一株高產單萜香葉醇的重組釀酒酵母菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株高產單萜香葉醇的重組釀酒酵母菌株及其應用，屬于微生物技術 領域。
【背景技術】
[0002] 萜類化合物（又稱異戊二烯類化合物）是自然界中廣泛存在的一類具有巨大應用 價值的天然化合物，主要包括單萜類、倍半萜類、雙萜類、多萜類等。萜類化合物可作為香 料、生物燃料、藥物、色素等，具有廣闊的應用前景。例如，單萜類香葉醇、檸檬烯可用作香 料，薇稀的二聚物可作為航空燃料；倍半砲類amorphadiene和青蒿酸為重要的抗皰疾藥物 青蒿素的前體，甜沒藥烯、法呢烯衍生物可作為生物燃料替代柴油及航空燃油；雙萜類紫杉 醇是一種有效的抗癌藥物；多萜類人參皂苷以及各種類胡蘿卜素等都是重要的生物活性物 質。萜類化合物種類繁多，結構復雜，化學合成困難，目前主要從天然植物中直接提取，這不 僅造成植物資源的浪費，而且分離純化產率很低。隨著生物合成技術的不斷發展，通過改造 微生物細胞，使之成為能利用利用廉價的底物高效合成萜類化合物的細胞工廠，可以大大 降低生產成本，具有廣泛的應用前景。其中，香葉醇為一種重要的單萜，是玫瑰精油的主要 成分，除了被廣泛用做香料，調味品之外，還可被用作抗菌劑和合成多種抗癌單萜類生物堿 的前體。
[0003] 異戊烯基焦磷酸（isopentenyldiphosphate，IPP)是合成砲類化合物的最關 鍵的前體，可以由自然界中兩條獨立的生物合成途徑合成。一條是甲羥戊酸途徑（MVA pathway)，存在于古細菌、少數細菌以及大多數真核生物中；另一條是2-甲基赤蘚醇-4-磷 酸途徑（MEPpathway)，存在于大多數細菌以及藍藻中。綠色植物中同時存在這兩條途徑。 目前，通過改造微生物細胞中內源的MEP或者MVA途徑過量合成萜類化合物的前體，同時引 入異源的萜類合成途徑，實現了多種萜類化合物的微生物合成，主要以倍半萜合成為主。
[0004] 釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)作為真核模式生物，具有生長速度快、抑 制物耐受性高，優良的工業生產特性以及成熟的遺傳操作體系使其成為最具潛力的微生物 細胞工廠之一。釀酒酵母細胞中的MVA途徑主要用于合成細胞膜的重要組分麥角固醇，以 維持細胞的正常生長。倍半萜是利用釀酒酵母合成的最為廣泛的萜類化合物，例如青蒿酸 產量可達25g/L，甜沒藥烯可達900mg/L等；然而其它萜類化合物如單萜，雙萜和三萜則產 量較低，大多低于50mg/L。尤其是單萜的合成，由于釀酒酵母細胞本身缺乏香葉基焦磷酸合 成酶，故不能有效合成單萜合成的直接前體香葉基焦磷酸（GPP)，這就大大降低了單萜的產 量。另外，單萜對細胞的毒性也是限制其產量的重要因素之一。
[0005] 基于上述單萜合成的限制性因素，經檢索通過調節細胞中GPP的合成以及功能性 表達高活性的香葉醇合成酶構建高產香葉醇的釀酒酵母重組菌株的專利及文獻還未見報 道。
【發明內容】
[0006] 針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一株高產單萜香葉醇的重組釀 酒酵母菌株及其在發酵制備香葉醇中的應用。
[0007] 本發明所述高產單萜香葉醇的重組釀酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株名為釀 酒酵母（Saccharomycescerevisiae)YZG13_GEl，該菌株基因型為：pZGV6_GEl，pZMVA4,已 于2015年09月25日保藏在"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北 京市朝陽區北辰西路1號院3號）"，保藏編號為CGMCCNo. 11465。
[0008] 本發明所述高產單萜香葉醇重組釀酒酵母菌株構建方法概述：將含有香葉醇 合成酶和法呢基焦磷酸合成酶突變體融合蛋白基因tV〇GES-ERG20F96WNmw的表達載體 PZGV6-GE1與含有異戊烯基二磷酸異構酶基因IDI1、HMG-CoA還原酶基因tHMGl和留醇調 節轉錄因子基因UPC2-1表達載體pZMVA4共轉化釀酒酵母單倍體菌株CEN.PK102-5B，得到 含有兩個質粒的重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1，即為高產單萜香葉醇的重組釀酒酵母菌株。
[0009] 上述技術方案較具體的步驟是：構建質粒PZGV6-GE1，通過融合PCR的方法構建 香葉醇合成酶和法呢基焦磷酸合成酶突變體融合蛋白基因tV〇GES-ERG20F96WNmw，然后通過 GibsonAssembly的方法將上述基因克隆到表達載體pJFE3的BamHI/PstI位點處得到表 達載體PZGV6-GE1 ;構建輔助質粒pJFE3-UPC2-l，將留醇調節轉錄因子基因UPC2-1克隆到 表達載體PJFE3的BamHI/Sbfl位點得到表達載體pJFE3-UPC2-l;構建質粒pZMVA4,將異 戊烯基二磷酸異構酶基因IDI1克隆到表達載體pIYC04的BamHI/Sall位點處得到表達載 體pZMVAl，再將HMG-CoA還原酶基因tHMGl基因通過GibsonAssembly的方法克隆到表達 載體pZMVAl的Spel位點得到表達載體pZMVA2,最后將從輔助質粒pJFE3-UPC2-l擴增得 到的UPC2-1的表達框TEFlp-UPC2-l-PGKlt片段通過GibsonAssembly的方法克隆到表達 載體PZMVA2的Kpn2I位點處，得到表達載體pZMVA4;將質粒pZGV6-GEl和質粒pZMVA4共 轉化釀酒酵母單倍體菌株CEN.ΡΚ102-5Β，得到重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1，其基因型為： PZGV6-GE1,pZMVA4〇
[0010] 進一步的，上述技術方案的實施步驟是：
[0011] (1)含有香葉醇合成途徑中關鍵基因表達框的表達載體的構建：
[0012] ①質粒PZGV6-GE1 :用于表達融合基因tVoGES-ERG20(ra6WNmw)，以尿嘧啶為篩選標 記。其中tVoGES為來源于Valerianaofficinalis的香葉醇合成酶（VoGES)(Accession no.KF951406)，且以釀酒酵母為表達宿主進行密碼子優化和刪除導肽序列；ERG20(F96WNmw) 為釀酒酵母內源基因ERG20突變體。
[0013] ②質粒pZMVA4:用于表達香葉醇合成上游途徑（即釀酒酵母內源的MVA途徑）的 關鍵基因IDI、tHMGl、UPC2-1，以組氨酸為篩選標記。
[0014] (2)高產單萜香葉醇的重組釀酒酵母菌株的構建：
[0015] 將步驟（1)中的pZGV6-GEl和pZMVA4兩個質粒同時轉化釀酒酵母CEN.PK102B菌 株，通過SD-Ura-His培養基（酵母基礎氮源yeastnitrogenbase1.7g/L，葡萄糖glucose 20g/L，硫酸銨（NH4)2S045g/L，缺尿嘧啶和組氨酸的氨基酸混合物CSM-Ura-His0. 65g/L) 篩選得到轉化成功的轉化子，即為重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1。
[0016] 本發明所述高產單萜香葉醇的重組釀酒酵母菌株在發酵生產香葉醇中的應用。
[0017] 本發明所述高產單萜香葉醇的重組釀酒酵母菌株在發酵生產香葉醇衍生產物 (如抗癌單萜類生物堿）中的應用。
[0018] 以不同發酵方式對重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1測試產生香葉醇的影響，結果顯 示本發明所述高產單萜香葉醇的重組釀酒酵母菌株產量是目前文獻報道最高產量（36mg/ L)的8倍。具體的：
[0019] ①好氧搖瓶發酵：40mLSD-Ura-His培養基中添加4mL十二烷作為萃取劑，初始接 種0D6。。為0.2,培養48小時，香葉醇產量達到最大值66. 2mg/L。
[0020] ②分批發酵：1L全自動控制發酵罐，培養基體積0.8L，添加200mL十二烷作為萃取 劑，初始接種0D600為0.2,通氣量lvvm，發酵48小時，香葉醇產量197mg/L。
[0021 ] ③補料分批發酵：培養基初始體積0. 4L，培養12小時后添加200mL十二烷作為萃 取劑，其他條件同②，36小時開始以一定的速率開始補料，72小時香葉醇產量達到最高值 293mg/L。該產量是目前文獻報道最高產量（36mg/L)的8倍。
[0022] 本發明公開了一株高產單萜香葉醇的重組釀酒酵母菌株，使香葉醇的產量得到 較大幅度的提高。本發明創新之處在于，通過篩選不同植物來源的香葉醇合成酶并對刪 除導肽序列的香葉醇合成酶與完整的香葉醇合成酶的活性作了比較，最終確定Valeriana officinalis來源的香葉醇合成酶刪除導肽后（tVoGES)的香葉醇合成活性最高，然后通過 融合蛋白的方式大大提高了蛋白的催化效率，同時結合碳代謝通量的優化提高前體GPP的 供應，使香葉醇的產量得到較大幅度的提高。本發明的技術策略為構建釀酒酵母平臺合成 其它高值單萜類化合物并實現工業化生產打下了堅實的基礎。
【附圖說明】
[0023] 圖1質粒pZVG6-GEl的構建流程圖。
[0024] 圖2輔助質粒pIYC04-UPC2-l質粒構建流程圖。
[0025] 圖3質粒pZMVA4的構建流程圖。
[0026] 圖4重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1產香葉醇GC-MS圖譜。
[0027] 其中：A圖香葉醇標準品GC圖譜，B圖為對照菌株GC圖譜，C圖為YZG13-GE1菌株 GC圖譜。
[0028] 圖5重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1好氧搖瓶發酵過程中香葉醇產生量的變化。
[0029] 圖6重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1和對照菌株好氧搖瓶發酵過程中胞內鯊烯含量 變化。
[0030] 圖7重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1和對照菌株分批發酵過程中代謝產物的變化。
[0031] 其中：A圖為YZG13-GE1菌株分批發酵代謝產物的變化，B圖為對照菌株分批發酵 代謝產物的變化。
[0032]Symbols:，glucose;▲，ethanol;?，glycerol;★，aceticacid;·，OD600〇
[0033] 圖8重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1分批發酵過程中香葉醇產生量的變化。
[0034] 圖9重組釀酒酵母菌株YZG13-GE1分批發酵過程中0D值以及香葉醇產生量的變 化。
【具體實施方式】
[0035] 實施例1微生物材料來源及培養和分子生物學技術方法
[0036] (1)培養基
[0037] 大腸桿菌（Escherichiacoli)培養使用的LB培養基：10gL1蛋白胨，5gL