專利名稱：一種微操作機器人系統批量細胞重定位方法
技術領域：
本發明屬于微操作機器人技術領域，是機器人技術的一種，特別涉及一種微操作機器人系統批量細胞重定位方法。
背景技術：
微操作機器人系統是機器人技術在微細操作領域的延伸[1]，微操作是指對微小物體的整體或部分進行的操作和處理，它處理問題的尺度一般在幾微米到幾百微米之間[2’3]。 近年來，隨著微操作研究的不斷深入，面向單目標的微操作技術日趨完善和成熟，多目標操作和批量目標操作已逐漸成為微操作的研究重點。在利用微操作機器人系統進行如批量細胞顯微注射的生物實驗時，通常需要在操作完成后，將細胞培養一段時間，再拿回顯微鏡下觀察。由于批量細胞分布廣泛且數量眾多，當培養皿再次置于顯微鏡下時，很難在顯微視野中將培養前后的細胞一一對應起來，無法具有針對性地觀察操作結果，對于實驗結果的定量統計與分析也無從展開。因此，當生物微操作進入批量操作階段后，批量細胞的重定位成為一個非常重要的問題。目前，與生物微操作相關的定位研究大都集中于細胞定位，主要工作為使用各種圖像處理方法或人工輔助方法實現批量細胞自動、半自動的定位，從而加大微操作的自動化程度。例如，文獻[4]實現了一種果蠅胚胎的自動注射系統，操作目標置于特制的玻璃滑塊上，每次注射前，需要對整個滑塊進行掃描，獲取批量胚胎的全局位置。在該系統進行全局定位時，首先對圖像進行二值化，獲取果蠅胚胎所在的候選區域，接下來，計算候選區域面積，如果該面積與果蠅胚胎大小匹配，則認為該區域為果蠅胚胎。文獻[5]提出了一種用于自動顯微注射的卵母細胞定位方法，該方法選擇一個卵母細胞的圖像作為模板，并通過計算模板與對應圖像的差方和，獲取圖像中卵母細胞的位置。文獻[6]利用微操作機器人系統進行了半自動的批量貼壁細胞注射，在注射過程中，首先需要操作者通過鼠標點擊的方式定位出當前視野中的所有注射目標，接下來，系統根據最短路徑算法自動計算出目標的操作順序，然后依次完成細胞注射。當前視野范圍內的目標注射完畢后，系統控制平臺自動移動到下一個待操作的視野范圍，重復上述過程。另一方面，對于一些體積較大的懸浮細胞，如胚胎或卵細胞等，可通過專用的細胞固定設備使細胞的分布具有結構化特征。例如，文獻[7]采用的胚胎固定設備如附圖1所示，該設備上均勻分布著小孔，每個小孔內固定一枚胚胎。實驗中，微操作機器人系統驅動胚胎固定設備運動，沿最優序列完成胚胎注射。這樣，在細胞培養后觀察實驗結果時，也可同樣借助這些專用固定設備實現批量細胞的重定位。然而，對于絕大多數的細胞，如貼壁細胞或體積較小的懸浮細胞，它們隨機分布在培養液中，無法形成結構化的操作空間，此時只能依靠人觀察實驗結果并進行粗略地對比， 很難針對某些特定細胞分析操作結果。因此，如何充分利用微操作機器人系統的特點，快速準確的實現批量細胞的重定位是現今微操作中亟需解決的問題。
發明內容
本發明的目的是解決生物微操作中的批量細胞重定位問題，針對培養前后細胞相對位置保持不變的情況，提出一種基于鄰近目標構型的多分辨率微操作機器人系統批量細胞重定位方法，該方法為利用微操作機器人系統分析生物實驗結果提供了前提條件。本發明提供的微操作機器人系統批量細胞重定位方法，所述細胞主要考慮細胞自身位置基本不動的情況(例如具有粘著性質的懸浮細胞或絕大多數貼壁細胞等)，在細胞培養前和培養后的兩次觀察中，考慮到一些細胞會在培養過程中由于死亡而消失，將培養前的視野定義為初始視野，將培養后的視野定義為當前視野，從當前視野中選取細胞，在初始視野中尋找其對應細胞，這些細胞必然存在于初始視野中；考慮到眾多細胞相對位置的復雜性，以及定位誤差的影響，本發明將批量細胞重定位方法分為以下兩步第1、鄰近細胞的局部匹配在當前視野中隨機選擇一個細胞作為中心目標，尋找鄰近中心目標的一組細胞， 通過鄰近目標構型在初始視野中匹配一組鄰近細胞；鄰近目標構型如附圖2所示，它是由相對位置固定的一組細胞構成的幾何圖形，本發明設定鄰近目標構型由三部分決定中心目標、中心目標與其它目標的間距、各目標與中心目標連線間的逆時針轉角。為了提高后續全局匹配的成功率，鄰近細胞的局部匹配應盡可能保證不丟失正確的匹配，匹配結果可能不唯一，對于一組鄰近細胞得到多個候選鄰近細胞組。通過鄰近目標構型在初始視野中匹配當前視野的一組鄰近細胞，匹配思路為首先在鄰近細胞中選擇一個細胞，與中心目標構成第一分支，并根據分支長度在初始視野中進行匹配；之后依次選取其它細胞與中心目標構成分支，計算分支距離、該分支到其它分支的逆時針轉角，逐漸縮小匹配范圍，直到該組細胞全部處理完。從上述思路可以看出，第一分支的選擇與細胞匹配順序非常重要，為了降低這些因素對匹配結果的影響，本發明不斷輪換第一分支，并在分支輪換后重新設定其它細胞的匹配順序。另外，為了盡可能不丟失正確的匹配，本發明允許部分分支匹配，并通過預先設定的分支匹配率，判斷匹配結果的可用性。附圖3給出了細胞組匹配的流程，具體步驟如下第11、在當前視野中確定中心目標c和其m個最鄰近細胞Cl，c2, L，cm，設已處理的細胞序列為B = Ib1, b2，L}，用NB表示序列中的元素個數；第1. 2、設定鄰近細胞的初始順序為Cl，C2, L，Cffl,初始化變量k = 1 (k表示細胞編號)；第1. 3、選擇第k個細胞Ck與中心目標c構成第一分支cck，初始化已處理序列B =Φ，并對其它細胞隨機排序，排序結果記為ck l，ck 2，I^ck 0lri)；第1. 4、在初始視野中搜索距離滿足dk = I cck|的候選細胞對；第1.5、若搜索成功，將細胞Ck加入序列B，初始化變量ρ = l,q= 1 (P表示隨機排序后細胞序列的細胞編號，q表示已處理序列B中細胞的編號)，繼續執行，否則轉到第 1. 11 步；第1. 6、在第1. 3步隨機排序后的細胞中取出第ρ個細胞Ck p，與中心細胞形成分支cck—p，在已處理的細胞序列B中取出第q個細胞Iv計算距離dkj) = I cckj I，以及cb,到 CCk p的逆時針轉角θ，基于之前匹配結果，在初始視野中搜索滿足θ的細胞；
第1. 7、若搜索成功，將細胞Ckjj加入序列B，轉到第1. 9步，否則繼續執行；第1. 8、令q = q+Ι，若q彡NB，轉到第1. 6步，考察分支CCk p與其它分支的夾角， 否則，在初始視野中找不到細胞ck—p的對應細胞，轉到第1. 9步；第1.9、令？ = p+l，q = 1，若P彡m_l，則轉到第1. 6步，處理下一個細胞，否則繼
續執行；第1. 10、計算分支匹配率NB/m，若匹配率大于設定閾值，匹配成功，保留候選鄰近細胞組，否則匹配不成功，繼續執行；第1. 11、令k = k+Ι，若k彡m，則轉到第1. 3步，處理下一個第一分支；否則處理完畢，保存候選鄰近細胞組。第2、批量細胞的全局重定位在重定位方法中引入多分辨率的思想，設定原始的初始視野和當前視野的分辨率層次為0 ；將鄰近細胞組作為一個整體，分辨率層次為1，通過鄰近目標構型考察各中心目標間的位置關系，此時只需針對候選鄰近細胞組的中心目標進行匹配，匹配結果有助于去除匹配錯誤的候選鄰近細胞組；接下來，將層次1中的中心目標再次作為一個整體繼續上述過程，分辨率層次為2 ；不斷在下一個分辨率層次中進行上一層次中心目標的匹配，直到構成細胞網狀結構，實現細胞的全局重定位。附圖4給出了細胞網狀結構的示意圖，圖中包括2個分辨率層次在層次0中，每個圓圈代表一組鄰近細胞，在層次1中，只考察鄰近細胞組的中心目標的位置關系，圖中填充圓圈為本層新的中心目標，取其4個最近鄰中心目標構成細胞網狀結構。具體步驟如下第2. 1、初始化分辨率級別L = O;第2. 2、在當前視野中隨機選擇η個細胞，作為最高分辨率層次L = O的中心目標。 為了盡可能代表細胞的全局信息，中心目標應廣泛分布，規定任意兩個中心目標間的距離必須大于d0 ；第2. 3、尋找所有中心目標的m個鄰近細胞，在初始視野中分別進行細胞組匹配， 得到候選鄰近細胞組，如果找不到候選目標組，則刪除該中心目標；第2.4、令1^ = 1^+1;第2. 5、在L級分辨率層次中，將上次參與匹配的中心目標作為當前視野和初始視野的新目標；第2. 6、在新目標中隨機選擇Ik個細胞，作為L級分辨率層次中的中心目標，任意兩個中心目標間的距離必須大于<；第2. 7、尋找所有中心目標的％個鄰近細胞，在初始視野中進行細胞組匹配；第2. 8、將L級分辨率層次中的構型關系反作用于(L-I)級匹配結果，刪除那些匹配錯誤的中心目標；第2. 9、若得到唯一的匹配結果，則構成全局細胞的網狀結構，結束處理，否則，轉到第2. 4步。本發明的優點和積極效果本發明提出并實現了一種基于鄰近目標構型的多分辨率重定位方法，該方法可快速、準確地將生物實驗中培養前后的細胞對應起來，為定量統計生物實驗結果提供了可能。 將該方法應用于微操作機器人系統中，可提高批量微操作的便捷性，拓展了微操作機器人的使用范圍。
圖1是參考文獻[7]中使用的胚胎固定設備；圖2是細胞鄰近目標構型的示意；圖3是鄰近細胞局部匹配的流程；圖4是細胞網狀結構的示意；圖5是通過微操作機器人系統采集到的批量細胞初始視野，已完成細胞的全局定位；圖6是通過微操作機器人系統采集到的批量細胞當前視野，和附圖5的初始視野有一定重合，已完成細胞的全局定位；圖7是對應表2中細胞的鄰近目標構型，A當前視野，B初始視野；圖8當前視野和初始視野中的全局細胞網狀結構，A當前視野，B初始視野；圖9是通過微操作機器人系統采集到的批量細胞當前視野，和附圖5的初始視野沒有重合，已完成細胞的全局定位；圖10是成功匹配的細胞組的鄰近目標構型，A當前視野，B初始視野。
具體實施例方式發明實驗裝置在實施例中，使用的實驗系統是NKTYMR微操作機器人系統，該系統通過電動操作平臺(參見ZL2003101066313號專利)帶動被觀察目標沿X、Y方向運動，移動精度2 μ m， 運動范圍為IOcmX 10cm，最快的移動速度為1500 μ m/s。系統配備Olympus CK40顯微鏡， 其物鏡包括4倍、10倍、20倍、40倍四種，局部顯微圖像的象素尺寸為768X576。本發明以人體血細胞切片作為實驗對象進行重定位實驗，實驗在40倍顯微物鏡下完成，通過微操作機器人采集局部顯微圖像并進行拼接，獲得含有批量血細胞的全局視野圖像(參見CN101596715號專利)。下面針對相同視野(可以匹配成功)和不同視野(無法匹配成功)兩種情況，給出批量細胞重定位的處理過程。實施例1 針對相同視野的批量細胞重定位針對相同視野的批量細胞重定位步驟如下1.將人體血細胞切片置于微操作機器人的電動操作平臺上，通過微操作機器人系統采集全局圖像作為初始視野，如附圖5所示，通過3 X 3個顯微視野拼接而成，全局圖像的尺寸為 1600pixelX Illlpixelo2.對初始視野圖像使用文獻[8]的方法進行細胞的全局定位，附圖5用白色圓圈標出了定位結果，共定位出細胞166個。3.小范圍隨機移動人體血細胞切片，保證移動前后的顯微視野具有一定的重合， 以模擬同一培養皿培養前后的情形；采集全局圖像作為當前視野，如附圖6所示，通過3X3 個顯微視野拼接而成，全局圖像的尺寸為1588pixel XlISOpixel。4.對當前視野圖像進行細胞的全局定位，附圖6用白色圓圈標出了定位結果，共定位出177個細胞。
5.在分辨率層次L = 0中，對當前視野和初始視野中的批量細胞進行鄰近細胞的局部匹配。隨機選擇附圖6中的45個細胞作為中心目標，確保中心目標間距大于Cltl = 150pixel ；設定尋找中心目標的5個最近鄰細胞，分支匹配率為0. 8，通過鄰近細胞構型在附圖5中分別進行細胞組匹配。在附圖6中，設定坐標位置為OO 31)的細胞為1號中心目標，下面以該細胞為例，說明細胞組匹配的詳細過程。a)在附圖6中，尋找1號中心目標的5個最近鄰細胞，坐標分別為(74 101)、(179 6)、(153165)、(221 108)、(82 252)，設定此順序為鄰近細胞的初始順序。b)選擇細胞(74 101)與中心目標構成第一分支，根據分支長度Cl1 = ccj = 88. 4，在附圖5中搜索滿足距離的候選細胞對，共得到278個候選細胞對，將細胞(74 101) 加入序列B。c)選擇細胞(179 6) (P = 1，q = 1)，與中心目標形成分支CC1」，根據分支長度(I1」 =Icc11I =161.0與轉角θ =6. 2，在附圖5中繼續搜索，可在附圖5中找到31個對應細胞，將細胞(179 6)加入序列B。d)同理，依次選擇(153 165) (p = 2，q = 1)、(221 108) (ρ = 3，q = 1)、(82 252) (p = 4，q= 1)等細胞，根據相應的分支長度和轉角在附圖5中進行搜索，分別得到27、38、 32個對應細胞。e)綜合上述搜索結果，分支匹配率大于0. 8的細胞組共有3個，分別為(912 392)(897 305) (0 0) (843 220) (765 237) (902 170)(971 1045)(1034 983)(918 901)(1087 907) (0 0)(1190 987)(1190 987)(1164 907)(1034 983) (1077 826) (1002 895) (0 0)其中，坐標(0 0)表示沒有搜索到該分支的對應細胞。依次處理所有中心目標，匹配結果如表1所示，在45個中心目標中，有觀個匹配成功。表2分別給出了編號為1、11、21、31、41號中心細胞的詳細匹配結果，附圖7給出了這些中心目標的鄰近細胞構型。從表和圖中可以看出，分辨率層次L = 0的匹配結果不唯一。表1細胞組匹配結果(L = 0)
權利要求
1. 一種微操作機器人系統批量細胞重定位方法，其特征在于所述細胞主要考慮細胞自身位置基本不動的情況，在細胞培養前和培養后的兩次觀察中，將培養前的視野定義為初始視野，將培養后的視野定義為當前視野，從當前視野中選取細胞，在初始視野中尋找其對應細胞，這些細胞必然存在于初始視野中；批量細胞重定位方法具體分為以下兩步 第1、鄰近細胞的局部匹配在當前視野中隨機選擇一個細胞作為中心目標，尋找鄰近中心目標的一組細胞，通過鄰近目標構型在初始視野中匹配一組鄰近細胞；鄰近細胞是由相對位置固定的一組細胞構成的幾何圖形，本發明設定鄰近目標構型由三部分決定中心目標、中心目標與其它目標的間距、各目標與中心目標連線間的逆時針轉角；為了提高后續全局匹配的成功率，鄰近細胞的局部匹配應盡可能保證不丟失正確的匹配，匹配結果可能不唯一，對于一組鄰近細胞得到多個候選鄰近細胞組；通過鄰近目標構型在初始視野中匹配當前視野的一組鄰近細胞， 匹配思路為首先在鄰近細胞中選擇一個細胞，與中心目標構成第一分支，并根據分支長度在初始視野中進行匹配；之后依次選取其它細胞與中心目標構成分支，計算分支距離、該分支到其它分支的逆時針轉角，逐漸縮小匹配范圍，直到該組細胞全部處理完；具體步驟如下第11、在當前視野中確定中心目標C和其m個最鄰近細胞Cl，C2, L，cm，設已處理的細胞序列為B = Ib1, b2，L}，用NB表示序列中的元素個數；第1. 2、設定鄰近細胞的初始順序為Cl，C2, L，Cm，初始化變量k = 1，k表示細胞編號； 第1. 3、選擇第k個細胞ck與中心目標c構成第一分支cck，初始化已處理序列B = Φ， 并對其它細胞隨機排序，排序結果記為ck—ck 2, L，Ck 0rt)；第1.4、在初始視野中搜索距離滿足dk= ccj的候選細胞對； 第1. 5、若搜索成功，將細胞Ck加入序列B，初始化變量ρ = l,q= l，p表示隨機排序后細胞序列的細胞編號，q表示已處理序列B中細胞的編號，繼續執行，否則轉到第1. 11步； 第1. 6、在第1. 3步隨機排序后的細胞中取出第ρ個細胞ckj)，與中心細胞形成分支CCk ρ,在已處理的細胞序列B中取出第q個細胞by計算距離dk p = I CCk p I，以及cb,到CCkjj的逆時針轉角θ，基于之前匹配結果，在初始視野中搜索滿足dkj)和θ的細胞； 第1. 7、若搜索成功，將細胞ckJ)加入序列B，轉到第1. 9步，否則繼續執行； 第1. 8、令q = q+Ι，若q彡NB,轉到第1. 6步，考察分支CCk p與其它分支的夾角，否則， 在初始視野中找不到細胞ck p的對應細胞，轉到第1. 9步；第1.9、令？ = p+l，q = 1，若P彡m-1，則轉到第1. 6步，處理下一個細胞，否則繼續執行；第1. 10、計算分支匹配率NB/m，若匹配率大于設定閾值，匹配成功，保留候選鄰近細胞組，否則匹配不成功，繼續執行；第1. 11、令k = k+Ι，若k彡m，則轉到第1.3步，處理下一個第一分支；否則處理完畢， 保存候選鄰近細胞組；第2、批量細胞的全局重定位在重定位方法中引入多分辨率的思想，設定原始的初始視野和當前視野的分辨率層次為0 ；將鄰近細胞組作為一個整體，分辨率層次為1，通過鄰近目標構型考察各中心目標間的位置關系，此時只需針對候選鄰近細胞組的中心目標進行匹配，匹配結果有助于去除匹配錯誤的候選鄰近細胞組；接下來，將層次1中的中心目標再次作為一個整體繼續上述過程，分辨率層次為2 ；不斷在下一個分辨率層次中進行上一層次中心目標的匹配，直到構成細胞網狀結構，實現細胞的全局重定位；具體步驟如下第2. 1、初始化分辨率級別L = O;第2. 2、在當前視野中隨機選擇η個細胞，作為最高分辨率層次L = 0的中心目標；為了盡可能代表細胞的全局信息，中心目標應廣泛分布，規定任意兩個中心目標間的距離必須大于d0 ；第2. 3、尋找所有中心目標的m個鄰近細胞，在初始視野中分別進行細胞組匹配，得到候選鄰近細胞組，如果找不到候選目標組，則刪除該中心目標；第 2. 4、令 L = L+1 ；第2. 5、在L級分辨率層次中，將上次參與匹配的中心目標作為當前視野和初始視野的新目標；第2. 6、在新目標中隨機選擇&個細胞，作為L級分辨率層次中的中心目標，任意兩個中心目標間的距離必須大于4；第2. 7、尋找所有中心目標的％個鄰近細胞，在初始視野中進行細胞組匹配；第2. 8、將L級分辨率層次中的構型關系反作用于(L-I)級匹配結果，刪除那些匹配錯誤的中心目標；第2. 9、若得到唯一的匹配結果，則構成全局細胞的網狀結構，結束處理，否則，轉到第 2. 4 步。
全文摘要
一種微操作機器人系統批量細胞重定位方法。該方法針對培養前后細胞相對位置保持不變的情況，考察批量細胞在多分辨率層次上的匹配情況。首先隨機選擇細胞作為中心目標，并通過中心目標的鄰近目標構型匹配一組鄰近細胞；之后，將一組鄰近細胞作為一個整體，考察多組細胞間的位置關系；接下來，在多個分辨率層次上進行整體匹配，直到形成多分辨率的細胞網狀結構，實現細胞的重定位。該方法具有匹配有效性和全局有效性，可同時為批量細胞建立對應關系。將該方法應用于微操作機器人系統，可提高批量微操作的便捷性，拓展了微操作機器人的使用范圍。
文檔編號C12Q1/02GK102492763SQ20111035922
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月14日 優先權日2011年11月14日
發明者盧桂章, 孫明竹, 趙新 申請人:南開大學