專利名稱：利用未萌發玉米種子轉化外源基因的方法
利用未萌發玉米種子轉化外源基因的方法技術領域
本發明屬于農業種植技術領域，涉及一種遺傳轉化技術。
技術背景
植物遺傳轉化是指把外源核酸片段轉入植物細胞特定部分(細胞核、葉綠體等)， 時期在受體細胞或再生植株中穩定表達，并通過有性或無性繁殖傳遞給后代。利用遺傳轉化技術，可打破種屬間的生殖隔離，創造出常規育種技術很難得到的生物新品種。
迄今為止，植物遺傳轉化技術可分為三大技術體系，即農桿菌介導的遺傳轉化、基因槍轟擊法和原生質體為受體的遺傳轉化。自1983年Zambrysk等采用農桿菌轉化獲得世界上第一株轉基因植株以來，眾多研究表明，根瘤農桿菌Ti質粒轉化系統是目前機理最清晰、技術最成熟的遺傳轉化技術。農桿菌介導的遺傳轉化，已被廣泛應用在擬南芥、煙草、玉米、水稻、大豆、棉花、小麥、大麥、向日葵、花生等眾多植物的轉基因研究中。但其仍未擺脫其轉化率低，重復性差，需要無菌操作等缺點。特別是玉米的農桿菌介導的遺傳轉化，不但遇到上述問題，而且其轉化效率還很大程度的依賴于受體材料的基因型和取材部位及取材時間。造成了轉基因玉米研發的成本高昂的現狀。近年來，研究人員對玉米遺傳轉化技術進行了探索，建立了包括芽尖轉化技術、胚芽鞘注射法轉化技術和合子轉化技術等玉米遺傳轉化技術體系，但是仍未完全解決玉米遺傳轉化中依賴無菌操作、受取材時間限制、操作步驟復雜要求精度高等問題。如何改進玉米遺傳轉化技術，使其適合規模化和產業化研發， 已成為業內關注的重要問題。發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種利用未萌發玉米種子轉化外源基因的方法， 從而建立起一種簡便、高效的玉米遺傳轉化方法。
本發明應用農桿菌介導的遺傳轉化原理，以玉米種子未萌發胚的胚芽分生組織為受體細胞，對玉米種子進行打孔，使胚的胚芽生長點部分得以暴露，再將含有外源基因的農桿菌滴入孔內，再對孔口封閉，正常播種，種子萌發過程中利用農桿菌侵染的特性，實現對胚芽生長點細胞的遺傳轉化，獲得轉基因植株。
本發明的技術內容包括以下步驟
1、玉米種子轉化前處理將玉米種子在蒸餾水中浸泡1-2天，使種皮、胚吸水軟化，以便于后續操作，根據玉米種子的結構，選擇玉米種子胚位置鉆孔，孔徑為1. 5-2. 5毫米，孔深為2-3毫米，經過打孔處理，可使玉米種子中胚芽位置暴露，并造成生長點位置的輕度損傷，以易于進行遺傳轉化共培養。
2、農桿菌侵染取6-8微升農桿菌液(含有表達載體質粒，該質粒中包含功能基因和抗除草劑基因)，滴入孔中，靜置5分鐘后，在玻璃罐中，0. 05MPa條件下進行負壓處理10 分鐘，使菌液浸入到籽粒細胞間隙，負壓處理重復三次后，再在孔中滴入6-8微升菌液，用濾紙吸干玉米種子表面殘留菌液，封閉孔口。
3、種植及養護侵染后的玉米種子，可正常種植于土中。保證充分的水分補給，并保證環境溫度在20-25攝氏度之間，種子可在3-5日內正常萌發，萌發過程中，種子內部的農桿菌可對胚芽生長點細胞完成侵染。4、鑒定轉基因植株由于侵染過程中使用的表達載體中含有抗除草劑基因，因此可利用相應除草劑的抗性作為篩選標記。在玉米幼苗生長至5片葉后，可通過葉片涂抹或噴施除草劑的方法初步鑒定轉基因植株。本發明利用未萌發的玉米種子作為轉化受體，不需要經過萌發處理，降低了操作難度；通過在籽粒上打孔的方式，使胚的胚芽生長點部位暴露，有利于農桿菌與其充分接觸，提高轉化效率；同時為農桿菌進行轉化創造了一個小的腔體空間，輔以負壓處理，實現了不依賴于無菌操作和組織培養的遺傳轉化，并提高了轉化幾率；本發明將籽粒萌發和農桿菌侵染過程有機的結合，利用細胞生長的活躍期進行轉化，大大提高了轉化效率。本發明采用玉米種子為受體材料，通過在籽粒上打孔進而進行侵染，并伴隨種子萌發實現遺傳轉化，使得該方法具有取材方便，無需萌發后對幼苗進行操作，不需無菌條件的組織培養，無需昂貴設備設施，不受季節限制，后期養護簡單等諸多優點，是一種簡便、高效的玉米遺傳轉化新技術。
具體實施例方式例1、利用未萌發玉米種子轉化法轉化玉米自交系鄭58(1)玉米種子前處理選擇玉米自交系鄭58為實驗材料，將鄭58種子在室溫條件下蒸餾水中浸泡2天待用。此時玉米種子表現出種皮軟化、胚部位吸水后稍稍膨大。選擇玉米種子胚中軸線上約四分之一位置(此部位有一小突起，可作為鉆孔位置的參照)鉆孔， 孔徑為2毫米，孔深為3毫米。(2)農桿菌活化培養將帶有抗除草劑基因(bar)的農桿菌在YEB培養基中常規振蕩培養，當OD值為0. 5-1. 0時將菌液離心，棄去YEB培養液，換用N6培養液重新懸浮活化培養，當達到對數生長期時進行侵染。菌液也可保存在4攝氏度待用。(3)孔內滴注取8微升培養好的農桿菌液，滴入孔中，靜置5分鐘后，在玻璃罐中，0.05MI^條件下進行負壓處理10分鐘，使菌液浸入到籽粒細胞間隙。重復三次后，再在
孔中滴入6微升農桿菌液，用濾紙吸干玉米種子表面殘留農桿菌液，用少量凡士林封閉孔□。(4)種植養護及除草劑篩選侵染后的玉米種子，正常種植于草炭土中。保證充分的水分補給，并保證環境溫度在20-25攝氏度之間，種子在3-5日內正常萌發。待生長至 5葉期時，利用30mg/L濃度的草丁膦涂抹第四、第五片葉。如轉化成功，則葉片正常生長； 如未轉化，則葉片變黃死亡。篩選出的植株移入大田，正常生長，單株嚴格套袋自交，收獲后代。陽性轉化植株的分子檢測取轉化成功的陽性植株葉片，提取DNA，利用PCR技術和 Southern雜交技術進行分子檢測。例2、利用未萌發玉米種子轉化法轉化玉米自交系H99(1)玉米種子前處理選擇玉米自交系H99為實驗材料，將H99種子在室溫條件下蒸餾水中浸泡1天待用。此時玉米種子表現出種皮軟化、胚部位吸水后稍稍膨大。選擇玉米種子胚中軸線上約四分之一位置鉆孔，孔徑為1. 5毫米左右，孔深為2毫米。
(2)農桿菌活化培養將帶有抗除草劑基因(bar)的農桿菌在YEB培養基中常規振蕩培養，當OD值為0. 5-1. 0時將菌液離心，棄去YEB培養液，換用N6培養液重新懸浮活化培養，當達到對數生長期時進行侵染。菌液也可保存在4攝氏度待用。(3)孔內滴注取6微升培養好的農桿菌液，滴入孔中，靜置5分鐘后，在玻璃罐中，0.05MI^條件下進行負壓處理10分鐘，使菌液浸入到籽粒細胞間隙。重復三次后，再在孔中滴入4微升菌液，用濾紙吸干玉米種子表面殘留菌液，用少量石蠟封閉孔口。(4)種植養護及除草劑篩選侵染后的玉米種子，正常種植于草炭土中。保證充分的水分補給，并保證環境溫度在20-25攝氏度之間，種子在3-5日內正常萌發。待生長至5 葉期時，利用30mg/L濃度的草丁膦涂抹第四、第五片葉。如轉化成功，則葉片正常生長；如未轉化，則葉片變黃死亡。篩選出的植株移入大田，正常生長，單株嚴格套袋自交，收獲后代。陽性轉化植株的分子檢測取轉化成功的陽性植株葉片，提取DNA，利用Southern 雜交技術進行分子檢測。例3、利用未萌發玉米種子轉化法轉化玉米自交系7922(1)玉米種子前處理選擇玉米自交系7922為實驗材料，將7922種子在室溫條件下蒸餾水中浸泡2天待用。此時玉米種子表現出種皮軟化、胚部位吸水后稍稍膨大。選擇玉米種子胚中軸線上約四分之一位置(此部位有一小突起，可作為鉆孔位置的參照)鉆孔， 孔徑為2. 5毫米左右，孔深為2. 5毫米。(2)農桿菌活化培養將帶有抗除草劑基因(bar)的農桿菌在YEB培養基中常規振蕩培養，當OD值為0. 5-1. 0時將菌液離心，棄去YEB培養液，換用N6培養液重新懸浮活化培養，當達到對數生長期時進行侵染。菌液也可保存在4攝氏度待用。(3)孔內滴注取7微升培養好的農桿菌液，滴入孔中，靜置5分鐘后，在玻璃罐中，0.05MI^條件下進行負壓處理10分鐘，使菌液浸入到籽粒細胞間隙。重復三次后，再在孔中滴入7微升菌液，用濾紙吸干玉米種子表面殘留菌液，用少量凡士林封閉孔口。(4)種植養護及除草劑篩選侵染后的玉米種子，正常種植于草炭土中。保證充分的水分補給，并保證環境溫度在20-25攝氏度之間，種子在3-5日內正常萌發。待生長至5 葉期時，利用30mg/L濃度的草丁膦涂抹第四、第五片葉。如轉化成功，則葉片正常生長；如未轉化，則葉片變黃死亡。篩選出的植株移入大田，正常生長，單株嚴格套袋自交，收獲后代。陽性轉化植株的分子檢測取轉化成功的陽性植株葉片，提取DNA，利用Southern 雜交技術進行分子檢測。
權利要求
1.一種利用未萌發玉米種子轉化外源基因的方法，其特征是采用如下步驟完成(1)玉米種子轉化前處理將玉米種子在蒸餾水中浸泡1-2天，選擇玉米種子胚位置鉆孔，孔徑為1. 5-2. 5毫米，孔深為2-3毫米，使玉米種子中胚芽位置暴露，并造成生長點位置的輕度損傷；(2)農桿菌侵染取6-8微升農桿菌液滴入孔中，靜置5分鐘，在0.05MPa條件下進行負壓處理10分鐘，負壓處理重復三次后，再在孔中滴入6-8微升菌液，封閉孔口 ；(3)種植及養護侵染后的玉米種子，正常種植于土中；(4)鑒定轉基因植株。
2.根據權利要求1所述的利用未萌發玉米種子轉化外源基因的方法，其特征于選擇玉米種子胚中軸線上約四分之一位置鉆孔，此部位有一小突起，作為鉆孔位置的參照。
3.根據權利要求1所述的利用未萌發玉米種子轉化外源基因的方法，其特征于農桿菌液是將帶有抗除草劑基因的農桿菌在YEB培養基中常規振蕩培養，當OD值為0. 5-1. 0時將菌液離心，棄去YEB培養液，換用N6培養液重新懸浮活化培養，當達到對數生長期時進行侵染。
全文摘要
一種利用未萌發玉米種子轉化外源基因的方法，屬于農業種植技術領域，應用農桿菌介導的遺傳轉化原理，以玉米種子未萌發胚的胚芽分生組織為受體細胞，對玉米種子進行打孔，使胚的胚芽生長點部分得以暴露，再將含有外源基因的農桿菌滴入孔內，再對孔口封閉，正常播種，種子萌發過程中利用農桿菌侵染的特性，實現對胚芽生長點細胞的遺傳轉化，獲得轉基因植株。
文檔編號C12N15/82GK102492717SQ20111037306
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月22日 優先權日2011年11月22日
發明者劉娜, 劉曉冬, 劉艷芝, 張春寶, 張春霄, 李毅丹, 李玉秋, 王丹, 譚化, 賀紅霞 申請人:吉林省農業科學院