專利名稱：胚胎腎臟的體外器官培養方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及哺乳動物的胚胎腎臟的體外器官培養方法，特別是小鼠胚胎期腎臟的離體器官培養。
背景技術：
體外器官培養屬于組織培養的一種高級形式，它能再現器官的發育過程，模擬器官在不同狀態及條件下的功能狀態，是是了解器官發育過程，研究疾病致病機制及藥物篩選的重要技術手段。目前腎臟體外器官培養目前有由Mxen L等于1966年發表于雜志 InternationalJournal of Cancer _t Cell contact and cell adhesion during tissue organization 1966May 15 ； 1 (3) :271-90. —文中，他們利用 3. 5cm 培養皿，放入 2ml 培養基，將孔徑5um左右的聚碳酸脂濾膜漂在培養基上或者用不銹鋼網做支架支撐。然后將小鼠胚胎腎臟放置于濾膜上，置于氣液交界處培養(參見附圖1、圖幻。最新的是2010 年，Jamie A. Davies 在雜志 PLoSOne 中發表的 A novel, low-volume method for organ culture of embryonic kidneys thatallows development of cortico-medullary anatomical organization 2010Mayl0 ；5 (5) :el0550. 一文提出了小體積培養方法。同樣是利用3. 5cm培養皿，改進之處在于利用孔底面積1平方厘米的硅膠圈和22mmX22mm的玻璃片組裝培養孔，將胚胎腎臟直接培養在玻璃片上，加入85ul體積培養基培養，硅膠圈和培養皿之間的空隙用帶抗生素的磷酸鹽緩沖液填充維持培養皿濕度(參見附圖3、圖4)。但是上述兩種方法均受到使用需要使用特殊材料和占用較大空間限制，另外也未考慮到培養基體積和成分變化對腎臟培養產生的影響，阻礙了胚胎腎臟的體外器官培養技術的大規模應用以及其在藥物篩選中的運用。
發明內容
本發明要解決的技術問題主要是現有培養方法需要特殊材料和占用空間大的缺陷。本發明解決技術問題提供的技術方案是提供一種哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法。該方法包括以下步驟a、在多孔培養板的培養孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養孔底部構建出培養空間；b、將取得的哺乳動物胚胎腎臟放置于承載片上，加入培養基，使腎臟處于培養基和空氣的液-氣交界處；c、37°C培養箱中培養，然后每1到2天進行培養基換液。其中，上述方法步驟a所述的多孔培養板為M孔培養板。其中，上述方法中在在使用的多孔培養板的各孔間隙加入濕度平衡液，以減緩培養基揮發。
其中，上述方法步驟b中加入培養基后調整承載片于培養孔的底部的中心，哺乳動物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基位于承載片的中部。其中，上述方法c步驟中所述的培養基采用半量遞增的方式換液，即每次換液時保留上次培養基體積的一半在原培養孔中，然后將比上次培養基體積的一半按體積分數還多增加6% -12%的新鮮培養基加入培養孔。進行10天培養時，第1-2天按上次培養基體積的一半加入，第9-10天按上次培養基體積的一半加入最佳。其中，上述方法步驟a中所述的承載片為透明玻璃圓片。其中，上述方法中所述濕度平衡液為無菌的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水。其中，上述方法中所述胚胎腎臟為分離的胚胎期10 13天的小鼠腎臟原基。其中，上述方法中所述的腎臟放置方式為將腎臟平放。即輸尿管走向面與承載片平面平行的方式放置于承載片上。本發明方法的有益效果在于使用本發明方法進行胚胎腎臟的體外器官培養無需昂貴進口濾膜或者硅膠圈等進口材料，成本大大降低；克服了目前所有方法的占用空間大缺點，使用本發明放在運用利用M孔培養板可以將每個腎臟培養時的占用面積由38. 5平方厘米減少到1. 5平方厘米左右，大大提高了空間利用率；具有培養基用量少的優點，利用 M孔培養板時每孔只需150ul左右的培養基培養即可；體系組裝簡單，操作便捷，只需將處理好的承載片放入培養孔，放置胚胎腎臟，加入培養基培養即可，簡單易行且污染環節大大減少，有利于培養成功率的提高；培養結果良好，胚胎腎臟的培養時間能到10天以上，可提高到12天，并可見輸尿管平滑肌自主性收縮；使用承載片培養導致后續操作方便，可進行原位雜交，免疫熒光等后繼實驗操作操作。本發明方法還另外提供了一種優選的培養基后繼換液方案，使培養效果更好，體外器官發育更加穩定。本發明方法能大量低成本地獲得穩定發育且便于后繼操作的體外培養腎臟器官，還能滿足大規模藥物篩選的需求。
圖1、傳統的胚胎腎臟體外器官培養兩種方法的體系示意圖之一。1、培養基；2、聚碳酸脂濾膜；3、.胚胎腎臟原基；4、不銹鋼網支架。圖2、傳統的胚胎腎臟體外器官培養兩種方法的體系示意圖之二。1、培養基；2、聚碳酸脂濾膜；3、.胚胎腎臟原基；4、不銹鋼網支架。圖3、已報導的小體積胚胎腎臟體外器官培養體系(培養皿)示意圖，示縱剖面。
1、培養基；2、硅膠圈；3、胚胎腎臟原基；4、22mmX22mm玻璃片；5、1XPBS。圖4、已報導的小體積胚胎腎臟體外器官培養體系(培養皿)示意圖，俯視。1、培養基；2、硅膠圈；3、胚胎腎臟原基；4、22mmX22mm玻璃片；5、1X PBS。圖5、本發明的培養方法采用的胚胎腎臟體外器官體系示意圖。1、培養基；2、承載片；3、胚胎腎臟；4、培養孔；5、濕度平衡液，6M孔培養板。圖6.本發明的承載片-多孔平板法的胚胎腎臟體外器官培養裝置1.培養基；
2.承載片；3.胚胎腎臟；圖7.本發明的承載片-多孔平板法的胚胎腎臟體外器官培養裝置1.培養基； 2.承載片；3.胚胎腎臟；
圖8、本發明的培養方法使用M孔板時，優化的培養基換液體積方案。圖9、本發明方法胚胎腎體外培養效果及原位雜交和免疫熒光檢測。圖中第一、二排顯示的是小鼠胚胎期12. 5天的腎臟進行培養十天的效果圖，能看得見明顯的輸尿管分支及腎單位各階段前體結果的形成。培養效果良好，并可見輸尿管自主性收縮。第三排為分別用原位雜交(in situ)和免疫熒光檢測腎單位標志物PAX8和輸尿管及遠端小管標志物E-cadherin 型鈣粘附蛋白)的表達，黑色和白色分別顯示陽性信號，實驗結果證明了本發明方法培養的腎臟發育良好，可應用于多種方式檢測。圖10、用現有方法培養了 10天后免疫熒光檢測的結果，示輸尿管(來源于Jamie A. Davies 在雜志 PLoS One 中發表的 A novel, low-volume method for organ culture of embryonickidneys that allows development of cortico—medullary anatomical organization 20IOMay 10 ；5 (5) :el0550.)，本發明方法6天培養的結果就和其10天的培
養結果基本一致。圖11、用本發明方法培養得到的體外培養胚胎腎臟的SiRNA轉染效果圖。該圖顯示用EGFP綠色熒光轉基因小鼠胚胎期10. 5和11. 5天取出的腎臟轉染CY5紅色熒光標記的siRNA效果圖，第一列為鏡下腎臟形態圖，第二列為綠色熒光表達圖，第三列為紅色熒光圖，兩張圖顯示了絕大部分細胞轉染進了 siRNA。
具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式
，對本發明進行詳細說明。本發明提供了一種胚胎腎臟的體外器官培養方法，包括以下步驟a、在多孔培養板的培養孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養孔底部構建出培養空間；b、將取得的哺乳動物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基放置于承載片上，加入培養基，使腎臟處于培養基和空氣的氣液交界面，僅有一層薄液膜覆蓋在上面，這與現有技術的常規方法一致；即使腎臟上表面有一層液膜，不是完全裸露于空氣中。c、37°C培養箱中培養，然后每天進行培養基換液。本發明方法步驟a所述的多孔培養板為M孔培養板。本發明方法在使用的多孔培養板的各孔間隙加入濕度平衡液，以減緩培養基揮發。本發明方法步驟b中加入培養基后調整承載片于培養孔的底部的中心，哺乳動物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基位于承載片的中部。本發明方法c步驟中所述的培養基采用半量遞增的方式換液，即每次換液時保留上次培養基體積的一半在原培養孔中，然后將比上次培養基體積的一半還按體積分數多增加6% -12%的新鮮培養基加入培養孔。優選的，第1-2天按上次培養基體積的一半加入；進行10天培養時，第9-10天按上次培養基體積的一半加入最佳。本發明方法步驟a中所述的承載片可為透明玻璃片。承載片尺寸應小于孔徑大小，大小為培養孔的50-80%大小，形狀匹配。最好與培養孔一樣為圓形的透明玻璃圓片。 承載片一般應貼在底部。
本發明方法中所述濕度平衡液為無菌的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水。本發明方法中所述胚胎腎臟為分離的胚胎期10 13天的小鼠腎臟原基。本發明方法中所述的腎臟放置方式為將腎臟原基平放，即橫切面放置于承載片上。當然，在本領域中，本發明方法中使用的各種試劑和材料，都應為無菌的，操作也應在無菌條件下進行。本發明方法使用的承載片可以是各種材質的適于組織細胞培養的薄片，最常用和最優的是透明玻璃圓片。承載片使用前應進行充分的清洗和滅菌處理，在需要的情況下，可以用合適的基質預處理，如多聚賴氨酸，明膠或者膠原等。本發明方法中使用的多孔培養板可以是常規的能應用于細胞組織培養的普通M 孔板，其孔最好是底面積在1 3平方厘米的平底圓孔。最常見的是標準的M孔平底細胞培養板，材質是玻璃或者塑料均可。本發明方法中使用的濕度平衡液必須無菌，無毒。最好用無菌的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水，根據使用多孔培養板確定用量，一般的標準M孔平底細胞培養板使用的濕度平衡液體積應大于200ul，最好是500ul。本發明方法中使用的胚胎腎臟一般為實驗用的小鼠的胚胎。實驗小鼠胚胎腎臟可以為胚胎期10 13天的腎臟原基(腎臟原基是本領域就發育早期的胚胎腎臟的一種通用叫法)。而每個承載片上可放置1 4個胚胎腎臟，即1個孔中最多可培養4個小鼠胚胎腎臟。胚胎腎臟最好平放，即按橫切面水平放置于承載片上以便腎臟原基能發育成形態良好的腎臟。在實際操作過程中，只要輸尿管還在，放下去就是平放的。本發明方法中使用培養基可為本領域通用的各種細胞培養基，比如dulbecco’ s modifiedeagle，s medium (DMEM，通用的培養基，如商家hvitrogen貨號11965的產品，或也可參考網上公開的http //baike. baidu. com/view/3501452. htm 記載的 DMEM(H)細胞培養基(粉末型)成分配制)或者fegle，s minimal essential medium(EMEM，通用的培養基，配方公知。然后在選擇的培養基中加入體積分數為5-20%的FBS(胎牛血清)或者 F12營養因子anvitrogen公司產品，品名營養因子混合物，貨號21700)，一般還可添加按終度0. lmg/ml添加抗生素penicillin或str印tomycin(青霉素或鏈霉素)防止污染。本發明方法中的培養條件為通用細胞培養條件。一般溫度為36°C 38°C;最好在 37°C下，體積分數為5%二氧化碳的環境中培養。本發明方法中使用的培養基可每隔M 48小時，去掉舊培養基并加入等體積新培養基繼續培養。還可以采用的優選的換液方式是采用半量遞增的方式換液，即每次換液時保留上次培養基體積的一半在原培養孔中，然后將比上次培養基體積的一半還按體積分數多增加 6% -12%的新鮮培養基加入培養孔。若用標準M孔平底細胞培養板時，標準的M孔平底細胞培養板時，培養基體積可用每孔130-170ul，最佳的體積應為每孔150ul。那么是換液時將比上次培養基體積的一半多2 IOul的新鮮培養基加入培養孔。優選5 10ul，最佳為 8ul。實施例一使用本發明方法培養Balb/c小鼠胚胎期11. 5天腎臟。1、準備承載片用直徑12mm的玻璃圓蓋片作為承載片，購買于海門市華凱實驗玻璃儀器有限公司。首先，用蒸餾水配制體積分數為的鹽酸溶液，在室溫搖動清洗圓蓋片一個小時。用蒸餾水清洗后，放入體積分數為70%的酒精溶液中，搖動清洗過夜。用IOcm 玻璃平皿盛放清洗后的圓蓋片，浙干液體后放入高溫蒸汽滅菌鍋內，121°C滅菌20分鐘。烘干后置于超凈工作臺備用。2、組裝培養裝置用無菌的鑷子夾取處理好的圓蓋片放置于無菌的M孔培養板的培養孔中中。無菌的M孔培養板為購置于Costar (康寧公司，美國)的35M型組織培養板。3、獲得胚胎期11. 5天小鼠腎臟以受孕Balb/c母鼠，來源于四川大學華西醫院基因工程小鼠中心SPF級(無特殊病原菌)動物房，陰道見栓當天為0. 5天開始計算胚胎發育時間，在第11. 5天從動物飼養房取出孕鼠。引頸法處死孕鼠后，用酒精消毒孕鼠及解剖器械。取出小鼠胚胎后于冰上預冷的解剖液(IX PBS，HBSS或者DMEM)中解剖，體視鏡下取出腎臟原基，用200ul吸頭轉移到裝有培養基(DMEM+10% FBS) 1. 5ml的EP管中。4、在超凈工作臺內，用200ul的移液器轉移腎臟原基到培養孔，每孔一個。用移液器吸走培養孔中殘余培養基并加入150ul培養基。用酒精燈高溫滅菌尖鑷子，待冷后移動輕輕移動腎臟原基至園蓋片中部，并調整園蓋片位置使得腎臟原基位于培養孔正中。培養體系的構建參見圖5、圖6、圖7的示意圖。5、小心將種好的腎臟放置于細胞培養箱于37°C，5% CO2中培養M小時。6、用移液器將培養孔中培養基全部轉移至對應換液孔，再用移液器回吸75ul培養基到培養孔，并丟棄剩余培養基。7、加入75+5ul的新鮮培養基到培養孔，混勻后于細胞培養箱中培養M小時。8、然后同步驟6和7進行半量遞增換液留SOul原培養基+SOul新培養基。9、每隔M小時換液。換液體積方案如圖8所示。10、培養10天效果(附圖9)。圖9中第一、二排顯示的是小鼠胚胎期12. 5天的腎臟進行培養十天中每天的情況，能看得見明顯的輸尿管分支及腎單位各階段前體結果的形成，并可第七、八天開始出現輸尿管平滑肌自主性收縮，說明了輸尿管感受到液體刺激進行排尿，和生理狀況一樣，說明培養腎臟接近體內情況，有部分生理功能。而且的輸尿管分支和腎單位還能充分的形成，如圖9的136小時可見輸尿管分支很充分，另免疫熒光結果顯示的輸尿管分支也很充分，結果與最新報道的培養方法的十天的結果(圖10)相似，質量相近。第三排為分別用原位雜交和免疫熒光檢測腎單位標志物PAX8和輸尿管及遠端小管標志物E-cadherin的表達，黑色和白色分別顯示陽性信號，實驗結果證明了本發明方法培養的腎臟發育良好，可應用于多種方式檢測。經多次試驗，利用上述方法使用E12. 5天的腎臟進行體外培養幾乎是100%成功率，而Ell. 5天則有75%左右的成功率，一個孔可培養培養1個到4個腎臟，一般采用1個孔1個的方式，24孔平板所有孔用完至少可培養M個，最佳是使用8個內圈的孔進行培養。 24孔板(13cmX8. 5cmX2. 5cm養M個即約11立方厘米空間1個腎臟，而現有技術最小是一般3. 5cmX3. 5cmX2. 5cm養一個，即 31立方厘米空間1個腎臟，另外本方案M個腎臟在一起可聯系同環境同時操作，生長一致性更好，也更便于實現大規模藥物篩選。實施例二本發明培養方法得到的胚胎腎臟的轉染
1、準備承載片直徑12mm的玻璃圓蓋片作承載片，購買于海門市華凱實驗玻璃儀器有限公司。首先，用蒸餾水配制體積分數為的鹽酸溶液，在室溫搖動清洗圓蓋片一個小時。用蒸餾水清洗后，放入體積分數為70%的酒精溶液中，搖動清洗過夜。用IOcm玻璃平皿盛放清洗后的圓蓋片，浙干液體后放入高溫蒸汽滅菌鍋內，121°C滅菌20分鐘。烘干后置于超凈工作臺備用。2、組裝培養裝置用無菌的鑷子夾取處理好的圓蓋片放置于無菌的M孔培養板中。無菌的M孔培養板為購置于Costar公司的35M型號組織培養板。3、獲得胚胎期11. 5天小鼠腎臟以EGFP轉基因母鼠(需要簡要說明該鼠的來源。(增強的綠色熒光蛋白EGFP轉基因小鼠由美國The Jackson Laboratory構建，貨號 003115)陰道見栓當天為0.5天開始計算胚胎發育時間，在第11. 5天從動物飼養房取出孕鼠。引頸法處死孕鼠后，用酒精消毒孕鼠及解剖器械。取出小鼠胚胎后于冰上預冷的解剖液(IX PBS, HBSS或者DMEM)中解剖，體視鏡下取出腎臟原基，用200ul吸頭轉移到裝有培養基(DMEM+10% FBS) 1. 5ml 的 EP 管中。4、用49ul培養基轉移腎臟到200ul PCR管中，在避強光環境下加入Iul 20umol/ L修飾后的Cy5-siRNA(siRNA序列為GCUCUUACGAUGAUA，由廣州銳博生物合成并提供商品化修飾)。于細胞培養箱中培養6小時。5、在超凈工作臺內，用200ul的移液器轉移腎臟原基到培養孔，每孔一個。用移液器吸走殘余培養基并加入150ul培養基。用酒精燈高溫滅菌尖鑷子，待冷后移動輕輕移動腎臟原基至園蓋片中部，并調整園蓋片位置使得腎臟原基位于培養孔正中。6、小心將種好的腎臟放置于細胞培養箱于37°C，5% CO2中培養1天后，用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，可檢測很高的轉染效率。效果見圖11。
權利要求
1.哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法，其特征在于包括以下步驟a、在多孔培養板的培養孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養孔底部構建出培養空間；b、將取得的哺乳動物胚胎腎臟放置于承載片上，加入培養基，使腎臟處于培養基和空氣的氣-液交界處；c、36°C 38°C培養箱中培養，然后每1到2天進行培養基換液。
2.根據權利要求1所述的哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法，其特征在于步驟a 所述的多孔培養板為M孔培養板。
3.根據權利要求1所述的哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法，其特征在于在使用多孔培養板的各孔間隙加入濕度平衡液，以減緩培養基揮發。
4.根據權利要求1所述的哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法，其特征在于步驟 b中加入培養基后調整承載片于培養孔的底部的中心，哺乳動物胚胎腎臟位于承載片的中部。
5.根據權利要求1所述的哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法，其特征在于步驟c 中所述的培養基采用半量遞增的方式換液，即每次換液時保留上次培養基體積的一半在原培養孔中，然后將比上次培養基體積的一半按體積分數還多增加6%-12%的新鮮培養基加入培養孔。
6.根據權利要求1所述的哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法，其特征在于步驟a 所述的承載片為透明玻璃圓片。
7.根據權利要求1所述的哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法，其特征在于所述濕度平衡液為無菌的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水。
8.根據權利要求1所述的哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法，其特征在于所述胚胎腎臟為分離的胚胎期10 13天的小鼠腎臟原基。
9.根據權利要求1所述的哺乳動物胚胎腎臟的體外器官培養方法，其特征在于將腎臟平放。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，涉及哺乳動物的胚胎腎臟的體外器官培養方法，特別是小鼠胚胎期腎臟的離體器官培養。本發明要解決的技術問題主要是現有培養方法需要特殊材料和占用空間大的缺陷。本發明技術方案是胚胎腎臟的體外器官培養方法，包括以下步驟a、在多孔培養板的培養孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養孔底部構建出培養空間；b、將取得的哺乳動物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基放置于承載片上，加入培養基，使腎臟處于培養基和空氣的交界處；c、37℃培養箱中培養，然后每1到2天進行培養基換液。使用本發明方法能大量低成本地獲得穩定發育且便于后繼操作的體外培養腎臟器官，還能滿足大規模藥物篩選的需求。
文檔編號C12N5/073GK102391983SQ20111034524
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者呂小巖, 周欽, 孫環, 陳鐵林, 魏于全 申請人:四川大學華西醫院