篩查16SrXIX組植原體的芯片及其應用的制作方法

專利名稱：篩查16SrXIX組植原體的芯片及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物信息學及生物檢疫鑒定技術領域，尤其涉及篩查16SrXIX組植原體的芯片及其應用。
背景技術：
16Sr XIX組植原體主要包括中國板栗黃化皺縮植原體、日本板栗叢枝植原體。 板栗植原體病害在日本的日本板栗種上首次報道，被命名為植原體黃化病(chestnut yellows disease)，后通過電鏡觀察確定為植原體相關病害。韓國報道的由植原體引起板栗小葉病(chestnut little leaf, CLL)也發生在日本板栗上，異源雙鏈分析結果認為與翠菊黃化植原體組較為接近，后來Jimg等通過分子鑒定手段對引起典型叢枝癥狀的板栗叢枝病(chestnut witches，-broom, CnffB)病原鑒定為一個新的候選種Candidatus phytoplasma castanea。意大利也曾報道歐洲板栗上發生黃化病，但一直未確定其病原。早在上世紀九十年代，北京地區調查發現個別板栗園內出現葉片黃化皺縮的現象，并有逐漸擴展蔓延的趨勢。至2007年已在多個板栗園內發生，造成樹體衰退、板栗減產、甚至樹木死亡。由于缺乏針對性的檢測鑒定方法，常常被推斷為生理性或病毒性病害。目前，針對16SrXIX組植原體的檢測方法主要為①血清學檢測方法，靈敏度不高， 易產生假陽性；②基于核酸的分子生物學檢測技術，主要包括PCR、實時熒光PCR等技術，靈敏度和特異性相對較高，但存在交叉污染，在通用性和標準化方面存在不足。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種DNA分子。本發明提供的DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列1。本發明的另一個目的是提供一種篩查16SrXIX組植原體的基因芯片。本發明提供的篩查16SrXIX組植原體的基因芯片，為將上述的DNA分子固定在芯片表面得到的基因芯片。在上述基因芯片中，所述芯片為醛基化玻璃片基芯片。在上述基因芯片中，所述16SrXIX組植原體為板栗黃化皺縮植原體。本發明的第三個目的是提供一種篩查16SrXIX組植原體的試劑盒。本發明提供的試劑盒，包括上述的基因芯片。在上述試劑盒中，還包括由引物1、引物2和引物3組成的引物組；所述引物1、引物2和引物3的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列2、序列3、 序列4 ；上述試劑盒由上述的基因芯片和上述引物組組成。上述試劑盒中，所述16SrXIX組植原體為板栗黃化皺縮植原體。本發明的第四個目的是提供一種用于篩查16SrXIX組植原體的引物組。本發明提供的引物組，為如下1)或2)
1)所示的引物組為由引物1和引物2組成的引物組；2)所示的引物組為由引物1和引物3組成的引物組；所述引物1、引物2和引物3的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列2、序列3、 序列4 ；所述16SrI組植原體具體為板栗黃化皺縮植原體。上述引物組中，所述16SrXIX組植原體具體為板栗黃化皺縮植原體。本發明還提供一種用于篩查16SrXIX組植原體的PCR試劑。本發明提供的PCR試劑，由上述的引物組、dNTP、PCR緩沖液和聚合酶組成。上述PCR試劑中，上述引物組中的各條引物在所述PCR試劑中的濃度均為 0.2mmol/L。上述DNA分子、上述基因芯片、上述的試劑盒、上述的引物組或上述的PCR試劑在鑒定或輔助鑒定16SrXIX組植原中的應用也是本發明保護的范圍；所述16SrI組植原體具體為板栗黃化皺縮植原體。上述DNA分子、上述基因芯片、上述的試劑盒、上述的引物組或上述的PCR試劑在制備鑒定或輔助鑒定16SrXIX組植原產品中的應用也是本發明保護的范圍；所述16SrI組植原體具體為板栗黃化皺縮植原體。本發明的第五個目的是提供一種篩查或輔助篩查待測樣品感染16SrXIX組植原體的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟1)將待測樣品的基因組DNA進行標記，得到標記后產物；2)將步驟1)得到的標記后產物與上述的基因芯片進行雜交，得到雜交后芯片；2)將步驟1)得到的雜交后芯片掃描，若所述基因芯片上的探針的信號絕對值大于5000且信噪比大于3. 0，則待測樣品感染或候選感染16SrXIX組植原體。在上述方法中，步驟1)中，所述標記為以待測樣品的基因組DNA為模板，以上述引物組進行PCR擴增，得到標記后產物；在上述方法中，步驟2)中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h。在上述方法中，在所述步驟2、后和步驟幻前還包括將所述雜交后芯片進行洗滌的步驟。在上述方法中，所述16SrXIX組植原體為板栗黃化皺縮植原體。本發明的實驗證明，利用DNA芯片技術具有高通量、快速、穩定性好、防交叉污染等優點，針對16SrXIX組植原體設計通用型引物與探針并實施DNA芯片檢測技術可以大大提高我國檢驗檢疫口岸通關速率，并對于未知的、新發植原體進行有效的監測與鑒定。本發明提供的篩查16SrXIX組植原體的芯片中的探針具有16SrXIX組植原體組水平上的高兼容性和植原體組內的特異性，數小時內完成對待檢樣品中可能存在的新發植原體的篩查，所需的樣品量極少，一般僅需0. lg。另外數據的分析與計算機圖像處理軟件相結合，達到分析結果能夠直觀化、可視化。本發明采用生物信息學方法對16SrXIX組植原體的16S rDNA核苷酸序列進行分析，設計了該組的兼容性探針，標準植原體樣品驗證結果證明探針效果良好。本發明的篩查16SrXIX組植原體的芯片可用于16SrXIX組植原體的檢疫鑒定。


圖1為16SrXIX組植原體篩查芯片探針點陣示意圖(5X3)圖2為應用板栗黃化皺縮植原體標準樣品驗證16SrXIX組植原體篩查芯片的結果圖3為篩查芯片靈敏度檢測結果圖4為PCR靈敏度檢測結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、篩查16SrXIX組植原體的芯片的制備1、組級高兼容性寡核苷酸探針的設計1)從美國國立生物技術信息中心(NCBI)及核糖體數據庫項目官方網站(RDP)數據庫下載16SrXIX組植原體全基因組及核酸序列數據用于設計探針。2)整理植原體核酸序列，去除小于200bp長度的核酸序列并分組；同一組內所有植原體序列簡稱為組內序列，非本組的所有植原體序列簡稱為組外序列。3)使用ClusterW聯配組內序列，尋找序列保守區域設計探針。探針設計時在序列保守區域內以2 3個堿基作為間隔，連續提取所有19bp的核酸序列，對選取的核酸序列進行篩選，標準為GC含量在40%及60%之間，沒有大于!3bp的連續重復堿基，以及不會形成大于:3bp的發卡結構。4)使用自編程序將通過步驟幻篩選的探針序列與組外序列聯配，程序計算二級結構的自由能、MMPD(The distance of the mismatch in the middle position)、最長相同片段等條件進行綜合打分，棄用高于模擬雜交標準分的探針。5)使用自編程序將通過步驟4)篩選的探針序列與組內序列進行比對，程序計算打分，棄用低于模擬雜交標準分的探針。6)使用BLASTN將通過步驟5)篩選得到的探針序列與步驟2)得到的特異性數據庫進行特異性比對，Word size設為7，篩選標準為Max Score小于15分，并且無7bp以上的相同片段7)對于剩余的每一條探針進行排序，排序標準依次為探針對組內序列模擬雜交總分、探針對組外序列模擬雜交總分及探針對特異性數據庫的BlastN Max Score總分，取排名前兩名的兩條探針為組特異性探針。8)如果經過步驟7)無法達到每組至少1個探針對應的標準，則在步驟3)降低序列保守性標準，重新設計，依此循環直到所有16SrXIX組序列都有1個探針對應。如果無法從保守區域設計探針，或16SrXIX組內序列無保守區域，則使用所有16SrXIX組全長序列設計探針。探針設計標準與步驟；3)到步驟7)相同。根據上述原則設計了 16S rDNA區域的1條探針(探針35)，其核苷酸序列為序列表中的序列1所示。可以人工合成上述探針。2、芯片的制備
上述上述1得到的1條探針用點樣緩沖液(博奧生物有限公司晶芯 芯片點樣液， 產品目錄號440010)溶解，濃度為50μΜ，每條探針橫向重復3點點在醛基化玻璃片基芯片 (博奧生物有限公司晶芯 微陣列基片，產品目錄號420022)上，每點約0. 25nL,點直徑約 180 μ m，點間距為300 μ m，點樣均勻度的標準方差為15%。將芯片點有探針的一面在65°C 水浴鍋上水合10s，芯片距水面距離為3cm，在空氣中室溫自然干燥，在進行一次水合。將點有探針的一面向上，放在紫外交聯儀中250mJ交聯。將芯片放在42°C預熱，0. 5% SDS清洗lOmin。將芯片轉移到42°C預熱蒸餾水中清洗aiiin。把芯片放在50ml錐形離心管中， 2000rpm離心lmin，以去除芯片表面的液體，獲得篩查16SrXIX組植原體的芯片。篩查16SrXIX組植原體的芯片如圖1所示，圖1中35為16SrXIX組植原體篩查芯片探針35 (對應序列1)，Hex為芯片固定陽性質控，PC為雜交陽性質控，NC為雜交陰性質控。實施例2、篩查16SrXIX組植原體的芯片的應用一、篩查16SrXIX組植原體的芯片檢測樣品1、用于檢測的樣品總DNA提取1)取感染板栗黃化皺縮植原體的板栗葉片(葉片表現黃化皺縮癥狀，植原體拉丁名Chinese chestnut yellow crinkle phytoplasma，記載在Molecular identification and characterization of a new phytoplasma strain associated with Chinese chestnut yellow crinkle disease in China. Forest Pathology，2011，41 (3) :233-236.， 公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。)0. lg，取適量液氮研磨，再加入研磨液2ml充分研磨，4°C 20000rpm離心20min，棄上清。2)加入ImlDNA提取液，40ul蛋白酶K(5mg/ml)，輕輕混勻，加入160ul 10%十二烷肌氨酸鈉，混勻，在55°C溫育1 2小時，期間不斷的顛倒混勻，4°C 6000rpm, IOmin,取上清。3)加入2/3體積異丙醇到上清液中，輕混勻，-20°C保持至少30min，4°C 12000rpm, 15分鐘，棄上清。4)加入600ul帶有RNase的水液，加入30ulSDS，12ul蛋白酶K，輕輕徹底混勻， 37°C溫育30 60分鐘。5)加IOOul 5M NaCl混勻，再加入84ulCTAB/NaCl溶液混勻，65°C溫育10分鐘。6)加入等體積苯酚氯仿異戊醇05 24 1)混勻，4°C 12000rpm，10分鐘，
重復直至無中間白色層。7)上層水相加入等體積氯仿異戊醇04 1)，混勻，4°C 12000rpm，10分鐘。8)上清液加入2/3體積異丙醇，混勻，_20°C保持至少30分鐘，4°C 12000rpm, 10分
鐘，棄上清液。9)加入Iml 70%乙醇12000rpm離心1分鐘。洗滌兩次。加入30ul TE混勻溶解， 得到板栗黃化皺縮植原體的總DNA。2、樣品標記與雜交標記體系為20 μ L，即在0. 2mL的反應管中加入2 μ L上述1得到的總DNA、上游引物 0. 2 μ L (0. 2mmol/L)、下游引物 0. 2 μ L (0. 20mmol/L, 5，端 TAMARA 標記)、dNTP Mix (10mmol/L) 1· 6 μ L、LA-Taq 酶 0· 5 μ L、10 X Buffer (Mg2+) 2 μ L 及 DEPC—H2013. 5 μ L。 6
上下游引物為序列表中的序列2和序列3所示的DNA分子；上下游引物為序列表中的序列2和4所示的DNA分子進行擴增，結果與上下游引物為序列表中的序列2和序列3所示的DNA分子無顯著差異。PCR 反應程序-MV 5min ；94°C 30sec，60°C 30sec，72°C Imin 30sec, 35cycles ； 72°C IOmin。雜交雜交液包括2. 4μ L 3XSSC.0. 32 μ L 0. 2% SDS、4 μ L25% 甲酰胺、0. 32 μ L 外標、1. 6 μ L5XDenhard，s及標記樣品7. 36 μ L ；95°C變性3min,冰浴5min,瞬時離心；將雜交液加到由實施例1得到的16SrXIX組植原體篩查芯片上，蓋薄片蓋好，42°C水浴雜交過夜(1池)，得到雜交后的芯片(板栗黃化皺縮植原體)。3、洗滌、掃描清洗體系及程序如下
洗液I洗液II
洗液組分(最終濃度)2xSSC, 0.2%SDS 0.2XSSC
清洗溫度42。C42 V
清洗時間4min4min先將洗液I、II放在微波爐中預熱到42°C，轉移到清洗盒中。雜交結束后，將雜交后的芯片轉移到盛放洗液的清洗盒中，雜交面向上，放在水平搖床上緩慢清洗。芯片清洗后，放在50ml錐形離心管中，2000rpm離心lmin，除去芯片表面的液體，分別得到待檢測芯片(板栗黃化皺縮植原體)。將上述待檢測芯片(板栗黃化皺縮植原體)置于掃描儀中進行掃描分析；PMT設為900，獲得各點熒光強度、背景強度等數據。使用博奧生物開發的LuxScan 3. O從掃描的芯片中提取數據，探針的信號值為探針前景值的中位值減去背景值的中位值。信噪比為圖像對應點內所有信號值中位值與背景值中位值的比值。探針的信號絕對值大于5000且信噪比大于3. 0，判為陽性(為16SrXIX組植原體感染)；信號絕對值小于5000且信噪比小于2.0，判為陰性(不為16SrXIX組植原體感染)； 如果信號模糊且信噪比介于2. O和3. O之間，判為可疑，實驗需重復驗證。圖2的探針排列與圖1相同，陽性探針均為35。板栗黃化皺縮植原體的結果如圖2所示，探針35有信號，探針35所在位置的信號絕對值均為7000;且信噪比為4，說明本發明可以檢測16SrXIX組植原體的板栗黃化皺縮植原體；上述芯片的固定陽性質控、雜交陽性質控及雜交陰性質控表現良好，標準樣品雜交信號強而無背景噪音，說明設計的探針及建立的芯片篩查程序具有良好的工作效果。二、篩查16SrXIX組植原體芯片與PCR檢測靈敏度比較準確稱取0. Ig板栗黃化皺縮植原體感染的板栗葉片，提取基因組DNA，用于 IBSrXIX組植原體篩查芯片和PCR實驗，分別進行PCR檢測和芯片檢測，兩者所用的DNA均進行5^5^5^5-3和5_4倍梯度稀釋。芯片檢測的方法同上述的一；
芯片檢測實驗結果如圖3所示，圖3的探針排列與圖1相同，其中A :5_2稀釋；B 5_3稀釋；C :5_4稀釋；可以看出，16SrXIX組植原體篩查芯片可檢測到待檢對象的最高稀釋倍數為54。PCR檢測的引物為上游引物5，-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，(序列2)；下游引物1 5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3‘(序列 3)；PCR檢測的結果如圖4所示，1 :5°稀釋；2斤1稀釋；3 :5_2稀釋；4 :5_3稀釋；5 5-4稀釋；M =Marker DL2000，可以看出，均得到1491bp的產物(Genbank號EU416200的第 2-1492位核苷酸)，待檢對象的最高稀釋倍數為54。也可以將下游引物換為下游引物2 :5’ -AGGAGGTGATCCAACCGCA-3，(序列4)，結果
無顯著差異。因此，IBSrXIX組植原體篩查芯片檢測靈敏度與PCR方法靈敏度相當。
權利要求
1.一種DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列1。
2.—種篩查16SrXIX組植原體的基因芯片，為將權利要求1所述的DNA分子固定在片基表面得到的基因芯片。
3.根據權利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述片基為醛基化玻璃片基；所述 16SrI組植原體為板栗黃化皺縮植原體。
4.一種篩查16SrXIX組植原體的試劑盒，包括權利要求2或3所述的基因芯片。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括由引物1、引物2和引物3組成的引物組；所述引物1、引物2和引物3的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列2、序列3、序列4 ；所述試劑盒由權利要求2或3所述的基因芯片和所述引物組組成； 所述16SrI組植原體為板栗黃化皺縮植原體。
6.一種用于篩查16SrXIX組植原體的引物組，為如下1)或2)1)所示的引物組為由引物1和引物2組成的引物組；2)所示的引物組為由引物1和引物3組成的引物組；所述引物1、引物2和引物3的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列2、序列3、序列4；所述16SrI組植原體具體為板栗黃化皺縮植原體。
7.權利要求1所述DNA分子、權利要求2或3所述的基因芯片、權利要求4或5所述的試劑盒或權利要求6所述的引物組在鑒定或輔助鑒定16SrXIX組植原中的應用；所述 16SrI組植原體具體為板栗黃化皺縮植原體。
8.權利要求1所述DNA分子、權利要求2或3所述的基因芯片、權利要求4或5所述的試劑盒或權利要求6所述的引物組在制備鑒定或輔助鑒定16SrXIX組植原產品中的應用； 所述16SrI組植原體具體為板栗黃化皺縮植原體。
9.一種篩查或輔助篩查待測樣品感染16SrXIX組植原體的方法，包括如下步驟1)將待測樣品的基因組DNA進行標記，得到標記后產物；2)將步驟1)得到的標記后產物與權利要求2或3所述的基因芯片進行雜交，得到雜交后芯片；2)將步驟1)得到的雜交后芯片掃描，若所述基因芯片上的探針的信號絕對值大于5000且信噪比大于3. 0，則待測樣品感染或候選感染16SrXIX組植原體。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述標記為以待測樣品的基因組DNA為模板，以權利要求4或5所述的試劑盒或權利要求6所述的引物組中的引物組進行PCR擴增，得到標記后產物； 步驟幻中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h; 在所述步驟幻后和步驟幻前還包括將所述雜交后芯片進行洗滌的步驟； 所述16SrI組植原體為板栗黃化皺縮植原體。
全文摘要
本發明公開了一種篩查16SrXIX組植原體的芯片及其應用。本發明提供一種DNA片段，，其核苷酸序列為序列表中的序列1。還提供了篩查16SrXIX組植原體的芯片，為將上述的DNA片段固定在芯片表面得到的基因芯片。本發明的實驗證明，本發明采用生物信息學方法對16SrXIX組植原體的16S rDNA核苷酸序列進行分析，設計了該組的兼容性探針，標準植原體樣品驗證結果證明探針效果良好。本發明的篩查16SrXIX組植原體的芯片可用于16SrXIX組植原體的檢疫鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102433332SQ20111040276
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者張永江, 朱水芳, 牟海清, 趙文軍 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院