專利名稱：Hiv-1b亞型耐藥突變株及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種HIV-IB亞型耐藥突變株及其構建方法和應用。
背景技術：
人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是引起人類獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原體，自 1981 年美國首次診斷出艾滋病以來，艾滋病在全球范圍內迅速傳播。中國艾滋病的流行已有25年，截止2010年10月底，中國已累計報告艾滋病病毒感染者和艾滋病患者37萬余例，其中艾滋病病人已逾13萬之多，僅死亡病例就已超過6. 8萬。在國家“四免一關懷”政策的支持下，我國從2003年開始在全國范圍內逐步實施免費的艾滋病抗病毒治療，到2010年底治療人數已超過7萬人。臨床觀察表明，抗病毒治療對減輕病情、提高病人生活質量、延長生命具有很好的作用。但抗病毒治療也是一把“雙刃劍”，在為病人帶來福音的同時也為進一步的治療帶來了困難——HIV耐藥性的出現與流行成了制約抗病毒治療的瓶頸。HIV-I抑制劑主要是針對蛋白酶和逆轉錄酶設計而成，目的是阻斷HIV-I的復制和包裝。盡管目前已經確定了大量HIV耐藥突變位點，但是仍然不斷有新型耐藥突變位點被發現和鑒定，原因是(1)以往對耐藥突變位點的研究主要集中于藥物與病毒靶標的結合區，近年來發現，藥物壓力對病毒的影響是長期的、整體的，在藥物結合區以外也有耐藥相關突變位點；( 病毒長期處于藥物壓力下，宿主/病毒/藥物長期相互作用，病毒將出現比初期受到藥物壓力時更多耐藥相關突變；C3)不同亞型HIV-I毒株在相同的藥物壓力下可能出現不同的耐藥突變或突變型。新型耐藥突變位點的發現及鑒定對抗病毒治療以及了解耐藥機制都具有至關重要的意義。中國于2003年在既往有償采漿感染HIV的艾滋病人群中首推使用6種國產仿制抗病毒藥物(Zidovudine，簡稱AZT或ZDV，中文名稱為齊多夫定；Dideoxyinosine，簡稱ddl，中文名稱為去羥肌苷Jtavudine，簡稱d4T，中文名稱為司他夫定；Lamivudine，簡稱3TC，中文名稱為拉米夫定；Nevirapine，簡稱NVP，中文名稱為奈韋拉平；Efavirenz，簡稱EFV,中文名稱為依非韋侖)組成的AZT/ddl/NVP、AZT/3TC/NVP等6種治療方案，之后在全國范圍內全面推廣。我國的抗病毒治療模式存在以下特點(1)目前的抗病毒治療主要使用國產仿制藥，盡管藥物的主要成分與國外的藥物相同，但生產工藝的細小差別也可能影響藥物的效果，例如在有些地區發現毒副作用可能較大，這可能直接影響藥物的吸收以及血藥濃度，對耐藥性產生有重要影響；( 抗病毒治療模式是以農村為主的依托鄉村醫生的治療，服藥的治療和保障方式均有特點；C3)在河南等地區，由于對抗病毒治療認識上的不足和缺乏必要的臨床藥物服用監督，藥物依從性不能達到一個理想的水平，而依從性是影響耐藥發生的一個至關重要的因素，在一些地區耐藥發生已經到了相當嚴重的地步。雖然艾滋病病毒在我國流行呈多樣性，但在我國以既往獻/輸血感染HIV的邊遠農村地區，HIV-IB亞型毒株依然占主導地位。抗病毒治療時間長及上述抗病毒模式的特點，提示在HIV-IB亞型毒株中可能會存在有尚未被認知的新型耐藥突變。
發明內容
本發明的目的是提供一種HIV-IB亞型耐藥突變株及其構建方法和應用。本發明提供了一種構建HIV-IB亞型耐藥突變株的方法，是將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸(T)突變為纈氨酸(V)，獲得HIV-IB亞型耐藥突變株(HIV-1B亞型T369V突變株)。所述HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。所述將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為纈氨酸具體是通過將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因自5’末端第1105位核苷酸由a突變為g，第1106位核苷酸由c突變為t實現的；所述HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因如序列表的序列2所示。所述HIV-IB亞型耐藥突變株對藥物的耐受能力高于所述HIV-IB亞型野生株；所述藥物為AZT(Zidovudine，又稱齊多夫定)、EFV(Efavirenz ；又稱依非韋侖)和NVP(Nevirapine，又稱奈韋拉平)中的至少一種。所述將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為纈氨酸的方法具體包括如下步驟(1)將pNL4. 3質粒中的所述HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因自5’末端第1105位核苷酸由a突變為g，第1106位核苷酸由c突變為t，獲得重組質粒pNL4. 3_T369V ；(2)將重組質粒pNL4. 3_T369V轉染哺乳動物細胞，培養細胞并收獲上清液。所述哺乳動物細胞具體可為細胞。所述培養的方法具體可為37°C培養18-4他。以上任一所述方法獲得的HIV-IB亞型耐藥突變株也屬于本發明的保護范圍。所述HIV-IB亞型耐藥突變株可用于篩選抗艾滋病藥物。本發明還保護一種重組質粒，為將pNL4. 3質粒中的HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因自5’末端第1105位核苷酸由a突變為g，第1106位核苷酸由c突變為t，獲得的重組質粒PNL4. 3_T369V ；所述HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因如序列表的序列2所示。本發明還保護T369V突變在促進HIV-IB亞型野生株的耐藥性中的應用；所述T369V突變為HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸(T)突變為纈氨酸(V)。所述逆轉錄酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。本發明對于抗HIV藥物的篩選具有重大價值，進而對艾滋病的治療具有深遠影響。
圖1為重組質粒pNL4. 3_T369V的Hind III酶切鑒定圖；泳道6 重組質粒pNL4. 3_T369V ；泳道10 分子量Marker ；其它泳道與本專利無關。圖2為HIV-IB亞型T369V突變株感染MT_2細胞后的CPE效應(普通光學顯微鏡下的數碼照片，物鏡放大倍數為IOX，目鏡放大倍數為10X)；箭頭指示的為合胞體。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。pMD-18 T 載體TaKaRa 公司。AZT (Zidovudine) =SIGMA0 EFV(Efavirenz)上海迪賽諾公司。NVP(Nevirapine)上海迪賽諾公司。Phusion Site-directed MutagenesisKit 購自 New England Biolabs, Product Code :F541，用于 DNA 序列的定點突變。Lipofectamine 2000 購自 Invitrogen，Cat No :11668_019。實施例1、耐藥突變位點的發現比較抗病毒治療失敗患者與未治療患者蛋白全長基因的序列，在逆轉錄酶區的560個密碼子中，2組人群中共計有6個位點的7個突變，其中一個突變為T369V。HIV-IB亞型的逆轉錄酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其編碼序列如序列表的序列2所示。從蛋白層面來說，T369V突變即將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶(序列表的序列1所示)自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸(T)突變為纈氨酸(V)。從基因層面來說，T369V突變可為將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因(序列表的序列2所示)自5’末端第1105位核苷酸由a突變為g，第1106位核苷酸由c突變為t。實施例2、HIV-IB亞型耐藥突變株(HIV-1B亞型T369V突變株)的構建pNL4. 3質粒公眾可以從中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得；參考文獻Wang CiMitsuya YiGharizadeh B, Ronaghi Μ, Shafer RW. Characterizationof mutation spectra with ultra-deep pyrosequencing-application to HIV-I drugresistance. Genome Res. 2007 ； 17 (8) :1195-201. ；Hoffmann CiMinkah N,Leipzig J,WangGiArens MQ，Tebas PiBushman FD. NA bar coding and pyrosequencing to identify rareHIV drug resistance mutations. Nucleic Acids Res. 2007 ；35 (13) :e91. ；pNL4.3 質粒含有HIV-IB亞型野生株的全基因組序列，轉染細胞并表達可以得到HIV-IB亞型野生株。細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。ΜΤ-2細胞公眾可以從中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得；參考文獻Coakley Ε, Reeves JD,Huang W,Mangas-Ruiz Μ,Maurer I,Harskamp AM, etal. Comparision of the HIV-I tropism profiles in clinical samples by the Trofileand MT-2 cell assays. Antimicrob Agents Chemother 2009 ；53 (11) :4686-93.。一、構建具有定點突變的重組質粒1、設計用于定點突變的引物如下T369V_F 5' -GATGTGAAACAATTAGTAGAGGCAGTACAAA-3'；T369V_R 5’ -ATTAGTGTGGGCACCCTTCATTC-3 ’。2、以pNL4. 3質粒為模板，用PLA-7和Vif_3組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物(約2258bp)。PLA-7 :5，-CTTTGGATGGGTTATGAACT-3，(針對 pNL4. 3 的位置 3231-3250)；Vif-3 :5，-TCGCTGTCTTCGCTTCTTCCTGCCAT-3，(針對 pNL4. 3 的位置 5994-6019)。
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(PCR擴增的目的片段包括pNL4. 3質粒中的HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因區域，并且在該區域以外具有Age I和EcoR I酶切位點)。3、將步驟2的PCR擴增產物與pMD-18 T載體連接，得到重組質粒甲。4、以重組質粒甲為模板，用T369V_F和T369V_R組成的引物對進行PCR擴增，并在T4 DNA連接酶的作用下得到重組質粒乙(因為是對環狀DNA進行擴增，T369V_F和T369V_R分別擴增環狀DNA的正義鏈和反義鏈，PCR擴增結束后，擴增產物在T4 DNA連接酶的作用下形成新的環形DNA，即重組質粒乙；重組質粒甲和重組質粒乙的區別僅在于將重組質粒甲中攜帶的HIV-IB亞型野生株逆轉錄酶編碼基因自5’末端第1105位核苷酸由a突變為g，第1106位核苷酸由c突變為t)。5、用限制性內切酶Age I和EcoR I雙酶切步驟4的重組質粒乙，回收酶切產物(約 2258bp)。6、用限制性內切酶Age I和EcoR I雙酶切pNL4. 3質粒，回收載體骨架(約12. 2kb)。7、將步驟5的酶切產物和步驟6的載體骨架連接，得到重組質粒丙(又稱重組質粒pNL4. 3_T369V)。利用限制性內切酶Hind III對重組質粒pNL4. 3_T369V進行單酶切鑒定，見圖1，顯示有5個條帶，與預期相符。二、構建HIV-IB亞型T369V突變株1、用DMEM培養基(含100 μ g/ml青霉素和100U/ml鏈霉素)重懸細胞，得到4 X IO5個細胞/ml的細胞懸液。2、將細胞懸液加入6孔培養板，每孔anl，在(X)2培養箱中37°C培養M小時，然后棄除上清，用PBS緩沖液洗滌兩次。3、借助Lipofectamine 2000 (按說明書操作)，將重組質粒pNL4. 3_T369V轉染步驟2的細胞，每孔轉染4微克重組質粒，在(X)2培養箱中37°C培養36小時，收集上清，將上清進行 P24 抗原測定(P24 試劑盒Vironostika@HIV-l Antigen Microelisa system，生產商=BiomeriEUX，產地法國)，結果為陽性，該上清即為即為HIV-IB亞型T369V突變株病毒液，分裝后-80°C保存。三、HIV-IB亞型野生株的獲得將pNL4. 3質粒代替重組質粒pNL4. 3_T369V，其它同步驟二，獲得HIV-IB亞型野生株病毒液。四、突變病毒株的鑒定將步驟二得到HIV-IB亞型T369V突變株病毒液感染MT_2細胞，每5X IO4個細胞感染10微升病毒液(病毒液每毫升含1122TCID5(1的病毒劑量)，在(X)2培養箱中37°C培養，培養5天后的照片見圖2。可以觀察到，MT-2細胞產生了很大的合胞體，具有明顯的CPE(cytopathic effect)反應，證明HIV-1B亞型T369V突變株是具有感染性的。分別將步驟二得到的HIV-IB亞型T369V突變株病毒液和步驟三得到的HIV-IB亞型野生株病毒液提取基因組DNA并進行測序，結果表明，與HIV-IB亞型野生株相比，HIV-IB亞型T369V突變株的差異僅在于兩個核苷酸(將序列表的序列2所示的HIV-IB亞型野生株逆轉錄酶編碼基因自5’末端第1105位核苷酸由a突變為g，第1106位核苷酸由c突變為t)，引起一個氨基酸突變(將序列表的序列1所示的HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為纈氨酸)。實施例3、HIV-IB亞型耐藥突變株的耐藥性鑒定1、在細胞培養板中加入10微升藥物溶液(藥物溶液由藥物和水組成；分別采用AZT、EFV和NVP三種藥物；每種藥物設置6個梯度濃度AZT為2000nM 2. 74nM，稀釋度為3° ；EFV為IOOnM 0. 14nM,稀釋度為3° ；NVP為6000nM 8. 23nM,稀釋度為3° 3_6 ；每個藥物的每個濃度設置三個復孔)。2、用PBS緩沖液調整實施例2的步驟二得到的HIV-IB亞型T369V突變株病毒液(或實施例2的步驟三得到的HIV-IB亞型野生株病毒液)的濃度，得到病毒稀釋液。3、在步驟1的細胞培養板中每孔加入20 μ 1步驟2的病毒稀釋液，然后每孔加入70 μ 1 ΜΤ-2細胞懸液(ΜΤ-2細胞懸液中的細胞濃度為7 X IO4個細胞/ml)，感染性倍數(multiplicity of infection)MOI = 0. 003366TCID5(I，37°C、5% CO2 培養 2 天；第 3 天，每孔補加50 μ 1 RPMI-1640培養基(含10% FBS)，繼續培養2天；第5天觀察CPE，統計不同濃度下CPE出現的比例(CPE，% )。4、計算50%細胞出現CPE時的藥物濃度，即IC5tl值。HIV-IB亞型T369V突變株針對AZT的IC50值為318. IOnM,針對EFV的IC50值為36. 92ηΜ，針對 NVP 的 IC5tl 值為 2661. ΟΟηΜ。HIV-IB亞型野生株針對AZT的IC50值為112. 50ηΜ，針對EFV的IC50值為8. IlnM,針對 NVP 的 IC5tl 值為 230. 40ηΜ。5、計算突變病毒株對于各個藥物的耐藥倍數。耐藥倍數=HIV-IB亞型T369V突變株的IC5(1/HIV_1B亞型野生株的IC5(1。HIV-IB亞型T369V突變株針對AZT的耐藥倍數為2. 83。HIV-IB亞型T369V突變株針對EFV的耐藥倍數為4. 55。HIV-IB亞型T369V突變株針對NVP的耐藥倍數為11. 5。
權利要求
1.一種構建HIV-IB亞型耐藥突變株的方法，是將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為纈氨酸，獲得HIV-IB亞型耐藥突變株。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述逆轉錄酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為纈氨酸是通過所述將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因自5’末端第1105位核苷酸由a突變為g，第1106位核苷酸由c突變為t實現的；所述HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因如序列表的序列2所示。
4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述HIV-IB亞型耐藥突變株對藥物的耐受能力高于所述HIV-IB亞型野生株；所述藥物為AZT、EFV和NVP中的至少一種。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述將HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為纈氨酸的方法包括如下步驟(1)將pNL4.3質粒中的所述HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因自5’末端第1105位核苷酸由a突變為g，第1106位核苷酸由c突變為t，獲得重組質粒pNL4. 3_T369V ；(2)將重組質粒pNL4.3_T369V轉染哺乳動物細胞，培養細胞并收獲上清液。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述哺乳動物細胞為細胞；所述培養 的方法為37°C培養18-4 1。
7.權利要求1至6中任一所述方法獲得的HIV-IB亞型耐藥突變株。
8.權利要求7所述HIV-IB亞型耐藥突變株在篩選抗艾滋病藥物中的應用。
9.一種重組質粒，為將pNL4. 3質粒中的HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因自5’末端第1105位核苷酸由a突變為g，第1106位核苷酸由c突變為t，獲得的重組質粒pNL4. 3_T369V ；所述HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶的編碼基因如序列表的序列2所示。
10.T369V突變在促進HIV-IB亞型野生株的耐藥性中的應用；所述T369V突變為HIV-IB亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為纈氨酸；所述逆轉錄酶的氨基酸序列如序列表的序列1所示。
全文摘要
本發明公開了一種HIV-1B亞型耐藥突變株及其構建方法和應用。本發明提供的的方法，是將HIV-1B亞型野生株的逆轉錄酶自N末端第369位氨基酸殘基由蘇氨酸突變為纈氨酸，獲得HIV-1B亞型耐藥突變株。本發明對于抗HIV藥物的篩選具有重大價值，進而對艾滋病的治療具有深遠影響。
文檔編號C12Q1/70GK102392039SQ20111034490
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者劉思揚, 劉永健, 莊道民, 李天一, 李敬云, 李林, 李韓平, 王曉林, 耿慶茂, 郭偉, 鮑作義 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所