專利名稱：豬連環蛋白α樣1基因CTNNAL1作為豬產仔數性狀的遺傳標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及豬遺傳標記制備技術領域，具體涉及一種豬連環蛋白a樣1CTNNAL1基因作為豬產仔數性狀的遺標記及應用，它包括豬連環蛋白a樣I (catenin(cadherin-associated protein), alpha-like I, CTNNALI)基因突變位點的檢測方法與應用。
背景技術：
豬的產仔數性狀是屬于低遺傳力的限性性狀，性狀遺傳力只有0.10，采用常規選擇遺傳進展有限。近年來分子標記輔助選擇為產仔數性狀的遺傳改良提供了新的機遇。分子標記篩選主要有候選基因法和基因組掃描法。最早用候選基因法分離的豬產仔數性狀基因或標記是雌激素受體基因(Estrogen receptor, ESR)。Rothschild研究組(1994.A major gene for litter size in pigs.Proc 5th World Congr Genet Appl LivestProd, Guelph，Canada，1994，21:225-228)研究發現ESR位點B等位基因可以顯著提高梅山豬合成系的產仔數1.15頭/窩，但通過基因組掃描法卻沒有發現在其附近存在產仔數性狀上的QTL。另外一種是基因組掃描法，但由于獲得具有產仔數記錄的資源家系建系難，時間長、成本高，因此對產仔數性狀QTL定位的報道相對少。Rathje等(1997.Evidencefor quantitative trait loci affecting ovulation rate in pigs.Journal of AnimalScience.75:1486-1494)和Milan等(1998.Current status of QTL detection in LargeWhiteXMeishan crosses in France.Proc 6th World Congr Genet Appl Livest Prod，Armidale, Australia，26:414-417)報道了 8號染色體上一個影響排卵率和單胎產仔數的大效應QTL。Zhang 等(1998.1dentification and chromosomal localization of CTNNALI,a novel protein homologous to alpha-catenin.Genomics, 54 (I):149-154.)通過基因文庫的掃描，發現了一個和人類的a連環蛋白同源的基因。這個基因的cDNA長約2450bp，編碼長約734個氨基酸的蛋白質。這個基因被定名為CTNNAL1 (鈣粘蛋白類似物)。Park 等(2002.Association of Lbc Rho guanine nucleotide exchange factor withalpha-eatenin-related protein， alpha-catulin/CTNNAL1, supports serum responsefactor activation.J Biol Chem，277(47):45361-45370)通過比對，發現 CTNNAL1 編碼的a-Catulin和CTNNAl編碼的a E-catenin的同源性超過40 %以上，和CTNNA2編碼的a N-catenin的同源性在50%以上。a -catenin是組成I丐粘蛋白_連環蛋白復合體的關鍵部分，對于鈣粘蛋白的粘附活性是必須的，介導大多數脊椎動物的細胞間的黏附作用(Aberle et al.Cadherin-catenin complex:protein interactions and theirimplications for cadherin function.J Cell Biochem，1996，61:514-523)，跨膜I丐粘蛋白的黏附作用是由胞漿中的鈣粘蛋白和胞內的連環蛋白(a，￠)組成的復合體來實現的。此外，a-catenin 還和生 長發育通路有關(Barth et al.Cadherins, catenins and APCprotein:interplay between cytoskeletal complexes and signaling pathways.CurrOpin Cell Biol, 1997,9:683-690)。a-catenin在wnt誘導的細胞分化中起下調的作用，抑制P-catenin介導的轉錄激活。Buimer 等(2008.Seven Placental Transcripts CharacterizeHELLP-syndrome.Placenta,2008,29(5):444-453)發現在 HELLP(hemolysis, elevatedliver enzymes, and low platelets syndrome)綜合癥中 CTNNALI 是下調表達的，HELLP綜合癥主要表現為溶血，肝酶升高以及血小板減少的癥狀這種癥狀是與孕產婦和圍產兒的死亡率有很大的關聯性。此外，在我們前期研究中CTNNAL1基因在大白豬和中國二花臉豬排卵前卵泡中差異表達(Sun et al.Microarray profiling for differential geneexpression in PMSG—hCG stimulated preovulatory ovarian follicles of ChineseTaihu and Large White sows.BMC Genomics,2011,12(I):111)因此我們將CTNNAL1基因作為豬產仔數性狀候選基因，研究該基因多態性，并與產仔數性狀進行關聯分析，為產仔數性狀改良提供新的標記。
發明內容
本發明的目的在于獲得一種豬產仔數性狀的遺傳標記，克隆豬CTNNAL1基因序列，尋找突變位點以及基因多態性的檢測方法，為豬的標記輔助提供一種選擇方法。本發明的技術方案如下:本發明獲得了一種豬產仔數性狀的遺傳標記，它是大白豬、太湖豬CTNNAL1基因的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3所示；通過上述序列進行ClustalW比對提供了位于 該擴增片段646堿基處存在I個C/G突變(如圖1所示)，導致PCR-Alu1-RFLP多態性。申請人:設計了一種擴增豬CTNNAL1基因cDNA序列的引物對，其核苷酸序列如SEQID NO:4 和 SEQID NO:5 所示。申請人:提供了一種篩選豬產仔數性狀的遺傳標記的方法，按照以下步驟:從豬血液中提取基因組DNA。登錄NCBI數據庫中下載人的相應基因序列，以人CTNNALI mRNA序列作為種子序列，利用NCBI網站EST-others搜尋豬的同源EST。選擇同源性大于80%的豬的ESTs，利用電子克隆，將獲得的ESTs進行拼接，并以此作為靶序列，設計特異引物(該引物的序列如序列表SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示)。以大白豬和太湖豬的cDNA為模板進行擴增，對PCR產物回收和克隆測序，得到如序列表SEQ ID NO: 1-3所示的基因片段；進而進行序列Clustalw比對，篩查SNP (如圖1所示)，在該序列的646堿基處(即，該基因第14外顯子43bp處)發現C/G等位基因突變，此突變引起了氨基酸發生改變，使得由CAG編碼的Gln (谷氨酰胺)變成了 CAC編碼的His (組氨酸)，該突變表現了大白豬和太湖豬種間差異，并引起了 AluI酶切位點(AG丨CT)多態性。然后以Ensembl上豬CTNNAL1基因序列及豬CTNNAL1基因673bp的cDNA片段SEQID NO =1-SEQ ID NO:3序列為靶序列，設計引物，該引物的序列如序列表SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。擴增區域包括豬CTNNAL1基因第14外顯子的416bp的基因組核苷酸序列(如圖2所示),然后進行AluI酶切，SNP位點檢測如圖3所示。本發明提供了鑒定上述序列C/G變異的AluI_RFLP(限制性內切酶酶切片段長度多態性)基因型分型方法。其引物序列分別如序列表SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，在豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR擴增片段AluI酶切分型及檢測。進一步，本發明提供了利用AIu1-RFLP方法確定豬不同基因型個體與產仔數性狀間的關聯分析的應用。更詳細的發明方案見《具體實施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO:1:是擴增的國外血緣豬種“大白豬個體I”的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO:2:是擴增的中國血緣豬種“太湖豬個體I ”的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO:3:是擴增的中國血緣豬種“太湖豬個體2”的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO:4:是制備SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3特異基因片段所用的正向引物。序列表SEQ ID NO:5:是制備SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:3特異基因片段所用的反向引物。序列表SEQ ID NO:6:是實施豬CTNNAL1基因第14外顯子C/G變異AIu1-RFLP (限制性內切酶酶切片段長度多態性)基因型分型方法的正向引物。序列表SEQ ID NO:7:是實施豬CTNNAL1基因第14外顯子C/G變異AIu1-RFLP (限制性內切酶酶切片段長度多態性)基因型分型方法的反向引物。圖1:是大白豬和太湖豬CTNNAL1基因序列片段比對結果和SNP位點。圖2:是包括豬CTNNAL1基因序列片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜。瓊脂糖凝膠濃度為
1.5%;圖中:M 泳道為 DNA Marker DL2, 000 ;泳道 1-7 為序列表 SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7所示引物在不同豬種中的擴增片段，片段大小為416bp。圖3:是豬CTNNAL1基因片段AIu1-RFLP檢測結果。瓊脂糖膠濃度為2.0%;圖中:泳道M為DL 2000Markers ;1、3、4泳道為CG基因型，片段大小分別為416bp，238bp，178bp ；
2、6泳道為GG基因型，片段大小為238bp，178bp；5泳道為CC基因型，片段大小為416bp。圖4:是大白豬個體I的核苷酸序列。在該序列的的646bp處存在I個等位基因突變(C/G)。圖5:是太湖豬個體I的核苷酸序列。在該序列的的646bp處存在I個等位基因突變(C/G)。圖6:是太湖豬個體2的核苷酸序列。在該序列的的646bp處存在I個等位基因突變(C/G)。根據本發明的方法可以用于開發成診斷方法或試劑盒，從而在育種計劃中利用這些方法來選擇攜帶有利等位基因的豬，從而可以達到較好的選擇效果。
具體實施例方式實施例1:豬CTNNALI基因片段的獲得及多態性檢測方法的建立登錄NCBI數據庫中下載人 的相應基因序列，以人CTNNAL1 mRNA序列作為種子序列，利用NCBI網站EST-others搜尋豬的同源EST。選擇同源性大于80%的豬的ESTs，利用電子克隆，將獲得的ESTs進行拼接，并以此作為靶序列，利用Primerf軟件在線設計引物。引物序列如序列表SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示，如下:正向引物CTNNAL1-F:CCATGCTGATCATGTGGTTC, CTNNAL1-R:CAAACCCTCCTCAGCAAAAA。PCR 擴增包含 CTNNAL1 基因第14外顯子片段。PCR反應體系為25iU，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200iimol/L,每條引物濃度為 0.4 u mol/L, 3U 的 Taq DNA 聚合酶(Biostar International, Canada),加去離子水至總體積25iU ；PCR反應程序:94°C預變性4min ;然后94°C變性50s、64°C退火50s、72°C延伸lmin，共35個循環；最后72°C延伸lOmin。PCR產物經純化(UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術有限公司)，克隆后，進行序列測定，序列測定由上海生工生物工程技術有限公司完成。不同豬種的PCR產物序列經ClustalW軟件進行序列比對，序列間比對結果見圖1。上述擴增片段大小為673bp，位于該片段646堿基處(即，位于該基因第14外顯子的第43個堿基)C/G突變(見圖4-6)。該處突變引起了氨基酸發生改變，使得由CAG編碼的Gln (谷氨酰胺)變成了 CAC編碼的His (組氨酸)，該變異表現了大白豬和太湖豬種間差異，并引起了 A/uI酶切位點(AG丨CT)多態性。然后以Ensembl上豬CTNNAL1基因序列及豬CTNNAL1基因673bp的cDNA片段SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:3序列為靶序列，設計引物，該引物的序列如序列表SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7 所示，序列如下:正向引物 CTNNALl-SNP-F:CGGGTGTGACCCTAAAAAGA,CTNNAL1-SNP-R:AAGCGCCACAAAATGCTACT。擴增區域包括豬 CTNNALI 基因第 14 外顯子的416bp的基因組核苷酸序列，如圖2所示。PCR擴增，取8.5 ill PCR產物加入0.5 ill (10U/U I)限制性內切酶和Iyl 10 X buffer (含10 X BSA)，37 °C AluI酶切4h，取5 ill酶切產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察并記錄酶切結果，如圖3所示:此擴增片段大小為416bp，在238bp處有AluI酶切位點，若該處堿基為C，則不存在AluI酶切位點，用AluI酶切檢測結果有416bp —條片段(C等位基因)，當該位點為G時，結果導致一個AluI酶切位點的產生，酶切得到兩個片段，長度分別為238bp和178bp(G等位基因)。實施例2:本發明制備的遺傳標記在不同豬群中的多態性分布豬基因組DNA的提取(樣本見表I所示)方法參照熊遠著《豬生化及分子遺傳實驗導論》中國農業出版社，1999介紹的方法進行。
在11個群體豬，其中7個國外血緣豬群和3個中國地方血緣豬群、I個合成系(中國瘦肉豬新品系DIV系(華中農業大學和湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所共同培育，在中國大規模推廣應用的瘦肉型新品種豬)中檢測豬CTNNAL1基因PCR-Alu1-RFLP多態性，檢測結果如表I所示。結果表明:只有在大白豬、湖北白豬DIV以及淮南豬中存在3種基因型；但是在通城豬等7個群體中沒有檢測CC型，可能C等位基因純合個體會在胚胎發育早期死亡。在所有檢測的11個群體中，G等位基因頻率為0.54-1.00，G等位基因為優勢等位基因(見表I)。表I豬CTNNAL1基因PCR-Alu1-RFLP在不同豬種中的分布結果
權利要求
1.一種豬產仔數性狀的遺傳標記，它是豬連環蛋白a樣I基因CTNNAL1第14外顯子的特異基因片段，它們的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO=USEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示,在序列表SEQ ID NO:USEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3序列646位堿基處有一個堿基突變C/G，導致AIu1-RFLP多態性。
2.擴增如權利要求1所述的遺傳標記的特異引物，其核苷酸序列如序列表SEQID NO:6 和 SEQ ID NO:7 所示。
3.一種篩選豬產仔數性狀的遺傳標記的方法，按照以下步驟: 從豬血液中提取基因組DNA，根據豬CTNNAL1基因序列和序列表SEQ ID NO:1至SEQID NO:3所示的序列設計引物，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6和SEQID NO:7所示，用該引物在豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR擴增片段AluI酶切分型及檢測。
4.權利要求1所述遺傳標記在在豬產仔數性狀標記輔助選擇中的應用。
5.權利要求2所述的引物在`豬產仔數性狀標記輔助選擇中的應用。
全文摘要
本發明屬于豬遺傳標記制備與應用技術領域。具體涉及豬連環蛋白α樣1CTNNAL1編碼基因第14外顯子的單核苷酸多態性(SNP)檢測技術領域。其步驟包括從豬血液中提取基因組DNA，設計引物，PCR擴增，PCR產物克隆、測序，序列比較分析，單核苷酸多態性檢測，標記與產仔數性狀間相關性分析。本發明公開了豬CTNNAL1基因第14外顯子的DNA序列和SNP分型的檢測技術。本發明的遺傳標記的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示，在序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3序列646位堿基處有一個堿基突變C/G，并導致AluI-RFLP多態性。本發明公開了該遺傳標記的制備方法及其在豬產仔數標記輔助選擇中的應用。
文檔編號C12N15/11GK103114093SQ20111036180
公開日2013年5月22日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者李鳳娥, 孫曉杰, 梅書棋, 陶虎, 彭先文, 蘇麗娜, 蔣思文, 鄧昌彥, 熊遠著 申請人:華中農業大學