專利名稱：玉米彎孢菌萌發分生孢子遺傳轉化的方法
技術領域：
本發明涉及一種玉米彎孢菌萌發分生孢子遺傳轉化的方法，具體涉及一種通過 農桿菌介導的，以玻片懸浮法培養出的萌發分生孢子為材料進行遺傳轉化而獲得玉 米彎孢菌突變體的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
玉米彎孢菌葉斑病是由玉米彎孢菌(CwnWan'" /w""to (Wakker) Boed)引起的，在
世界的大部分國家造成過重大危害。1996年，該病在中國造成嚴重的玉米損失，40 %玉米產區被該病侵染。為了更好的防治該病和選育抗病品種，對該病菌的致病分 子機理進行深入研究具有重要意義。分離和鑒定彎孢菌的致病相關基因，是達到這 一目標的關鍵所在，而創造致病缺陷性突變體則是分離和鑒定致病相關基因的一種 有效途徑之一。目前獲得絲狀真菌突變體有很多方法，例如質粒共轉化、電激轉化、 基因槍、限制性內切酶介導轉化(REMI)和農桿菌介導轉化(農桿菌介導的絲狀真 菌的遺傳轉化，自然生物技術，1998)。但質粒共轉化、電激轉化、限制性內切酶 介導轉化(REMI)、基因槍法方案中要使用原生質體電轉化或原生質體結合氯化鈣 和聚乙二醇(PEG)，轉化子不穩定、轉化效率較低，其轉化效率低使得真菌遺傳 轉化發展緩慢。近來年的研究表明利用農桿菌介導轉化比這些方法有許多優點。該 方法具有易于操作、轉化效率高、轉化子穩定、插入位點無序列特異性和轉化受體 多樣性等優點，這些優點使農桿菌介導的突變技術成為絲狀真菌插入突變的重要工 具。
農桿菌介導的絲狀真菌遺傳轉化體系可以利用各種形式的受體，如原生質體、 分生抱子、菌絲體等，但有時并不是所有的受體都能用于轉化，在轉化米根霉
i Wzo/7M o/yzae和巻枝毛霉Mwcor c/rc/we〃o/des時只能用原生質體作為受體。在轉 化盾殼霉Cbw'o/A,/w附附/"/tora和晚疫病菌尸/ 聲o/7^fera /"/"to/w時則用萌發的孢 子最理想，因此在轉化某些真菌時可能只能利用萌發孢子的才能轉化。制備轉化的 萌發孢子是用分生孢子涂布在玻璃紙或纖維素膜，萌發幾天后用生理鹽水洗下。由 于這時萌發孢子的芽管附著在膜孔上，要從膜上洗下萌發孢子在操作中比較困難， 同時洗下的孢子液中混有較多其它雜質，其雜質不易除掉，使轉化效率低，重復性 差。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種玉米彎孢菌萌發分生孢子遺 傳轉化的方法，操作簡單，轉化效率高，重復性好，獲得的轉化子可為篩選弱致病 性和致病缺陷性突變體提供豐富的篩選菌源。
為實現上述目的，本發明以載玻片和彎孢菌分生孢子為材料，把玉米彎孢菌分 生孢子懸浮液滴置于無菌潔凈的載玻片上，然后在保濕的環境中培養使玉米彎孢菌 分生孢子萌發，萌發后的玉米彎孢菌分生孢子用生理鹽水洗下后直接做為遺傳轉化 的受體用于農桿菌感染。感染后的萌發分生孢子經共培養、抑菌培養和連續2代的 抗選擇劑篩選培養，獲得轉化子，從而建立了彎孢病菌高效的遺傳轉化體系。
本發明的方法具體包括以下步驟 1、玉米彎孢菌萌發分生孢子的制備
在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上將玉米彎孢菌培養5-7天后，用生理鹽水將玉 米彎孢菌的分生孢子刮下后用無菌擦鏡紙過濾除去菌絲，得到的玉米彎孢菌分生孢 子濾液用0. 9%生理鹽水調整到濃度為105-108孢子/毫升；取有一層保水濾紙培養皿， 加無菌水使濾紙濕潤并在表面形成水膜，上加兩根木棒，然后取濃度為105_108孢子 /毫升的玉米彎孢菌分生孢子懸浮液100-20(VL滴置于無菌潔凈的載玻片中央，分 開滴成3-4滴，然后迅速將載玻片倒置，把它兩端隔放在培養皿中兩根木棒上，25-30 。C下在黑暗中培養3-9小時；萌發后的玉米彎孢菌分生孢子用生理鹽水洗下，經
2000-5000rpm離心5分鐘，用生理鹽水再次調節玉米彎孢菌萌發分生孢子濃度為 105_108萌發孢子/毫升，獲得玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液備用；上述一切操作 在無菌的條件下進行。
2、 載體的準備
取含有雙元載體的農桿菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB 液體培養基中，28'C下震蕩培養至對數生長期，得到0D66。=0. 6的農桿菌菌液；然后 取農桿菌菌液250-400)a加到新鮮的5毫升LB液體培養基中，28'C下震蕩培養過夜 至對數生長期，然后在液體IM培養基上誘導培養4-6小時，將農桿菌菌液濃度調 至0D66。=0. 15-0. 2備用；其中，所述液體IM培養基的組分為10 mM K2HP04, 10 mM KH2P04, 2.5 mM NaCl， 2mM MgS04， 0.7 mM CaCl2， 9 mM FeS04.7H20， 4 mM(NH4)S04， 10 mM glucose, 40 mM 2-[N-morpholinoethanesulfonic acid， pH5.3， 100 — 200 (xM acetosyringone ， 0.5wt% glycerol 。
3、 轉化
取誘導后的農桿菌菌液與玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液等體積混合后，涂布 于IM固體培養基的玻璃紙上，在黑暗下22-28'C培養24-72小時，然后將IM固體 培養基上的玻璃紙轉移到含有200微克/毫升的頭孢霉素和250微克/毫升潮霉素的 馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂平板培養基上篩選轉化子;將平板培養基在22-28'C下培養5-7 天，將能夠抗潮霉素的玉米彎孢菌菌落轉移到預先倒好的含有250毫克/毫升潮霉 素的固體馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上進行二次篩選，第二次篩選得到抗潮霉素的 玉米彎孢菌菌落即為轉化子；其中，所述IM固體培養基由每升IM液體培養基加 15-18克瓊脂構成。
本發明方法具有操作簡單，轉化效率高，重復性好，從而解決了目前用農桿菌 轉化絲狀真菌時在制備材料上的困難，轉化效率低，重復差的缺點。由玉米彎孢菌 萌發分生孢子遺傳轉化方法獲得的轉化子可為篩選弱致病性和致病缺陷性突變體 提供豐富的篩選菌源，同時還可用于克隆玉米彎孢菌致病性相關基因，為深入研究玉米彎孢菌菌株致病機理奠定基礎。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例對本發明的技術方案作進一步描述。以下實施例不構成 對本發明的限定。 實施例1
1、 玉米彎孢菌萌發分生孢子的制備
在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上將玉米彎孢菌培養7天后，用0.9%生理鹽水 將玉米彎孢菌的分生孢子刮下后用無菌擦鏡紙過濾除去菌絲，得到的玉米彎孢菌分 生孢子濾液用0.9%生理鹽水調整到濃度為108孢子/毫升；取有一層保水濾紙培養 皿，加無菌水使濾紙濕潤并在表面形成水膜，上加兩根木棒，然后取濃度為108孢 子/毫升的玉米彎孢菌分生孢子懸浮液200)nL滴置于無菌潔凈的載玻片中央，分開 滴成4滴，然后迅速將載玻片倒置，把它兩端隔放在培養皿中兩根木棒上，3(TC下 在黑暗中培養9小時；萌發后的玉米彎孢菌分生孢子用0.9%生理鹽水洗下，經 5000rpm離心5分鐘，用生理鹽水再次調節玉米彎孢菌萌發分生孢子濃度為108萌發 孢子/毫升，獲得玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液備用；上述一切操作在無菌的條 件下進行。
2、 載體的準備
取含有雙元載體的農桿菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB 液體培養基中，28'C下震蕩培養至對數生長期，得到0D66。=0. 6的農桿菌菌液；然后 取農桿菌菌液250p加到新鮮的5毫升LB液體培養基中，28'C下震蕩培養過夜至對 數生長期，然后在液體IM培養基上誘導培養6小時，將農桿菌菌液濃度調至 0D66。=0. 2備用；其中，所述液體IM培養基的組分為10 mM K2HP04， 10 mM KH2P04， 2.5mMNaCl， 2mMMgS04， 0.7mMCaCl2， 9 mM FeS04,7H20， 4mM(NH4)S04， 10 mM glucose, 40 mM 2-[N-morpholinoethanesulfonic acid， pH5.3， 100—200 (xM acetosyringone， 0.5wt% glycerol 。
3、轉化
取誘導后的農桿菌菌液與玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液等體積混合后，涂布 于IM固體培養基的玻璃紙上，在黑暗下28'C培養72小時，然后將IM固體培養基 上的玻璃紙轉移到含有200微克/毫升的頭孢霉素和250微克/毫升潮霉素的馬鈴薯 -葡萄糖-瓊脂平板培養基上篩選轉化子；將平板培養基在28'C下培養7天，將能夠 抗潮霉素的玉米彎孢菌菌落轉移到預先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固體馬 鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上進行二次篩選，第二次篩選得到抗潮霉素的玉米彎孢菌 菌落即為轉化子；其中，所述IM固體培養基由每升IM液體培養基加18克瓊脂構 成。
實施例2
1、 玉米彎孢菌萌發分生孢子的制備
在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上將玉米彎孢菌培養7天后，用0.9%生理鹽水 將玉米彎孢菌的分生孢子刮下后用無菌擦鏡紙過濾除去菌絲，得到的玉米彎孢菌分 生孢子濾液用0.9%生理鹽水調整到濃度為106孢子/毫升；取有一層保水濾紙培養 皿，加無菌水使濾紙濕潤并在表面形成水膜，上加兩根木棒，然后取濃度為106孢 子/毫升的玉米彎孢菌分生孢子懸浮液200pL滴置于無菌潔凈的載玻片中央，分開 滴成3滴，然后迅速將載玻片倒置，把它兩端隔放在培養皿中兩根木棒上，28'C下 在黑暗中培養6小時；萌發后的玉米彎孢菌分生孢子用0.9%生理鹽水洗下，經 5000rpm離心5分鐘，用生理鹽水再次調節玉米彎孢菌萌發分生孢子濃度為106萌發 孢子/毫升，獲得玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液備用；上述一切操作在無菌的條 件下進行。
2、 載體的準備
取含有雙元載體的農桿菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB 液體培養基中，28'C下震蕩培養至對數生長期，得到OD66。=0. 6的農桿菌菌液；然后 取農桿菌菌液250p加到新鮮的5毫升LB液體培養基中，28'C下震蕩培養過夜至對
數生長期，然后在液體IM培養基上誘導培養6小時，將農桿菌菌液濃度調至 0D66。=0. 2備用；其中，所述液體IM培養基的組分為10 mM K2HP04， 10 mM KH2P04， 2.5mMNaCl， 2mMMgS04， 0.7 mM CaCl2， 9 mM FeS04.7H20, 4mM(NH4)S04， 10 mM glucose, 40 mM 2-[N-morpholinoethanesulfonic acid， pH 5.3， 100 —200 |jM acetosyringone， 0.5wt% glycerol 。 3、轉化
取誘導后的農桿菌菌液與玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液等體積混合后，涂布 于IM固體培養基的玻璃紙上，在黑暗下28。C培養48小時，然后將IM固體培養基 上的玻璃紙轉移到含有200微克/毫升的頭孢霉素和250微克/毫升潮霉素的馬鈴薯 -葡萄糖-瓊脂平板培養基上篩選轉化子；將平板培養基在28'C下培養7天，將能夠 抗潮霉素的玉米彎孢菌菌落轉移到預先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固體馬 鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上進行二次篩選，第二次篩選得到抗潮霉素的玉米彎孢菌 菌落即為轉化子；其中，所述IM固體培養基由每升IM液體培養基加15克瓊脂構 成。
實施例3
1、玉米彎孢菌萌發分生孢子的制備
在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上將玉米彎孢菌培養7天后，用0.9%生理鹽水 將玉米彎孢菌的分生孢子刮下后用無菌擦鏡紙過濾除去菌絲，得到的玉米彎孢菌分 生孢子濾液用0. 9%生理鹽水調整到濃度為107孢子/毫升；取有一層保水濾紙培養 皿，加無菌水使濾紙濕潤并在表面形成水膜，上加兩根木棒，然后取濃度為107孢 子/毫升的玉米彎孢菌分生孢子懸浮液200nL滴置于無菌潔凈的載玻片中央，分開 滴成4滴，然后迅速將載玻片倒置，把它兩端隔放在培養皿中兩根木棒上，3(TC下 在黑暗中培養3小時；萌發后的玉米彎孢菌分生孢子用0.9%生理鹽水洗下，經 5000rpm離心5分鐘，用生理鹽水再次調節玉米彎孢菌萌發分生孢子濃度為108萌發 孢子/毫升，獲得玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液備用；上述一切操作在無菌的條
件下進行。
2、 載體的準備
取含有雙元載體的農桿菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB 液體培養基中，28'C下震蕩培養至對數生長期，得到0D66。=0. 6的農桿菌菌液；然后 取農桿菌菌液250p加到新鮮的5毫升LB液體培養基中，28'C下震蕩培養過夜至對 數生長期，然后在液體IM培養基上誘導培養6小時，將農桿菌菌液濃度調至 0D66。=0. 2備用；其中，所述液體IM培養基的組分為10 mM K2HP04， 10 mM KH2P04， 2.5mMNaCl， 2mMMgS04， 0.7mMCaCl2， 9 mM FeS04.7H20， 4mM(NH4)S04， 10 mM glucose, 40 mM 2-[N陽morpholinoethanesulfonic acid, pH 5.3， 100—200 , acetosyringone， 0.5wt% glycerol。
3、 轉化
取誘導后的農桿菌菌液與玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液等體積混合后，涂布 于IM固體培養基的玻璃紙上，在黑暗下28。C培養48小時，然后將IM固體培養基 上的玻璃紙轉移到含有200微克/毫升的頭孢霉素和250微克/毫升潮霉素的馬鈴薯 -葡萄糖-瓊脂平板培養基上篩選轉化子；將平板培養基在28i:下培養7天，將能夠 抗潮霉素的玉米彎孢菌菌落轉移到預先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固體馬 鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上進行二次篩選，第二次篩選得到抗潮霉素的玉米彎孢菌 菌落即為轉化子；其中，所述IM固體培養基由每升IM液體培養基加18克瓊脂構 成。
權利要求
1、一種玉米彎孢菌萌發分生孢子遺傳轉化的方法，其特征在于包括如下步驟1)玉米彎孢菌萌發分生孢子的制備在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上將玉米彎孢菌培養5-7天后，用生理鹽水將玉米彎孢菌的分生孢子刮下后用無菌擦鏡紙過濾除去菌絲，得到的玉米彎孢菌分生孢子濾液用0.9％生理鹽水調整到濃度為105-108孢子/毫升；取有一層保水濾紙培養皿，加無菌水使濾紙濕潤并在表面形成水膜，上加兩根木棒，然后取濃度為105-108孢子/毫升的玉米彎孢菌分生孢子懸浮液100-200μL滴置于無菌潔凈的載玻片中央，分開滴成3-4滴，然后迅速將載玻片倒置，把它兩端隔放在培養皿中兩根木棒上，25-30℃下在黑暗中培養3-9小時；萌發后的玉米彎孢菌分生孢子用生理鹽水洗下，經2000-5000rpm離心5分鐘，用生理鹽水再次調節玉米彎孢菌萌發分生孢子濃度為105-108萌發孢子/毫升，獲得玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液備用；上述一切操作在無菌的條件下進行；2)載體的準備取含有雙元載體的農桿菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB液體培養基中，28℃下震蕩培養至對數生長期，得到OD660＝0.6的農桿菌菌液；然后取農桿菌菌液250-400μ加到新鮮的5毫升LB液體培養基中，28℃下震蕩培養過夜至對數生長期，然后在液體IM培養基上誘導培養4-6小時，將農桿菌菌液濃度調至OD660＝0.15-0.2備用；其中，所述液體IM培養基的組分為10mM K2HPO4，10mM KH2PO4，2.5mM NaCl，2mM MgSO4，0.7mMCaCl2，9mM FeSO4.7H2O，4mM(NH4)SO4，10mM glucose，40mM2-[N-morpholinoethanesulfonic acid，pH5.3，100—200μM acetosyringone，0.5wt％glycerol；3)轉化取誘導后的農桿菌菌液與玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液等體積混合后，涂布于IM固體培養基的玻璃紙上，在黑暗下22-28℃培養24-72小時，然后將IM固體培養基上的玻璃紙轉移到含有200微克/毫升的頭孢霉素和250微克/毫升潮霉素的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂平板培養基上篩選轉化子；將平板培養基在22-28℃下培養5-7天，將能夠抗潮霉素的玉米彎孢菌菌落轉移到預先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固體馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上進行二次篩選，第二次篩選得到抗潮霉素的玉米彎孢菌菌落即為轉化子；其中，所述IM固體培養基由每升IM液體培養基加15-18克瓊脂構成。
全文摘要
本發明涉及一種玉米彎孢菌萌發分生孢子遺傳轉化的方法，以玻片懸浮法培養玉米彎孢菌萌發分生孢子為受體，用含真菌轉化載體系統的農桿菌與萌發分生孢子共培養，然后在抗生素培養基上篩選出具有抗性的轉化子。該體系以玉米彎孢菌為始發菌，在PDA培養基上培養5-7天后用0.9％生理鹽水刮下孢子，然后用玻片懸浮培養法使之萌發后，用于農桿菌感染。感染后的萌發分生孢子經共培養、抑菌培養和連續2代的抗選擇劑篩選培養，獲得抗性轉化子，以此構建玉米彎孢菌突變體庫，為篩選弱致病性和致病缺陷性彎孢菌株提供了豐富的篩選菌源，同時還可用于克隆玉米彎孢菌致病性相關基因，為深入研究玉米彎孢菌菌株致病機理奠定了基礎。
文檔編號C12R1/645GK101381682SQ200810201630
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月23日 優先權日2008年10月23日
發明者銅 劉, 劉力行, 雪 姜, 捷 陳 申請人:上海交通大學