2MoO4 0. 4mg/l, ZnSO4 0.8mg/lo3)發酵罐發酵生產GSH培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏 10g/L，KH2PO4 30g/L，MgSO4 2g/L，(NH4)2SO4
65g/L，NaCl 0. 4g/L，CaCl 0. 5g/L，FeS047H20 0. 2g/L，生物素 0. 8mg/l，泛酸 丐 1. 6mg/l，肌醇 8mg/l，煙酸 1.6mg/l，對甲苯磺酸 0.8mg/l，VB6 1.6mg/l,VB2 0.8mg/l，硫胺素 1.6mg/l, 硼酸 2mg/l, CuSO4 1. 6mg/l, KI 0. 4mg/l, MnSO4 1. 6mg/l, Na2MoO4 0. 8mg/l, ZnSO4 1. 6mg/ 1，聚醚泡敵少許。4)流加培養基1 葡萄糖700g/L，酵母膏40g/L。5)流加培養基2 =L-半胱氨酸鹽酸鹽120g/L。實施例4胞內還原型谷胱甘肽的含量檢測1)待測樣品的制備胞內谷胱甘肽的含量采用以下方法處理取一定量的發酵液離心，去上清，加一定倍數稀釋，沸水5分鐘后冷卻，12000g離心20分鐘后上清液過濾，過濾液待上樣。2)色譜檢測色譜條件色譜柱C18 (4. 6X250mm)，磷酸鹽溶液(取磷酸二氫鉀6. 8克，庚烷磺酸鈉2.2克，加水溶解使成1000ml，用磷酸調節pH值至3.0)-甲醇(97 3體積比)流速 lml/min，檢測波長210nm。進樣量為20微升。以還原型谷胱甘肽純品為標準制備標準曲線，根據檢測樣品峰面積計算待測樣品谷胱甘肽含量。實施例5切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環對搖瓶發酵生產GSH的影響選取X33、ZX067、ZX068菌株，經搖瓶種子培養基YPD中，30°C、280rpm培養M小時后，按照10% (ν/ν)接種量接種到50ml搖瓶培養基中Q50ml三角瓶)，30°C、280rpm培養。 分別于24小時、36小時、48小時每次補加“流加培養基1”0· 8ml和“流加培養基2”0· 8ml, 并與36小時、48小時、60小時取樣檢測培養液中還原性谷胱甘肽GSH的含量。檢測結果如表1所示表1 GSH的搖瓶產量(g/L)
菌株基因型發酵時間36 h48 h60 hX33野生型0.050.090.02ZX067X33 (gshl,gsh2)0.230.450.42ZX068X33 ( gshl,gsh2,Astr3 )0.390.590.76從表1中可以看出，僅切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環，在相同條件下，與沒有切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環菌株相比，大大提高了底物轉化效率以及縮短發酵時間。實施例6切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環對發酵生產GSH的影響采用實施例3發酵培養基，選取ZX067、ZX068菌株，經搖瓶種子培養基YPD中， 30°C、280rpm培養M小時后，按照10% (ν/ν)接種量接種到15L發酵培養基中(30L發酵罐)，30°C發酵，流加氨水控制pH7. 0，調節轉速、溫度、罐壓、通風量等控制溶氧D030%。發酵過程流加“流加培養基1”，控制葡萄糖含量為20-30g/L，以滿足細胞生長。待細胞生長到0D6(i(i150時，開始添加“流加培養基2”，繼續發酵至GSH含量不積累為止(50-70小時)。 發酵自開始添加“流加培養基2”每4時取樣檢測培養液中GSH產量，結果如圖4，發酵產量 ZX068菌株同ZX067相比，發酵產量大大提高，超過歷史報道水平7g/L ；同時半胱氨酸轉化
7生產谷胱甘肽的轉化率(摩爾)也由52-60%提高75-83%。 在本發明的實施例中，所用的菌株、啟動子等僅用作說明之用，不能用來限制本發明。對于本領域技術人員而言，可對微生物，谷胱甘肽相關合成酶或突變體、啟動子或突變體用來同本實施例結果進行比較優化(對發酵生產谷胱甘肽的產量影響)，這種優化是顯而易見的。因此，選擇實施例以外的其他微生物、其他谷胱甘肽相關合成酶或突變體、啟動子或突變體以及切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環的其他基因同樣適用本發明范圍。
權利要求
1.一種產谷胱甘肽重組菌株，其特征在于，其谷胱甘肽合成轉錄調控失調，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循環途徑上的基因被失活或敲除。
2.根據權利要求1所述的重組菌株，其特征在于，采用組成型或誘導型啟動子表達谷胱甘肽相關合成酶基因gshl和gsh2基因或表達谷胱甘肽雙功能合成酶gshF基因，使谷胱甘肽合成轉錄調控失調。
3.根據權利要求1所述的重組菌株，其特征在于，內源的半胱氨酸向高半胱氨酸循環途徑上的基因失活或敲除。
4.根據權利要求1 3任一項所述的重組菌株，其為真菌。
5.根據權利要求4所述的重組菌株，其為酵母菌。
6.根據權利要求5所述的重組菌株，其為畢赤酵母。
7.制備權利要求1 6任一項所述的重組菌株的方法，其包括如下步驟1)將大腸桿菌gshl和gsh2的表達盒轉化到畢赤酵母中，獲得表達大腸桿菌gshl和 gsh2基因的畢赤酵母。2)將步驟1)獲得的畢赤酵母通過同源重組-反篩選基因修飾技術失活內源基因，從而獲得表達谷胱甘肽合成失調，半胱氨酸向高半胱氨酸的循環途徑被切斷的新菌株。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，表達大腸桿菌gshl和gsh2的啟動子為GAP、 YPTl、PGK、ADHl、TEF、HXK2 中的一種或一種以上。
9.權利要求1 6任一項所述的重組菌株在發酵生產谷胱甘肽中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種產谷胱甘肽重組菌株，其谷胱甘肽合成轉錄調控失調，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循環途徑上的基因被失活或敲除。本發明提供的菌株切斷了半胱氨酸向高半胱氨酸循環，在添加外源半胱氨酸的情況下合成谷胱甘肽，同表達gsh1和gsh2基因的對照菌株相比達到相同產量時，可以大大提高外源半胱氨酸轉化效率和縮短發酵時間。
文檔編號C12R1/84GK102433265SQ20111034387
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者許善峰 申請人:鎮江市德爾生物制品研究所有限公司