豬睪丸克隆細胞系及其生產豬瘟活疫苗的方法

專利名稱：豬睪丸克隆細胞系及其生產豬瘟活疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及一種動物細胞生產豬瘟活疫苗的方法及產品，特別是指一種使用豬睪丸克隆細胞系生產豬瘟活疫苗的方法及產品。
背景技術：
豬痕是由豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、性別和品種的豬均能感染，死亡率高達80-90 %。豬瘟被世界世界動物衛生組織劃分為A類疾病，我國將其劃分為一類疾病。中國學者培育成功的豬瘟兔化弱毒苗是目前世界上公認的安全和有效的疫苗，借助于C株疫苗密集接種和綜合防制措施，有關國家已經有效地控制了豬瘟，甚至消滅了豬瘟。在我國，豬瘟流行出現典型豬瘟與非典型豬瘟共存、持續感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共存等，因此，豬瘟新的流行 形式給我國養豬業防治本病提出了新的挑戰。疫苗接種仍是我國目前防治豬瘟的主要措施，我國目前生產豬瘟兔化弱毒苗用的細胞有牛睪丸細胞、豬腎細胞(IBRS-2或PK15細胞系)、豬睪丸細胞(ST細胞)。但在該疫苗生產實踐中證實用上述細胞生產的疫苗，其病毒滴度不高，生產工藝不穩定，特別是病毒滴度隨細胞傳代數的增加迅速降低，導致疫苗批次之間的差異很大。此外，由于牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬，兩種病毒的同源性很高，因此污染了 BVDV的牛睪丸細胞或犢牛血清都會造成疫苗污染，而我國牛群中病毒性腹瀉病毒(BVDV)的感染率很高，用這樣的動物細胞生產的豬瘟活疫苗免疫豬，往往造成免疫失敗，引起嚴重的后果。

發明內容
有鑒于此，本發明的主要目的在于提供一種豬睪丸克隆細胞，及其生產豬瘟活疫苗的方法及產品。本發明提供的一種高感染豬瘟病毒的豬睪丸克隆細胞，命名為豬睪丸細胞系(swine testicular cell lines)克隆株ST-B2,保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC),地址中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC NO :C2011101，保藏日期為2011年11月07日。本發明中豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞，是指對豬瘟病毒感染高的豬睪丸克隆細胞，特別指可以生產高滴度的豬瘟病毒的豬睪丸克隆細胞，也即指可以生產高效價的豬瘟活疫苗的豬睪丸克隆細胞。本發明還提供了一種如上所述的豬睪丸克隆細胞的制備方法，包括以下步驟I)將豬睪丸細胞進行有限稀釋進行細胞克隆和亞細胞克隆，獲得亞細胞克隆株；2)選擇對豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞。優選地，本發明如上所述的使用豬睪丸克隆細胞的制備方法中，所述的步驟I)為使用未被病毒感染的豬睪丸細胞，經胰蛋白酶消化為單細胞后進行梯度稀釋，分別在37°c5% CO2的條件下培養于96孔細胞培養板中培養至肉眼可見細胞克隆后，進行亞細胞培養，獲得亞克隆細胞株；優選地，本發明如上所述的 使用豬睪丸克隆細胞的制備方法中，所述的步驟2)為將豬睪丸細胞亞克隆株接種于96孔細胞培養板中，接種豬瘟病毒于37°C 5% CO2的條件下培養2h，使用免疫過氧化酶單層細胞試驗法檢測感染病毒最多的細胞，選擇對豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞。本發明還提供了一種如上所述的豬睪丸克隆細胞用于高滴度的豬瘟病毒液的制備方法，將上述的豬睪丸克隆細胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細胞維持液，37°C含5% CO2溫箱中培養2-3d，待細胞長滿單層后，按照I : 3的比例傳代，同時收獲傳代細胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液。優選地，本發明如上所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法中，所述傳代次數為可以大于15代。優選地，本發明如上所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法中，所述的病毒滴度為大于 106 0TCID50/mlo本發明還提供了一種使用如上I所述的豬睪丸克隆細胞生產豬瘟活疫苗的方法，包括以下步驟I)生產用種子批病毒液的制備將權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細胞維持液，37°C含5% CO2溫箱中培養2-3d，待細胞長滿單層后，按照I : 3的比例傳代2次，同時收獲第二代、第三代的傳代細胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液；2)制苗用病毒液的制備權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞長滿單層后，用含0. 5% EDTA的胰酶進行消化，采用同步接種的方法接種含5%生產種子批毒的細胞維持液，置37°C含5%二氧化碳的培養箱中培養3-4天，待細胞長滿單層后，按照I : 3的比例用胰酶消化進行傳代，同時收獲病毒上清，用同樣的方法傳代至少15代，每代都收取病毒上清液作為制苗用毒液；3)病毒液的制苗將上述收獲的病毒液加入凍干保護劑，凍干，即可獲得豬睪丸克隆細胞生產的豬瘟活疫苗。優選地，本發明如上所述的豬睪丸克隆細胞生產豬瘟活疫苗的方法中，所述的活疫苗的效價為每頭份病毒含量> 9000個家兔感染量，每頭份含細胞毒液> 0. 01ml。因此，本發明提供了使用如上所述的豬睪丸克隆細胞，生產制備獲得了一種高滴度的豬瘟病毒液，以及高效價的豬瘟活疫苗。由上可以看出，本發明通過大量細致試驗獲得了一株對豬瘟病毒感染率高的豬睪丸細胞，使用該豬睪丸細胞系ST克隆細胞株ST-B2，以帶毒傳毒的方法生產的豬瘟疫苗，病毒滴度高，不易受到BVDV的污染，疫苗純凈性好；帶毒傳毒的方法使得每次復蘇的細胞可以持續傳代達至少15代，減少了復蘇細胞與接毒的次數，簡化了生產工藝，并提高了生產效率。牛物材料保藏信息豬睪丸細胞系克隆株ST-B2，保藏在中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，地址中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC NO :C2011101，保藏日期為2011年11月07日。
具體實施例方式本發明所用生長液配方為91% v/vDMEM液、9% v/v犢牛血清PH調整為7. I ;所述維持液的配方為98% v/vDMEM液、2% v/v犢牛血清PH調整為7. 3 ;豬瘟病毒為豬瘟兔化弱毒株，購自中國獸醫藥品監察所，菌株保藏編號CVCC AV1412。本發明的實施例可以分為以下方面I.敏感均一生長性能良好的ST細胞的克隆(I)母ST細胞的篩選；⑵CSFV感染ST細胞檢測方法的建立與穩定；(3)單個ST細胞亞群的培養；⑷陽性ST細胞克隆的篩選；(5)陽性ST細胞的亞克隆；(6) CSFV在ST陽性克隆細胞上產生毒價的測定；(7) ST陽性克隆細胞的穩定性鑒定。2.克隆細胞的培養及帶毒細胞傳毒 (I)克隆細胞用胰酶消化后，接種含毒的細胞維持液；(2)待細胞長成單層后，按I 3傳代，同時收獲細胞上清，收獲的第二、第三代上清作為生產種子批毒；(3)用同樣的方法收獲細胞上清，作為疫苗用毒液，帶毒傳毒可以傳代至少15代以上為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。如未特別聲明，本發明的一般實驗方法可使用本領域常用的試驗方法進行。本發明實施例中的細朐牛長液為91% v/vDMEM液、9% v/v犢牛血清PH調糖為本發明實施例中的細胞維持液為98% v/vDMEM液、2% v/v犢牛血清PH調整為
7.3。實施例I :ST克隆細胞的篩選和利用該細胞生產豬瘟活疫苗的方法一、母ST細胞的篩選I.細胞純凈性檢驗無支原體污染2.外源病毒檢測以牛病毒性腹灣病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)為例進行說明外源病毒檢測方法。利用PCR技術，對ST細胞進行牛病毒性腹灣病毒(Bovine Viral DiarrheaVirus,BVDV)檢測。結果ST細胞應不攜帶BVDV。檢測方法用胰酶消化在T25細胞瓶生長的單層ST細胞，收獲細胞，IOOOrpm離心lOmin，棄去上清液，用PBS洗一遍，離心收集細胞沉淀。參考Invitrogen的TRIzoI說明書，提取細胞總RNA。提取的RNA進行反轉錄后獲得的cDNA作為PCR模板，采用BVDV特異性引物，進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增出目的條帶者攜帶BVDV，未擴增出目的條帶者則不攜帶BVDV。用同樣的方法進行RNA病毒豬痕病毒(Classical Swine fever Virus, CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的檢測。對于DNA病毒豬圓環病毒(Porcine Circovirus, PCV)及豬偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus)的檢測也采用PCR的方法進行，提取細胞DNA后，直接進行PCR擴+
>曰o檢測結果表明BVDV、CSFV、PRRSV、PCV, PRV全部為陰性。二、單個ST細胞及其亞群的培養
對處于對數生長期的單層ST細胞用胰酶消化成單個細胞，盡可能分散，并進行細胞計數，然后采用有限稀釋法，按照8個細胞/ml的密度，每孔IOOiU的細胞生長液的量加A 96孔細胞培養板中，對含有單個細胞的孔進行標記后，將96孔板置于含5%⑶2，37°C細胞培養箱中培養直至產生肉眼可見 細胞克隆為止。在此過程中可依據細胞生長情況，對克隆細胞進行換液。當孔內的細胞生長達到單層時，將其消化下來，置于24孔細胞培養板中，于含5% C02，37°C細胞培養箱中繼續培養。當細胞長滿24孔后，將其消化后，置于6孔板中繼續培養，如有可能，對克隆的細胞進行凍存保種，以備用。條件培養基收集后lOOOOrpm，離心IOmin后,0. 45 u m濾膜過濾去除細胞碎片。三、高感染性的ST細胞克隆的篩選將6孔板上擴大培養的ST細胞亞群，用胰酶消化后進行細胞計數，按照2 X IO4個cell/每96孔，接種96孔細胞培養板，重復I孔，接種24h后接毒CSFV病毒液，以MOI =
0.I的接毒量接種病毒，每孔加入200 ii L病毒原液，37°C孵育Ih后，棄掉病毒液，加入細胞維持液，于5% C02，37°C溫箱中培養2d后，用免疫過氧化酶單層細胞試驗檢測細胞感染病毒情況，陽性細胞數多的孔為CSFV感染率高的ST細胞亞群，為所需的高感染性的ST克隆細胞。然后將其在6孔板上擴大培養，用胰酶消化，并進行第2次或者3次克隆，每次克隆都需要做CSFV感染性檢測，以達到純化的具備高感染性的ST克隆細胞的目的。實施例2ST克隆細胞培養和生產豬瘟病毒的方法獲得的高感染性的ST克隆細胞株ST_B2(保藏號CCTCC C2011101)用胰酶消化后，同步接種生產種子批毒，37°C溫箱中培養3-4d，按照I : 3(體積比)的比例傳代，同時收獲上清作為制苗用毒液進行冷凍保存，依同樣的方法傳代至少15代，收獲每代的病毒上清作為制苗用毒液。I、CSFV在陽性ST克隆細胞株ST-B2上病毒滴度的測定將帶毒傳毒方法傳代獲得的CSFV病毒在高感染性克隆細胞ST-B2上連續增殖培養，采用間接免疫熒光方法測定收獲的每個代次的CSFV病毒液的滴度，具體如下將處于對數生長期的ST-B2細胞用胰酶消化，每孔200 u L鋪到96孔板內，待長滿單層后，按照KT1-IO-8稀釋CSFV病毒液，并加入96孔板中，每個稀釋度6個孔，3-4天后，棄去培養基，PBS洗兩次，用冰甲醇固定細胞10分鐘，然后加1% BSA進行封閉30分鐘，PBS洗兩次后，加入稀釋好的一抗，37°C孵育2h后，PBS洗5次，加入稀釋好的二抗，37°C孵育lh，PBS洗5次，然后在倒置顯微鏡下觀察每個孔里的熒光，利用Reed-Muench兩氏法計算出病毒的滴度。連續生產3批的病毒滴度分別為20101101批病毒滴度為107_°TCID5(l/ml、20101102批病毒滴度為 106_92TCID5Q/ml、20101103 批病毒滴度為 107_27TCID5(l/ml。2、陽性ST克隆細胞株ST-B2的穩定性鑒定對陽性ST克隆細胞株ST-B2進行連續傳代30代，細胞生長狀態良好，并且每隔5代將細胞接種CSFV病毒，測定CSFV滴度，病毒滴度穩定在106_5TCID5cZml左右，選取10代以內的克隆細胞作為生產用種子批細胞。3、生產用種子批毒的制備ST-B2細胞長滿單層后，用含0. 5% EDTA的胰酶進行消化后，采取同步接種的方法以MOI = 0. I接種量含新鮮脾毒的細胞維持液，置37°C含5%二氧化碳的培養箱中培養2-3天，待細胞長滿單層后，按照用胰酶消化后按照I : 3的比例進行傳代，同時收獲病毒上清，收獲的第二、第三代病毒上清作為生產種子批毒。4、制苗用細胞毒液的制備ST-B2細胞長滿單層后，用含0. 5% EDTA的胰酶進行消化，采用同步接種的方法接種含5% v/v生產種子批毒的細胞維持液，置37°C含5%二氧化碳的培養箱中培養3-4天，待細胞長滿單層后，按照I : 3的比例用胰酶消化進行傳代，同時收獲病毒上清，用同樣的方法傳代至少15代，每代都收取病毒上清作為制苗用毒液，保存于_70°C冰箱。5、豬瘟活疫苗的制備及效力檢驗按現行《中華人民共和國獸藥典》對制苗用毒液進行檢驗，結果無細菌、霉菌、支原體生長。細胞毒液對豬安全無副作用，20101101、20101102、20101103批病毒滴度分別為IO7.0TCID50Ail、IO6.92TCID50/ml、IO7.27TCID50M。各收次的病毒液加入凍干保護劑，凍干制成豬瘟活疫苗，疫苗批次為20101101、20101102、20101103，分別用家兔測定，每頭份病毒含量 ^ 9000個家兔感染量，每頭份含細胞毒液> 0. 01ml。用家兔效檢疫苗效力的方法如下(I)每收次的病毒液用滅菌生理鹽水稀釋3X IO5倍、4X IO5倍、5X IO5倍、6X IO5倍、7 X IO5倍、8 X IO5倍、9 X IO5倍、IO6倍，耳靜脈注射體重I. 5 3. Okg家兔2只，每只兔耳靜脈注射1ml。家兔接種后，上下午各測體溫I次，48小時后，每隔6小時測體溫I次，根據體溫反應和攻毒結果進行綜合判定。①家兔接種疫苗后，體溫反應標準如下定型熱反應(++)潛伏期48 96小時，體溫上升呈明顯曲線，至少有3個溫次超過常溫1°C以上，并稽留18 36小時。如稽留42小時以上，必須攻毒，攻毒后無反應可判為定型熱。輕熱反應(+)潛伏期48 96小時，體溫上升呈明顯曲線，至少有2個溫次超過常溫0. 50C以上，并稽留12 36小時。可疑反應(±)潛伏期48 96小時，體溫曲線起伏不定，稽留不到12小時；或潛伏期在24小時以上，不足48小時及超過96小時至120小時出現熱反應。體溫反應呈二次高峰,有一次高峰符合定型熱反應(++)或輕熱反應(+)標準者，均須攻毒。攻毒后無反應時，該兔熱反應可判為定型熱或輕熱反應。無反應㈠體溫正常。②結果判定注苗后，當2只家兔均呈定型熱反應(++)，或I只兔呈定型熱反應(++)、另I只兔呈輕熱反應(+)時，疫苗判為合格。注苗后，當I只家兔呈定型熱反應(++)或輕熱反應(+)，另I只兔呈可疑反應(±);或2只兔均呈輕熱反應(+)時，可在注苗后7 10日攻毒(接種新鮮脾淋毒或凍干毒)。攻毒時，加對照兔2只，攻毒劑量為50 100倍乳劑。每兔耳靜脈注射lml。攻毒后的體溫反應標準如下熱反應⑴潛伏期24 72小時，體溫上升呈明顯曲線，超過常溫1°C以上，稽留12 36小時。可疑反應(±)潛伏期不到24小時或72小時以上，體溫曲線起伏不定，稽留不到12小時或超過36小時而不下降。
無反應(_)體溫正常。攻毒后，當2只對照兔均呈定型熱反應(++)，或I只兔呈定型熱反應(++)，另I只兔呈輕熱反應(+)，而2只注苗兔均無反應(_)，疫苗判合格。注苗后，如有I只兔呈定型熱(++)或輕熱反應(+)，另I只兔呈可疑反應(±)或無熱反應(_)，可對可疑反應兔或無反應兔采用剖殺或采心血分離病毒的方法，判明是否隱性感染；或注苗后，2只兔均呈輕熱反應，亦可對其中I只兔分離病毒。方法是接種疫苗后96 120小時之間，將兔剖殺，采取脾臟，用生理鹽水制成50倍稀釋乳劑(脾乳劑應無菌)，或采取心血(全血)，接種2只家兔，每只兔耳靜脈注射lml。凡有I只兔潛伏期24 72小時出現定型熱反應(++)，疫苗可判為合格。
注苗后，出現其它反應情況無法判定時，可重檢。用家兔做效檢，不應超過3次。經檢驗，三個收次所制備的活疫苗均合格，具體結果為20101101批次疫苗I/(3 X IO5)、I/(4 X IO5)、I/ (5 X IO5)、I/ (6 X IO5)、I/ (7 X IO5)、I/ (8 X IO5) 6 個稀釋度耳靜脈注射家兔各 2只，每只1ml，根據體溫反應知呈現2只家兔均呈定型熱反應(++)，或I只兔呈定型熱反應(++)、另I只兔呈輕熱反應⑴時，疫苗判為合格。而I/(9 XlO5)、1/106兩個稀釋度耳靜脈注射家兔各2只，每只1ml，根據體溫反應知I只家兔呈定型熱反應(++)，另I只兔呈可疑反應(±)，在注苗后7 10日攻毒(接種新鮮脾淋毒，即豬瘟兔化弱毒株通過兔體繼代，采集定性熱反應兔的脾臟作為種毒)。攻毒時，加對照兔2只，攻毒劑量為100倍乳劑。每兔耳靜脈注射lml。攻毒后，2只對照兔均呈定型熱反應(++)，或I只兔呈定型熱反應(++)，另I只兔呈輕熱反應(+)，而2只注苗兔均無反應(_)，疫苗判合格。20101102批次疫苗I/(3 X IO5)、I/ (4 X IO5) ,1/(5 X IO5) ,1/(6 X IO5) ,1/(7 X IO5) ,1/(8 X IO5) ,1/(9 X IO5) 7 個稀釋度耳靜脈注射家兔各2只，每只1ml，根據體溫反應知呈現2只家兔均呈定型熱反應(++)，或I只兔呈定型熱反應(++)、另I只兔呈輕熱反應(+)時，疫苗判為合格。而1/106稀釋度耳靜脈注射家兔2只，每只1ml，根據體溫反應知I只家兔呈定型熱反應(++)，另I只兔呈可疑反應(±)，在注苗后7 10日攻毒(接種新鮮脾淋毒，即豬瘟兔化弱毒株通過兔體繼代，采集定性熱反應兔的脾臟作為種毒)。攻毒時，加對照兔2只，攻毒劑量為100倍乳齊U。每兔耳靜脈注射lml。攻毒后，2只對照兔均呈定型熱反應(++)，而2只注苗兔均無反應(-)，疫苗判合格。20101103 批次疫苗 I/(3 X IO5)、I/ (4X IO5)、I/ (5 X IO5)、I/ (7 X IO5)、I/ (8 X IO5) 5個稀釋度耳靜脈注射家兔各2只，每只Iml，根據體溫反應知呈現2只家兔均呈定型熱反應(++)，或I只兔呈定型熱反應(++)、另I只兔呈輕熱反應(+)時，疫苗判為合格。而I/ (6 X IO5)、I/ (9 X IO5)、1/1063個稀釋度耳靜脈注射家兔各2只，每只Iml，根據體溫反應知I只家兔呈定型熱反應(++)，另I只兔呈可疑反應(±)，在注苗后7 10日攻毒(接種新鮮脾淋毒，即豬瘟兔化弱毒株通過兔體繼代，采集定性熱反應兔的脾臟作為種毒)。攻毒時，加對照兔2只，攻毒劑量為100倍乳劑。每兔耳靜脈注射lml。攻毒后，2只對照兔均呈定型熱反應(++)，或I只兔呈定型熱反應(++)，另I只兔呈輕熱反應(+)，而2只注苗兔均無反應(_)，疫苗判合格。詳細見表I。表I家兔效檢疫苗效力的結果
權利要求
1.一種豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞，其特征在于，保藏號為CCTCC NOC2011101。
2.一種如權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將豬睪丸細胞進行有限稀釋進行細胞克隆和亞細胞克隆，獲得亞細胞克隆株； 2)選擇對豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞。
3.根據權利要求2所述的使用豬睪丸克隆細胞的制備方法，其特征在于，所述的步驟1)為使用未被病毒感染的豬睪丸細胞，經胰蛋白酶消化為單細胞后進行梯度稀釋，分別在370C 5% CO2的條件下培養于96孔細胞培養板中培養至肉眼可見細胞克隆后，進行亞細胞培養，獲得亞克隆細胞株；
4.根據權利要求2所述的使用豬睪丸克隆細胞的制備方法，其特征在于，所述的步驟2)為將豬睪丸細胞亞克隆株接種于96孔細胞培養板中，接種豬瘟病毒于37°C5%0)2的條件下培養2h，使用免疫過氧化酶單層細胞試驗法檢測感染病毒最多的細胞，選擇對豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞。
5.一種使用權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞用于高滴度的豬瘟病毒液的制備方法，其特征在于，將權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細胞維持液，37°C含5% CO2溫箱中培養2-3d，待細胞長滿單層后，按照I : 3的比例傳代，同時收獲傳代細胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液。
6.根據權利要求5所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法，其特征在于，所述傳代次數為可以大于15代。
7.根據權利要求5所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法，其特征在于，所述的病毒滴度為大于 106_°TCID5(l/ml。
8.一種使用權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞生產豬瘟病毒。
9.一種使用權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞生產豬瘟活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)生產用種子批病毒液的制備將權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細胞維持液，37°C含5% CO2溫箱中培養2-3d，待細胞長滿單層后，按照I : 3的比例傳代2次，同時收獲第二代、第三代的傳代細胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液； 2)制苗用病毒液的制備權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞長滿單層后，用含0.5%EDTA的胰酶進行消化，采用同步接種的方法接種含5%生產種子批毒的細胞維持液，置37°C含5%二氧化碳的培養箱中培養3-4天，待細胞長滿單層后，按照I : 3的比例用胰酶消化進行傳代，同時收獲病毒上清，用同樣的方法傳代至少15代，每代都收取病毒上清液作為制苗用毒液； 3)病毒液的制苗將上述收獲的病毒液加入凍干保護劑，凍干，即可獲得豬睪丸克隆細胞生產的豬瘟活疫苗。
10.根據權利要求8所述的豬睪丸克隆細胞生產豬瘟活疫苗的方法，其特征在于，所述的活疫苗的效價為每頭份病毒含量> 9000個家兔感染量，每頭份含細胞毒液> 0. 01ml。
11.一種使用權利要求I所述的豬睪丸克隆細胞生產豬瘟活疫苗。
全文摘要
本發明提供的一種高感染豬瘟病毒的豬睪丸克隆細胞株ST-B2，保藏號為CCTCC NO.C2011101。以及該豬睪丸克隆細胞的制備方法，包括以下步驟1)將豬睪丸細胞進行有限稀釋進行細胞克隆和亞細胞克隆，獲得亞細胞克隆株；2)選擇對豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞。本發明還提供了上述豬睪丸克隆細胞制備高滴度的豬瘟病毒液和豬瘟活疫苗的方法。本發明的豬睪丸克隆細胞，對豬瘟病毒感染率高，使用該豬睪丸細胞系ST克隆細胞株ST-B2以帶毒傳毒的方法生產的豬瘟疫苗，病毒滴度高，不易受到BVDV的污染，疫苗純凈性好；帶毒傳毒的方法使得每次復蘇的細胞可以持續傳代達至少15代，減少了復蘇細胞與接毒的次數，簡化了生產工藝，提高了生產效率。
文檔編號C12R1/91GK102965332SQ201110391978
公開日2013年3月13日 申請日期2011年11月30日 優先權日2011年11月30日
發明者張許科, 孫進忠 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司