一種豬瘟疫苗感染性cDNA及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品技術領域，涉及利用反向遺傳操作獲得一種豬瘟弱毒疫 苗C株感染性cDNA克隆，同時涉及該感染性cDNA克隆在構建高效價重組豬瘟活疫苗和豬 瘟疫苗載體中的應用。
【背景技術】
[0002] 豬瘟是豬的一種傳染性極強的病毒性疾病，早期稱為豬霍亂（HogCholera，HC)， 可感染各種年齡豬，一年四季流行，發病率和死亡率均很高，危害巨大。豬瘟的病原體是豬 癌病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV)，在國際獸疫局（0IE)制定的《國際動物衛 生法典》中，豬瘟被列入A類16種法定報告的傳染病之一。我國近年來豬瘟頻發，給養豬業 造成嚴重經濟損失，妨礙了養豬業的發展和出口貿易。加強對豬瘟的有效防控，是促進養豬 業健康發展、提高養殖效益和讓國民吃上放心肉的必然要求；發展高效的豬瘟控制技術和 疫苗制品，提升豬瘟防控水平是科技工作的重大課題。
[0003]CSFV基因組為長約12. 3kb的單股正鏈RNA，由5'末端非編碼區（5'Untranstaled 1'叩1〇11，5'^'1〇、一個大的開放閱讀框架（01^)和3'末端非編碼區（3'^'1〇構成。01^編碼 一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，多聚蛋白在翻譯過程中或翻譯后，被病毒自身 編碼的蛋白酶和宿主細胞的蛋白酶加工成12種成熟蛋白質，包括4種結構蛋白C、Ems、El、 ￡2和8種非結構蛋白『。、？7、呢2、呢3、呢44、548、呢5八和呢58。其中41:'￡1和￡2嵌入 脂質雙層膜中，在病毒粒子表面形成突觸，介導病毒的吸附與入侵，是CSFV毒力相關因子 和保護性抗原蛋白。E2常以同源二聚體或E1E2異源二聚體存在于病毒粒子和宿主細胞的 表面；CSFV感染豬體能誘導機體產生Ems和E2抗體，對豬體再次感染豬瘟有保護作用。
[0004] 豬瘟疫苗接種是預防和控制豬瘟的最有效方法。早在1951年，我國研究人員篩選 出免疫原性優良的CSFV石門毒株（殷震，1997)，該毒株作為中國CSFV標準強毒株沿用至 今。當時使用CSFV石門毒株，滅活制成豬瘟結晶紫甘油滅活疫苗，使用后迅速控制了我國 的豬瘟疫情。1954-1956年間，中國獸藥監察所等單位的研究人員將CSFV強毒株（其中包括 標準強毒石門株）適應家兔，在兔體內連續傳代，選育出一株對豬基本無毒力，并保持CSFV 免疫原性的兔化毒株，即中國豬癌兔化弱毒疫苗株（hogcholeralapinizedvaccine, HCLV)，簡稱豬瘟疫苗C株。豬瘟兔化弱毒疫苗的成功研制和應用，對我國豬瘟的預防和控 制起了決定性作用。然而，豬瘟兔化弱毒疫苗60年來的廣泛使用，并未控制豬瘟的發生。盡 管疫苗的接種劑量和免疫次數增加，不僅沒有根除豬瘟，近年來，我國豬瘟的發生出現了許 多新特點，表現為從頻發的大流行轉變為無規律的散發流行；臨床癥狀從典型變為非典型 豬瘟，病毒毒力降低，病程由急性、亞急性轉變為以慢性為主，出現持續感染、胎盤感染、母 豬繁殖障礙以及新生仔豬的先天性感染等。豬瘟疫苗株在細胞中增殖滴度不高、制備高效 價疫苗困難是導致疫苗保護效力低下和豬瘟防控困難的重要原因之一。豬瘟的發生、傳播 和流行是嚴重制約我國養豬業健康發展、增加農民收入和發展國際貿易的瓶頸。
[0005] 為滿足我國預防、控制和最終根除豬瘟的需要，研制新一代高效價豬瘟疫苗制品， 提高豬瘟疫苗免疫保護效力，勢在必行。此外，提高豬瘟疫苗細胞生長滴度也是降低疫苗生 產企業生產成本、提高疫苗質量和效益的根本保證。
[0006] 另一方面，CSFV感染引起豬體的免疫抑制，感染CSFV的豬體更容易發生圓環病 毒、豬繁殖和呼吸綜合癥病毒、乙型腦炎病毒等的混合感染，導致豬死亡率更高，危害更加 巨大。基于豬瘟活疫苗載體表達其他病原保護性抗原蛋白構建雙價疫苗，能同時防控豬瘟 及相關豬病，具有重要的應用價值。
【發明內容】
[0007] 本發明的首要目的是提供一種豬瘟疫苗的全長感染性cDNA，該全長感染性cDNA 包含了豬瘟疫苗種毒全長cDNA、在該cDNA5'末端融合豬RNA聚合酶I啟動子，在cDNA 3'插入鼠RNA聚合酶I終止子；
[0008] 進一步的，本發明提供豬瘟疫苗C株的全長感染性cDNA，該全長感染性cDNA包 含了豬瘟疫苗C株全長cDNA、在該cDNA5'末端融合豬RNA聚合酶I啟動子（GenBank No.L31782. 1)，其序列為SEQIDNO:1 ;在cDNA3'插入鼠RNA聚合酶I終止子，其序列為 SEQIDNO：2 ；
[0009] 為實現上述目的，本發明提供一種構建上述豬瘟疫苗C株的全長感染性cDNA克隆 的方法，包括：
[0010] 1)以豬瘟疫苗C株RNA為模板，應用根據豬瘟疫苗C株全長基因組序列（Genbank No.AF091507)設計合成的6對特異性PCR擴增引物（SEQIDNO:3-14)，采用RT-PCR，獲得 豬瘟疫苗C株全長基因組6個cDNA片段（CSf1-6);
[0011] 2)將所擴增的PCR片段采用限制性內切酶消化、T4連接酶連接的策略，克隆到質 粒載體中；
[0012] 3)豬瘟疫苗C株感染性cDNA克隆質粒的構建：
[0013] (1)構建5'端半長基因組大片段：即將片段CSfl、CSf2和CSf3依次連接到低拷 貝質粒PACNR1180 (由N.Ruggli和J.D.Tratschin博士贈送），構建pA-CSf123;
[0014] (2)構建3'端半長基因組大片段：即將片段CSf4、CSf5和CSf6依次連接到低拷 貝質粒PACNR1180,構建pA-CSf456;
[0015] (3)構建融合豬RNA聚合酶I啟動子的豬瘟疫苗5 '末端的重組質粒 pSPI-CSfl23；
[0016]A).豬RNA聚合酶I啟動子（pSPolI)片段制備：根據豬RNA聚合酶I啟動子序列 (GenBankNo.L31782. 1)設計啟動子片段PCR擴增引物（SEQIDN0:15-16)，以豬源PK-15 細胞的DNA為模板，擴增豬RNA聚合酶I啟動子，采用DNA回收試劑盒純化PCR產物，測序 確證，-70°C保存備用；
[0017]B).豬瘟疫苗C株5 '末端784bp片段擴增：構建豬瘟疫苗cDNA序列，設計一對 PCR引物（SEQIDN0:17-18)，擴增基因組Y末端784bp片段，以pA-CSfl23重組質粒為 模板，采用DNA回收試劑盒純化PCR產物，測序確證，-70°C保存備用；
[0018]C).pACNR1180載體骨架片段擴增：根據pACNR1180載體序列（SEQIDN0 :19)設 計擴增引物（SEQIDN0 :20-21)，以pA-CSf123重組質粒為模板，獲得pACNR1180載體片段 PCR產物，采用DNA回收試劑盒純化PCR產物，測序確證，-70°C保存備用；
[0019] D).融合豬瘟疫苗C株5'末端和豬RNA聚合酶I啟動子的PACNR1180載體骨 架片段擴增：以上述制備的豬瘟疫苗C株5'末端784bp片段、豬RNA聚合酶I啟動子和 PACNR1180載體片段混合物為模板，以SEQ ID N0 :20為上游引物、SEQ ID N0 :18為下游引 物，PCR擴增獲得融合豬瘟疫苗5'末端和豬RNA聚合酶I啟動子的pACNR1180載體骨架片 段PCR產物A-SPI-CS-5'，采用DNA回收試劑盒純化PCR產物，測序確證，-70°C保存備用；
[0020] E).融合豬RNA聚合酶I啟動子的豬瘟疫苗5'末端重組質粒PSPI-CSH23構建： 分別用限制性內切酶Pmll和Mlul雙酶切消化質粒pA-CSfl23和A-SPI-CS-5' DNA片段， DNA回收試劑盒純化制備A CSfl23和A-SPI-CS-5'片段，兩種片段按1:2混合，T4DNA連 接酶連接、轉化，挑選陽性克隆，測序確證得到PSPI-CSH23 ;
[0021] (4)構建融合鼠RNA聚合酶I終止子〇\)的豬瘟疫苗3'末端重組質粒 pA-CSf456-TI:
[0022] 根據鼠RNA聚合酶I終止子序列（SEQIDNO:2)和豬瘟疫苗C株3'末端序列， 設計合成融合鼠終止子序列的長序列引物（SEQIDN0:9、22)，以重組質粒pA-CSf456為模 板，通過PCR獲得融合鼠RNA聚合酶I終止子的豬瘟疫苗3'末端PCR產物05€456-1'1片 段；
[0023] 分別用限制性內切酶SphI和Mlul雙酶切消化質粒pA-CSf456和03€456-1'1片 段，DNA回收試劑盒純化制備雙酶切粘性末端的線性化pA-CSf456和CSfASe-t片段，兩 種片段按1:3-1:10摩爾比例混合，T4DNA連接酶連接、轉化，挑選陽性克隆，測序確證得到 pA-CSf456-TI；
[0024] (5)基于豬RNA聚合酶I啟動子（pSPolI)和鼠RNA聚合酶I終止子〇\)的豬瘟 疫苗感染性cDNA克隆pASPITfCS構建：
[0025] 將上述構建的豬瘟疫苗5'末端大片段質粒pSPI_CSfl23和3'末端大片段質粒 pA-CSf456-TAv別用BamHI和Mlul雙酶切消化，回收線性化pSPI-CSf123和CSf456-T:片 段，兩者按4:1摩爾比例混合，T4DNA連接酶連接、轉化，挑選陽性克隆