專利名稱：酒色青霉sgfa3及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及酒色青霉SGFA3及其應用。
背景技術：
甲醛在常溫下是一種無色，有強烈刺激性氣味的氣體，易溶于水、醇和醚，通常以水溶液的形式出現。甲醛易發生加成、氧化、還原、聚合等化學反應，具有高度的水溶性，能夠與生物大分子高度反應，甲醛在接觸部位吸收或降解，進入人體后，主要與人體的蛋白質和核酸反應引起細胞核基因突變、DNA單鏈內交連、DNA與蛋白質交連、抑制DNA損傷的修復，與氨基結合，改變蛋白質的內部結構并凝固，擾亂人體細胞的正常代謝，從而產生殺傷力。長時間吸入甲醛氣體，可損傷肝臟、腎臟、血液系統、消化系統、呼吸系統、中樞神經系統和免疫系統，婦女、孕婦長時間接觸低濃度甲醛氣體，能導致月經紊舌L、胎兒畸形、新生兒免疫力降低、體質下降，智力發育產生障礙。甲醛有毒，致畸，同時甲醛也具有強烈的致癌作用，在我國有毒化學品優先控制的名單上居第2位。甲醛是一種重要的化工原料和有機溶劑。常用于制造樹脂、塑料、藥品、油漆、合成纖維和各種黏合劑等工業品，也可用作消毒、 防腐等(HeshamR. Lotfy, Rashed I. G. . A method for treating waste water containing formaldehyde [J], Water Research, 2002, 36 :633-637)。環境中甲酸的主要來源是甲酸生產企業以及以甲醛為原料的有機合成、木材加工、染料、制漆等行業排放的廢水。目前對甲醛廢水的處理方法主要有化學反應法(軟錳礦催化氧化、次氯酸鈉、亞氯酸鈉、二氧化氯、高錳酸鉀等的氧化作用)、電化學法、電解氧化、氧化吸附法、物理吸附技術、臭氧負離子技術、納米光催化技術、低溫等離子技術和生物降解等方法。但是，化學方法的反復使用會造成二次污染；物理方法普遍存在成本較高，操作復雜和處理效果不理想等問題。相對的，微生物法則以生態環境中的有益菌為材料，成本低，效果好，而且無二次污染。微生物以污染物中的有機物、富營養元素為食物，大量生長繁殖，加速消耗污染物中有機物、污染物、營養成份，從而徹底治理污染。特選的微生物能保持長久的活性，它們以各自針對分解的有毒物質為“食物”，快速、大量繁殖，在污染物表面及淺表層形成菌群保護膜，隨時截殺從污染源滲透或揮發出的污染物，從而能長久地起作用由于它能滲入到污染源中，在不破壞原始材料的情況下，有效分解有害物質從而治標治本，杜絕后患。無毒無害， 不會危害人體和造成環境二次污染。目前常用的生物方法多是應用篩選自各類不同生境的甲醛降解細菌和酵母，這類微生物對不良環境，如紫外輻射、低營養、低PH值等適應性不佳，繁殖傳播能力較差，且不易保存。絲狀真菌普遍存在于水體和土壤環境中，其菌絲體能提供較大的表面積與污染物接觸，有利于污染物的充分降解；其孢子能夠適應各類不良環境。因此，亟待開發一種能夠有效降解廢水中甲醛，且安全、環保、高效的真菌菌種。
發明內容
本發明的一個目的是提供酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3。
本發明所提供的酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3，其保藏號為 CGMCCNo. 4540 本發明的另一個目的是提供所述酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3在降解甲醛中的應用。本發明的又一個目的是提供一種降解甲醛的菌劑。本發明所提供的降解甲醛的菌劑，其活性成分為所述酒色青霉 (Penici11iumvinaceum)SGFA3。所述菌劑在降解甲醛中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明所提供的酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3可在好氧條件下將甲醛作為唯一碳源進行生長，同時將其降解。在純培養條件下，能將濃度為30mmol/L的甲醛在 7天內降解完全。該菌株有望在工業廢水的生物處理中發揮重要作用。
圖1為酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3在孟加拉紅培養基上的生長狀況。圖2為酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3的分生孢子囊。圖3為將酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3在含有30mmol/l甲醛的培養基中培養時甲醛含量的變化。圖4為將酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3在含有不同濃度甲醛的培養基中培養時菌絲體干重的的變化。圖5為將酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3在含有不同濃度甲醛的培養基中培養時甲醛含量的變化。圖6為將酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3在含有不同碳源的培養基中培養時菌絲體干重的的變化。圖7為將酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3在含有不同碳源的培養基中培養時甲醛含量的變化。圖8為不同濃度甲醛標準品對應OD值的標準曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3的分離和鑒定一、酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3 的分離酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3的分離分為取樣和富集培養，篩選和純化兩個步驟，具體方法如下1、取樣和富集培養取黑龍江省某家具廠未處理的出水口處淤泥樣后立即富集培養。在超凈工作臺上，取IOg淤泥樣置于90mL無菌水中，180r · mirT1，置于30°C的條件下震蕩培養5天。2、篩選和純化
篩選用的是含甲醛的PDA培養基，該培養基的配制方法如下取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g葡萄糖和2%的瓊脂，定容至lOOOmL，121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入lOmmol/L甲醛貯存備用。將上述步驟1震蕩培養5天后生長起來的霉菌經多次用含有lOmmol/L甲醛的PDA 培養基平板劃線，直至分離得到單菌落為止。將菌絲頂端移接到PDA培養基上連續重復純化3次，既獲得純培養菌株。二、酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3 的鑒定對上述實驗一得到的純培養菌株進行一系列形態特征鑒定，并進行DNA提取，ITS 保守區序列的擴增和測序。該菌株在孟拉紅培養基上菌落黃綠色，反面黃色。以接種點成同心環狀，內部淡黃色，外部淡綠色，后期變成深綠色。表面有規則輻射紋，基質上也有輻射紋皺折溝紋(圖1)。分生孢子梗長在50微米以下，并從菌絲垂直生出，無足細胞，分散或聚集成孢梗束；頂端有排列成掃帚狀的間枝，帚狀枝一般為單輪型，分枝對稱或不對稱；分生孢子球狀，略粗糙，直徑2-2. 5微米(圖2)。孟加拉紅培養基的配制方法如下將蛋白胨5g、葡萄糖10g、KH2P04 lg、MgS04 ·7Η20 0. 5g和瓊脂20g加入蒸餾水中溶解后，加1/3000孟加拉紅溶液(取孟加拉紅30g，加蒸餾水1000ml，加熱至全部溶解，即得到1/3000孟加拉紅溶液)IOOmL和氯霉素0. Ig,定容至 IOOOmL,分裝，121°C滅菌20min，用于分離霉菌及酵母。利用通用引物ITSl和ITS4進行ITS保守區序列的擴增，引物序列如下ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘，ITS4. 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘。PCR 擴增條件為94 "C 3min ；94 "C 30s, 50 "C 30s, 72 "C 1. 5min, 25 個循環； 72°C IOmin。對PCR擴增產物進行測序，測序結果如序列表中序列1所示。將上述獲得的純培養菌株中的一株命名為酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3。該酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3已于2011年01月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4540。實施例2、酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3對甲醛的生物降解效果檢測酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3 一級種子的制備方法如下將從上述實施例1中PDA斜面上沖洗下的孢子懸液接入PD培養基中，接種量為 2% (體積比)，在30°C，180r · mirT1，培養4天，即得到一級種子液。PD培養基除不加瓊脂外，其余成分均與上述PDA培養基相同。(一 )酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3對甲醛的生物降解效果檢測將得到的一級種子液按體積比為2%的比例接種于含30mmol/l甲醛的PD培養基中進行培養，搖床轉速180r · mirT1，溫度30°C，培養7天。同時，設不接種一級種子液的對照。在接種的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分別取加菌處理和對照的培養液，每天測量甲醛剩余量，共測量7天。實驗設3次重復，結果取平均值。結果如圖3所示，加菌處理的培養液中，接種7天內甲醛濃度呈下降趨勢，且第7天甲醛全部降解；而對照的培養液中，接種7天內甲醛濃度沒有明顯的變化。此結果說明，酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3可降解甲醛。( 二 )酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3對不同濃度甲醛的降解效果檢測將得到的一級種子液按體積比為2%的比例分別接種于含有30mmOl/l、50mmOl/L 和80mmol/L甲醛的PD培養基中進行培養，搖床轉速180r · mirT1，溫度30°C，培養7天。在接種的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分別取不同甲醛濃度處理培養液，每天測量菌絲干重和甲醛剩余量，共測量7天。實驗設3次重復，結果取平均值。結果如圖4所示，即SGFA3在30mmol/L、50mmol/L和80mmol/L甲醛處理下的生長狀況和甲醛降解狀況。從圖中可見，SGFA3在30mmol/L甲醛處理下，第7天菌絲體干重達到0. 378g，在 50mmol/L甲醛處理下，第7天菌絲體干重達到0. 014g，在80mmol/L甲醛處理下，第7天菌絲體干重達到0. 014g。此結果說明甲醛濃度越高，同等質量的菌生長同樣時間，生長狀況越差。在接種的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分別取不同甲醛濃度處理培養液，每天測量甲醛剩余量，共測量7天。實驗設3次重復，結果取平均值。結果如圖5所示。 從圖中可見，SGFA3可在7天內將30mmol/L甲醛全部降解。在50mmol/L和80mmol/L甲醛處理下，SGFA3生長受到抑制，同樣甲醛降解能力也受抑制。(三)不同碳源處理的培養基對酒色青霉(Penicilliumvinaceum) SGFA3降解甲醛的影響選取4種碳源葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉，按體積比2%的比例添加到PD培養基中，設置5種不同處理的碳源，分別為甲醛(處理1)、甲醛+2%葡萄糖(處理2)、甲醛+2%乳糖(處理幻、甲醛+2%蔗糖(處理4)和甲醛+2%可溶性淀粉(處理幻，其余成分相同。5種不同處理的培養基的配制方法如下(1)以甲醛為碳源的培養基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加2%的瓊脂，定容至1000mL。121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為30mmol/L貯存備用。(2)以甲醛+2 %葡萄糖為碳源的培養基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g葡萄糖和2 %的瓊脂，定容至1000mL。 121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為30mmol/L貯存備用。(3)以甲醛+2%乳糖為碳源的培養基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g乳糖和2%的瓊脂，定容至1000mL。121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為30mmol/L貯存備用。(4)以甲醛+2%蔗糖為碳源的培養基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g蔗糖和2%的瓊脂，定容至1000mL。121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為30mmol/L貯存備用。(5)以甲醛+2%可溶性淀粉為碳源的培養基的配制方法如下200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，再加20g可溶性淀粉和2%的瓊脂，定容至 1000mL。121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入甲醛濃度為30mmol/L貯存備用。將酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3 一級種子液按體積比為2%的比例接種到上述五種培養基中進行培養。搖床轉速180r · mirT1，溫度30°C，培養7天。在接種的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分別取不同處理培養液，每天取 2瓶測量菌絲干重和甲醛剩余量，共測量7天，實驗設3次重復，結果取平均值。結果如圖6 和圖7。圖6和圖7的結果顯示酒色青霉(Penicillium vinaceum) SGFA3能利用甲醛作為唯一碳源生長繁殖，7天能夠將30mmol/L甲醛全部降解。同時，該菌能夠在不同碳源的條件下代謝甲醛。甲醛含量測量方法為乙酰丙酮法，具體方法為根據不同濃度的甲醛水溶液，在乙酸銨溶液介質中，與乙酰丙酮加熱反應生成黃色化合物(3，5 —二乙酰基_1，4氫盧剔啶)。 該化合物對可見光有選擇性吸收，并且對波長414nm的可見光吸收最多，其對可見光的吸收值與甲醛溶液成正比。依據這一原理，分別對幾種已知濃度的甲醛溶液進行吸光度的測量，繪出不同甲醛濃度對應OD值標準曲線，得出標準曲線方程。具體步驟如下取6支IOml 容量瓶編號，分別加入0ml、^iil、％il、6ml、8ml和IOml濃度為lOOmmol/1的甲醛標準品溶液 (甲醛分析純溶液購自國藥集團化學試劑有限公司，產品目錄號為CAS RN 50-00-0濃度為 37% -40% (體積百分比濃度))，取9. 959ml該溶液加水定容到1L)，加水至IOml搖勻(不同編號的容量瓶中甲醛濃度見表1所示)。將ImL乙酰丙酮溶液加入4mL水中，然后加入不同濃度的甲醛標準品溶液1 μ 1，65°C反應lOmin。當溶液冷卻到室溫時，測量其OD值。采用 IOmm比色皿，在波長414nm處，以O號為參比測量吸光度，OD值測定結果見表2。繪制不同甲醛濃度對應OD值標準曲線(如圖8所示)，得出標準曲線方程為y = 0. 0065x+0. 0034 (R2 =0. 9998)。表1配制不同濃度的甲醛標準品溶液
權利要求
1.酒色青霉(Penicilliumvinaceum) SGFA3，其保藏號為 CGMCC No. 4540。
2.權利要求1所述的酒色青霉(Penicilliumvinaceum) SGFA3在降解甲醛中的應用。
3.一種降解甲醛的菌劑，其活性成分為權利要求1所述的酒色青霉 (Penici11iumvinaceum)SGFA3。
4.權利要求3所述的菌劑在降解甲醛中的應用。
全文摘要
本發明公開了酒色青霉SGFA3及其應用。本發明所提供的酒色青霉(Penicillium vinaceum)SGFA3，其保藏號為CGMCC No.4540。本發明所提供的酒色青霉(Penicillium vinaceum)SGFA3可在好氧條件下將甲醛做為唯一碳源進行生長，同時將其降解。在純培養條件下，能將濃度為30mmol/L的甲醛在7天內降解完全。該菌株有望在工業廢水的生物處理中發揮重要作用。
文檔編號C12N1/14GK102417885SQ20111037885
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者于典司, 姚琳, 宋鴿, 束永俊, 董蕊, 郭長虹 申請人:哈爾濱師范大學