專利名稱：熒光pcr毛細管電泳檢測flt3-itd基因突變的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜區的序列內部串聯重復(internal tandem duplications, ITD)突變的試劑盒,特別是涉及以突光PCR毛細管電泳技術檢測臨床樣品中FLT3-1TD的試劑盒。由于本試劑盒對全血或骨髓樣品中的FLT3-1TD的檢測和分析具有很高的靈敏度和特異性，可廣泛應用于白血病判斷預后，指導治療和預測疾病復發等多個領域。
背景技術：
FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3)是III型受體酪氨酸激酶家族中的一員，其突變與白血病的發生密切相關。FLT3與其配體(FL)在造血干/祖細胞的增殖和分化中起重要的調節作用。FL與FLT3的細胞外結構域結合介導一系列細胞內信號傳導途徑，調節細胞增殖和活化。當FLT3發生基因突變時，可導致FLT3非配體依賴性磷酸化，破壞正常血細胞的增殖、分化與凋亡。FLT3突變有兩種形式:一種為發生在FLT3基因近膜區的序列內部串聯重復(internal tandem duplications, ITD),稱為 FLT3-1TD 突變,ITD 的大小和位置都存在多態性，典型的ITD位于第14外顯子，也可累及第14內含子和第15外顯子；一種為發生在酪氨酸激酶結構區域的點突變，稱為FLT3-TKD突變。目前有關于FLT3-1TD突變的研究表明FLT3-1TD突變最常出現在急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中，突變發生率為15% 35%，其次為骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndromes，MDS)，突變發生率約為2% 5%。FLT3-1TD在急性淋巴細胞白血病(ALL)患者中發生率極低(低于1% )，而在慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、多發性骨髓瘤、成人體細胞白血病中尚未發現FLT3-1TD突變。AML是一組起源 于造血干細胞的惡性血液病，具有高度異質性。在影響AML預后危險度的眾多因素中，細胞遺傳學已被認為是最重要的獨立預后因素，一些特異性染色體核型異常，不僅成為AML診斷中的重要標志物，并常被認為是判斷預后的標志。但是大約40 % 50 %的AML患者未檢測到染色體核型異常，這些患者預后變異較大，5年生存率24% 42%。所以尋找核型正常AML患者的預后分子標志成為人們關注的焦點。隨著分子遺傳學檢測方法的應用，學者們發現正常核型的AML患者在分子學水平上是存在異質性的，包括基因突變或某些特定基因的表達異常，為AML患者的進一步預后分級及分子靶向治療提供了依據FLT3基因突變是已發現的影響AML患者預后的分子標志之一，可作為AML患者預后不良的獨立指標。FLT3-1TD突變是AML患者中最常見的一種突變類型，約15% 35% AML病例存在FLT3-1TD突變，另外還有約7%的AML病例存在FLT3-TKD突變。但是目前大部分研究認為FLT3-TKD突變與AML預后無關，而FLT3-1TD突變與AML發病和發展密切相關，是一個重要的獨立預后因素。FLT3-1TD陽性患者具有較獨特的臨床特征，目前針對于此突變的靶向治療也已經進入不同的臨床試驗階段。而且，不同ITD患者的預后也存在差別，這與ITD-AR(internal tandem allelic ratio,內部串聯重復等位基因比例)值有關，即ITD:WT (FLT3野生型基因)比值，ITD-AR值增加可能導致預后不良，因此ITD-AR值也是AML患者的很強的獨立預后因素。MDS患者FLT3-1TD突變相比于沒有突變的患者，FLT3-1TD陽性患者轉為AML的概率有增高趨勢，進展為AML的時間有縮短趨勢，且總體生存期縮短，MDS轉為AML后，FLT3-1TD陽性率增高，因此FLT3-1TD是MDS轉化為AML的高危因素，為預后不良因素。綜上，FLT3-1TD可作為AML和MDS患者預后不良的獨立指標，對FLT3-1TD基因突變進行檢測可以幫助判斷預后，用于指導治療、判斷療效和疾病復發，對增加患者的長期生存率和生存質量有著非常重要的意義。FLT3-1TD基因突變檢測試劑盒(熒光PCR毛細管電泳法)提供一種快速檢測FLT3-1TD基因突變的方法。本方法根據PCR引物設計原理，分別在FLT3-1TD發生的14外顯子和15外顯子的兩端設計上下游引物，對于發生FLT3-1TD基因突變的DNA標本，將會出現大于正常片段的擴增產物。本方法通過毛細管電泳方法檢測PCR產物的長度來確定是否存在FLT3-1TD基因突變，并可以通過軟件分析計算ITD-AR值，以期為AML和MDS的臨床診斷、預后判斷及分子靶向治療提供理論依據。相比普通的瓊脂糖凝膠電泳，該方法更加靈敏，且能準確判斷突變條帶的片段大小及基因劑量。
發明內容
本發明的目的是提供一種使用熒光PCR毛細管電泳技術檢測白血病臨床樣品中FLT3-1TD基因突變的試劑盒。該試劑盒通過提取患者血液或骨髓的DNA，使用PCR方法擴增FLT3的ITD區域，然后使用熒光PCR毛細管電泳技術對ITD片段大小及劑量進行檢測。為了實現本發明，我們采用了以下技術方案:(I)使用適當的核酸分析軟件對已知的FLT3基因核苷酸序列進行同源性比較并找出同源區段的基礎上 ，進一步使用適當的引物設計軟件(例如Primer 3)選擇并設計寡核苷酸引物。由于所設計的引物在FLT3-1TD發生的14外顯子和15外顯子的兩端，而且與其他基因表達mRNA的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內切酶，所以避免了 FLT3-1TD檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準確度；(2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質液相層析法(FPLC)純化后進行氨解處理。同樣合成所需的引物序列，氨解處理后分別在其5’端標記作為熒光發生基團(報告基團)的6-FAM amidite0以FPLC層析法純化熒光標記的引物。然后，可使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20% )電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針；(3)從得自受試者的外周血或者骨髓中提取DNA，然后使用PCR反應體系將其擴增；(4)提供包括(a)待檢樣品，(b)耐熱DNA聚合酶和(C) 2_脫氧核苷三磷酸(dNTPs)的擴增反應體系，以及包括(d)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第一條互補鏈結合的正向引物，(e)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第二條互補鏈結合的反向引物。通過一次或多次聚合酶鏈反應擴增所說的靶多核苷酸；通過熒光PCR毛細管電泳技術以檢測靶多核苷酸的片段長度。本發明所提供的熒光PCR毛細管電泳技術檢測臨床樣品中FLT3-1TD的試劑盒包括=(I)PCR擴增反應液、陰性質控品、陽性質控品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和⑵分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，(3)以電泳法確定擴增片段的大小和基因劑量。本發明的一個優選實施方案，其中PCR擴增反應液包括5’端結合有熒光發生基團的正向引物、反向引物、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、PCR緩沖液和水，特征在于所使用的引物序列分別為:5’ -FAM-TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA -3，(SEQ ID NO:1)、5' -ATGGTGAGTACGTGCATTTTA-3' (SEQ ID NO:2)，其中 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 匹配在一起可以檢測FLT3-1TD。本發明的另一個優選實施方案，PCR擴增反應液中還可以使用的引物序列分別為:5’ -FAM-TTCATTATTCTTTCCTCTATCTGC-3’(SEQ ID NO:3)、5' -TGTTGCGTTCATCACTTTTC-3' (SEQ ID NO:4)，其中 SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4 匹配在一起可以檢測FLT3-1TD。本發明的另一 個優選實施方案，PCR擴增反應液中還可以使用的引物序列分別為:5’-FAM-AACTGCCTATTCCTAACTGACTC-3’ (SEQ ID NO:5)，5’-TCCATAAGCTGTTGCGTTC-3’ (SEQID NO:6)，其中 SEQ ID NO::5，SEQ ID NO:6 匹配在一起可以檢測 FLT3-1TD。本發明的另一個優選實施方案，PCR擴增反應液中還可以使用的引物序列分別為:5’-FAM-GCCAGCTACAGATGGTACAGG-3’ (SEQ ID NO:7)，5’-AGCATTTTGACGGCAACC-3’ (SEQ IDNO:8)，其中 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 匹配在一起可以檢測 FLT3-1TD。本發明的一個優選實施方案，其中PCR擴增反應液，特征在于每25微升的PCR緩沖液中加入 2 單位 Taq 酶，緩沖液包含 IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)、150mM KCl、3mM MgCl20本發明的另一個優選實施方案，其中PCR擴增反應體系由PCR緩沖液、耐熱DNA聚合酶、dNTPs，引物所組成，其特征在于引物的序列組合為SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2，或SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4，或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQ IDNO:8。本發明的一個優選實施方案，其中陰性質控品為去離子水，陽性質控品為攜帶有FLT3-1TD序列的重組質粒，質粒由上下游引物擴增的PCR產物通過市售的載體克隆構建而成，所使用的上下游引物的序列組合可以是SEQ ID NO:1和SEQ ID N0::2，或SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO::4，或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。本發明的一個優選實施方案，根據復合擴增產物片段大小來分析樣本中FLT3正常基因和FLT3-1TD和劑量變化，任何可以分離核酸片段大小的方法例如過濾，高效液相色譜，電泳，親和收集等方法均可用于本發明，其中通過凝膠電泳的方法進行分離并定量，優選使用毛細管電泳法分離FLT3正常基因和FLT3-1TD。本發明的一個優選實施方案，可以根據引物擴增產物的累計熒光值定量FLT3正常基因和FLT3-1TD的相對量，并通過計算FLT3正常基因和FLT3-1TD相對劑量來分析ITD-AR 值。本發明的一個優選 實施方案，其中試劑盒的待檢樣品可選自但不局限于白血病患者的臨床樣品。本發明的一個優選實施方案，其中試劑盒的靶多核苷酸來自FLT3基因。本發明的一個優選實施方案，其中試劑盒的核酸擴增系統是采用聚合酶鏈反應，并且所說的擴增反應循環是重復30-50次的聚合酶鏈反應循環。特別值得說明的是，為了確保本發明的FLT3-1TD檢測方法的準確性，我們還使用攜帶有FLT3-1TD序列的重組質粒作為陽性質控品。借助這些陽性質控品，使用本發明的試劑盒在相同條件下進行平行檢測，以進一步驗證本發明試劑盒的檢測精密度和準確性，并作為生產本發明試劑盒附加的質量控制標準。本技術與現有技術相比，優點為:①反應靈敏高，DNA濃度為IOng/μ I時即可檢出②結合毛細管電泳能對基因進行精確定量③能對突變型基因與野生型基因比例進行分析統計④在大量野生型基因存在下，亦能檢測出低頻突變型基因。
圖1顯示一個正常男性樣本多重擴增產物電泳圖。圖中片段大小約為330bp的藍色條帶為一個正常男性樣本的擴增產物。圖2顯示一個正常女性樣本多重擴增產物電泳圖。圖中片段大小約為330bp的藍色條帶為一個正常女性樣本的擴增產物。圖3顯示一個男性AML患者的FLT3-1TD樣本擴增產物電泳圖。圖中片段大小約為330bp和360bp的兩條藍色條帶，顯示一個男性AML患者的FLT3-1TD樣本擴增產物。圖4顯示一個女性AML患者的FLT3-1TD樣本擴增產物電泳圖。圖中片段大小約為330bp和360bp的兩條藍色條帶，顯示一個女性AML患者的FLT3-1TD樣本擴增產物。圖5顯示一個MDS患者樣本的FLT3-1TD的擴增產物的電泳圖。圖中片段大小約為330bp和360bp的兩條藍色條帶，顯示一個MDS患者樣本的FLT3-1TD的擴增產物的電泳圖。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。
實施例1:檢測試劑盒及其使用1、制備包括下列組成成分的試劑盒:ITD PCR反應液A(內含SEQ ID NO:1和SEQID NO::2) (500 μ I/ 管)、ITD PCR 反應液 B (75 μ I/ 管)、ITD 陽性質控品(50 μ I/ 管)、陰性質控品(δΟμΙ/管)。2、標本米集、運送和保存:(I)標本采集:標本為外周血或骨髓。抽取受檢者靜脈血或骨髓3_5ml，注入含EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5 10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻。(2)保存:可立即檢測，4°C保存一周，_20°C保存期可達一年。(3)運輸:標本運送應采用0°C冰壺。3、檢測步驟和結果分析:DNA提取建議使用Qiagen DNA提取試劑盒。(I)取200 μ I外周血或骨髓至1.5ml離心管。(2)加入20 μ I的蛋白酶。(3)加入 200 μ I 的 Buffer AL，振蕩 15 秒。(4)56°C溫育 10 分鐘。(5)加入200 μ I乙醇,振蕩15秒。
(6)將混合液吸入 QIAamp Mini spin column,6000g 離心 I 分鐘。(7)將內柱放入一個新的套管中，加入500 μ I的Buffer AWl，6000g離心I分鐘。(8)將內柱放入一個新的套管中，加入500 μ I的Buffer AW2，6000g離心I分鐘。(9)將內柱放入一個新的1.5ml離心管中，最大離心速度離心I分鐘。(10)加入200 μ I的Buffer AE，室溫靜置I分鐘，6000g離心I分鐘。(11)得到 200 μ I DNA 溶液QF-PCR 操作步驟:1、對于每一個PCR反應體系，混合以下成分到總體積為25ul。設置陰陽性對照。
權利要求
1.一種檢測樣品中FLT3-1TD的試劑盒，試劑盒包括:(I) PCR擴增反應液、陰性質控品、陽性質控品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中PCR擴增反應液包括5 ’端結合有熒光發生基團的正向引物、反向引物、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、PCR緩沖液和水，(3)以電泳法確定擴增片段的大小和基因劑量，其特征在于所使用的正反向引物的序列可以為:5，-FAM-TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA-3\5/ -ATGGTGAGTACGTGCATTTTA-3'；5，-FAM-TTCATTATTCTTTCCTCTATCTGC-3\5/ -TGTTGCGTTCATCACTTTTC-3'；5’ -FAM-AACTGCCTATTCCTAACTGACTC-3’、5’ -TCCATAAGCTGTTGCGTTC-3’ ；5’ -FAM-GCCAGCTACAGATGGTACAGG-3'5’ -AGCATTTTGACGGCAACC-3’。
2.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR緩沖液包含IOmMTris-HCl (pH8.0)、150mM KCl、3mM MgCl2，每25微升的PCR緩沖液中加入2單位Taq酶。
3.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR擴增反應體系由PCR緩沖液、耐熱DNA聚合酶、dNTPs，引物所組成，其特征在于引物的序列組合為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4，或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQID NO:8。
4.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于陽性質控品為攜帶有FLT3-1TD序列的重組質粒，質粒由上下游引物擴增的PCR產物通過市售的載體克隆構建而成，所使用的上下游引物的序列組合可以是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4，或SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
5.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于試劑盒的核酸擴增系統是采用聚合酶鏈反應，并且所說的擴增反應循環是重復30-50次的聚合酶鏈反應循環。
6.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于所檢測樣品為全血或骨髓等白血病臨床樣品O
全文摘要
本發明涉及檢測FLT3(Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜區的序列內部串聯重復(internal tandem duplications，ITD)突變的試劑盒，特別是涉及以熒光PCR毛細管電泳技術檢測臨床樣品中FLT3-ITD的試劑盒。本試劑盒主要包括PCR擴增反應液、陰性質控品、陽性質控品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒、以電泳法確定擴增片段的大小和基因劑量。本試劑盒對全血或骨髓樣品中的FLT3-ITD的檢測和分析具有很高的靈敏度和特異性，可廣泛應用于白血病判斷預后，指導治療和預測疾病復發等多個領域。
文檔編號C12Q1/68GK103103251SQ20111036170
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者李明, 陳嘉昌, 陳華云, 高云, 程鋼, 何蘊韶 申請人:中山大學達安基因股份有限公司