專利名稱：一種玉米苗期根腐病生防木霉菌的篩選方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，特別涉及一種玉米苗期根腐病生防木霉菌的篩選方法。(ニ)
背景技術：
玉米苗期根腐病是ー種分布廣、危害嚴重、病原菌種類繁多和防治較困難的世界性病害。該病是由多種病原菌復合侵染引起，主要危害玉米的根及莖基部，引起根系及莖基部受害部位變褐壞死，影響作物對水分和養分的吸收，地上部葉片邊緣出現黃褐色云紋狀斑。 玉米苗期根腐病的癥狀表現為在玉米3-6葉期，地上部生長受到抑制，株型矮小，下部葉片從葉緣開始出現黃化癥狀，進而葉片或整株變黃，或出現褐色斑；胚根和須根上有褐色病斑，或腐爛，或縊縮。輕者可逐漸恢復，但是生長趨勢明顯減弱，影響產量，重者死亡，造成缺苗斷壟。國外報道引起玉米根腐病的病原菌有禾生腐霉菌、禾谷鐮刀菌、蠕孢菌、串珠鐮刀菌、尖抱鐮刀菌、立枯絲核菌等，主要病原菌為腐霉菌和鐮刀菌。國內報道的病原菌有 串珠鐮刀菌、串珠鐮刀菌膠孢變種、禾谷鐮刀菌、蠕孢菌、腐霉菌、絲核菌等。吉林省的優勢種為鐮刀菌占66-80%，絲核菌占5%-10% ；浙江省串珠鐮刀菌占49%-79. 7%，腐霉菌的分離頻率也較高；河北省以鐮刀菌為主，立枯絲核菌為輔。總的看來，玉米根腐病的主要病原菌為串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌，不同地區病原菌組成因生態環境的不同而略有差異。玉米苗期根腐病的初侵染源為種子和土壌中的病原菌，在適宜的條件下侵入植株地下部，引起發病。傳統的防治方法主要是化學藥劑拌種。但該防治方法存在較多缺點一是化學藥劑只能殺死種子及周圍的病原菌，而對稍遠ー些的病原菌卻無能為力，而且在殺死病原菌的同吋，也將有益微生物無選擇地殺死；ニ是藥劑防治，藥量大，毒性大，污染重， 長期使用會導致病原菌產生抗藥性，使化學藥劑失去了原有的防治作用。木霉菌作為ー種生防菌，可以防治很多經濟作物的主要病害，對發生在根部和葉部病害都有很好的防治效果，近年來對儲藏期病害也有研究。木霉菌對ー些土傳植物病原菌的防治具有很好的效果，這些病原菌包括絲核菌屬(脅辦^如/？む)、小核菌屬
腫)、鐮刀菌屬(R/sarium)、腐霉屬(Pythium)、疫霉屬 iPhytophthora)等，并且木霉菌的不同種、同種不同菌株甚至同一菌株的不同后代個體都存在著拮抗性的差異及拮抗對象種類上的差別。作為普遍存在并具有豐富資源的拮抗微生物，在土傳病害的生物防治中具有重要的地位。木霉菌的作用機制幾乎包括了所有可能機制，并因此而受到廣泛的關注，也是其用途廣泛、效果突出的重要原因。據報道，木霉菌至少有如下幾種作用機制競爭作用、抗生作用、溶菌作用、寄生作用、誘導抗性、協同拮抗作用。自從1932年Wfeindling發現木霉菌對植物病原真菌有拮抗作用，70多年來國外專家、學者對木霉菌生物藥劑的開發做了許多嘗試和深入的研究。美國的Top shield(哈茨木霉T2》、以色列的Trichodex (哈茨木霉T39)、新西蘭的木霉制劑Trichodry和 Trichoflow、俄羅斯Kolombet博士研制的木霉制劑(Mycol)、韓國Chung教授研究開發的木霉制劑YC458、西班牙Monte教授采用哈茨木霉和綠色木霉混合開發的生防制劑TUSAL，這些制劑在植物病害防治中都取得很好的防治效果和明顯的增產作用。近年來，國內的科研人員也把生物防治的注意力轉移到拮抗木霉菌上來，并使其逐步在田間得到應用。丁萬隆等用木霉制劑防治西洋參立枯病，李良做了哈茨木霉T. harzianum防治茉莉白絹病,邪云章等用綠色木霉T. vi ride防治人參根腐病都取得了一定的效果。但現有的木霉菌在防治玉米苗期根腐病方面防病效果不佳，保苗率較低，應用效果不理想。
發明內容本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種低成本、簡便易操作的玉米苗期根腐病生防木霉菌的篩選方法。
本發明是通過如下技術方案實現的一種玉米苗期根腐病生防木霉菌的篩選方法，其特征在于包括如下步驟(1)土樣采集選取玉米種植田塊，每個地塊5點取樣，每取樣點沿玉米根圍從不同位置取樣3次，取土深度0-20cm，同一田塊5點取樣后將其混合均勻裝入無菌塑料袋；(2)土壤溶液的制備將采集到的土樣敲碎、風干后過篩，取充分混勻的土樣IOg于容量瓶中，加無菌水定容至IOOmL,振動30min,取IOmL 土壤懸浮液加入90mL無菌水中，依次稀釋至10 —6倍,充分搖勻后用于分離；(3)木霉菌的分離純化將稀釋后的土壤懸浮液在振蕩器上振蕩10-20S，吸取ImL土壤懸浮液至LB瓊脂平板中央，用涂布棒涂勻，并做好濃度標記，涂好的LB瓊脂平板靜置5min，使土壤懸浮液滲透進LB 瓊脂平板中，將涂好的LB瓊脂平板倒置于28°C恒溫箱中培養，每濃度重復3次，待LB瓊脂平板上長出菌落后，挑取菌落邊緣幼嫩菌絲到PDA平板上反復純化，從形成的單個分散的菌落上移植菌絲體于PDA斜面上冷凍保存；(4)木霉菌的篩選將分離的木霉菌株用PDA培養基復篩后即得。
PDA培養基復篩屬于現有技術，不再詳述。
本發明玉米苗期根腐病生防木霉菌的篩選方法的有益效果是方法簡便易操作， 成本較低；篩選出的木霉菌制備得到木霉菌劑貯存期長，能有效貯存I年以上，防病效果佳，出苗率提高約45%，存活率比對照高50%，保苗效果好，感病指數降低60%，對人畜和生態環境無害，無殘留，不產生抗藥性，原料來源廣，生產成本低于化學農藥多菌靈等，還可以變廢為寶，具有很好的經濟效益和社會效益。
下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
附圖I為不同載體對木霉菌產孢量的影響圖。
具體實施方式
(A)玉米苗期根腐病病原菌的分離鑒定(I )方法①病原菌分離玉米苗期根腐病病原菌分離將玉米苗根部用清水沖洗干凈，剪取根部病健交界處組織0. 5cm左右，用常規方法進行組織表面消毒后，分別放置在PDA和CMA培養基上，觀で培養。5天后對分離物進行初歩鑒定。如果是鐮孢菌iFusarium 577/7.)則轉到F8液體培養基上，待其產生大型分生孢子后，挑取單孢進ー步純化，供菌種鑒定及測試用。PDA培養基馬鈴薯去皮200g，切碎加水IOOOmL,煮沸20min，紗布過濾，濾液補足至IOOOmL,加葡萄糖20g，瓊脂15g，加熱至熔化；
CMA培養基取60g玉米粒放入水中煮lh，過濾，取液體加入20g瓊脂，20g葡萄糖，加水至IOOOmL, pH=7. 0，分裝，滅菌；
F8 液體培養基KH2PO4 2g ；KNO3 2g ；KCl Ig ；MgSO4 Ig ；FeSO4, FeCl3、MnSO4, ZnSO4 各 0. 0002g ；Sug Ig ；水 IOOOmL ；pH=5. 0，分裝，滅菌。②病原菌鑒定
將分離物依據魏景超(真菌鑒定手冊》和Maleolme. shurtleff.的《eompendium of corn disease)) (1980)所描述的無性器官形態特征及培養形狀鑒定。(II)結果與分析
玉米苗期根腐病病原菌種類
從玉米苗期根腐病病株分離得到的病原菌有串珠鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、尖抱鐮孢菌、腐霉菌、立枯絲核菌等，其中串珠鐮孢菌的分離頻率最高，分別為43. 66% ；禾谷鐮孢菌的分離頻率為13. 57% ；其它病原菌的分離頻率均在5%以下(表1)。結果說明，引起玉米苗期根腐病的主要病原菌為串珠鐮孢菌和禾谷鐮孢菌。表1玉米苗期根腐病病原菌分離頻率
權利要求
1. 一種玉米苗期根腐病生防木霉菌的篩選方法，其特征在于包括如下步驟(1)土樣采集選取玉米種植田塊，每個地塊5點取樣，每取樣點沿玉米根圍從不同位置取樣3次，取土深度0-20cm，同一田塊5點取樣后將其混合均勻裝入無菌塑料袋；(2)土壤溶液的制備將采集到的土樣敲碎、風干后過篩，取充分混勻的土樣IOg于容量瓶中，加無菌水定容至IOOmL,振動30min,取IOmL 土壤懸浮液加入90mL無菌水中，依次稀釋至10 —6倍,充分搖勻后用于分離；(3)木霉菌的分離純化將稀釋后的土壤懸浮液在振蕩器上振蕩10-20S，吸取ImL土壤懸浮液至LB瓊脂平板中央，用涂布棒涂勻，并做好濃度標記，涂好的LB瓊脂平板靜置5min，使土壤懸浮液滲透進LB 瓊脂平板中，將涂好的LB瓊脂平板倒置于28°C恒溫箱中培養，每濃度重復3次，待LB瓊脂平板上長出菌落后，挑取菌落邊緣幼嫩菌絲到PDA平板上反復純化，從形成的單個分散的菌落上移植菌絲體于PDA斜面上冷凍保存；(4)木霉菌的篩選將分離的木霉菌株用PDA培養基復篩后即得。
全文摘要
本發明涉及生物領域，特別公開了一種玉米苗期根腐病生防木霉菌的篩選方法。該玉米苗期根腐病生防木霉菌的篩選方法，其特征在于包括如下步驟(1)土樣采集；(2)土壤溶液的制備；(3)木霉菌的分離純化；(4)木霉菌的篩選。本發明玉米苗期根腐病生防木霉菌的篩選方法的有益效果是方法簡便易操作，成本較低；篩選出的木霉菌制備得到木霉菌劑貯存期長，能有效貯存1年以上，防病效果佳，出苗率提高約45%，存活率比對照高50%，保苗效果好，感病指數降低60%，對人畜和生態環境無害，無殘留，不產生抗藥性，原料來源廣，生產成本低于化學農藥多菌靈等，還可以變廢為寶，具有很好的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12N1/14GK102533564SQ20111037110
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月21日 優先權日2011年11月21日
發明者劉治剛, 寧蕾, 趙春海 申請人:濱州職業學院