專利名稱：一種可快速解離型三維細胞培養載體及制備方法
一種可快速解離型三維細胞培養載體及制備方法技術領域
本發明屬于體外細胞培養技術領域，特別是一種可快速解離型三維細胞培養載體及制備方法。
背景技術：
細胞培養是許多生物工程技術中必不可少的基本過程。目前，細胞培養主要采用基于聚苯乙烯培養板的單層培養，細胞在二維平面內生長。這種技術在整個生物工程技術發展中曾經和正在發揮著巨大的作用。然而，在許多生命科學基礎研究中，人們越來越多地發現單層培養技術獲得的研究結果與體內真實情況不一致。其主要原因是，與體內細胞所處的三維微環境相比，二維細胞培養方式培養的細胞在性狀等方面發生了明顯改變，影響了人們對體內細胞行為和功能的正確理解。近年來，伴隨組織工程技術而興起的三維細胞培養技術得到了快速發展，成為彌合二維單層細胞培養和動物/體內實驗結果間差異的橋MTTC。
三維細胞培養技術的不斷進步不僅極大地推動了組織工程技術的快速發展，而且在細胞/分子生物學、腫瘤發生發展模型、藥物篩選、臨床藥效評價與預測等領域引起科學工作者的極大興趣，發揮著越來越大的作用[Abbott A. Nature，2003，424 :870]。尤其是在三維腫瘤模型建立方面，更是如此。與二維單層培養相比，三維細胞培養模型在模擬體內細胞生長環境和細胞/環境間相互作用方面優勢明顯，其培養的細胞在細胞表型、生長行為、 能量代謝等方面更接近體內真實細胞，更具生理學意義。其原因是，二維模型過于簡單化， 忽略了細胞-細胞間、細胞外基質-細胞間和整個微環境信號轉導等的影響[Fischkich C， Chen R, Matsumoto T,et al. Nat Methods,2007,4 :855]。
三維細胞培養是指將細胞種植于模擬細胞外基質微環境的三維多孔載體材料中， 經共培養實現細胞分化、增殖和生長，形成細胞-載體復合體。在三維細胞培養技術中，多孔載體的理化性質和多孔結構特性至關重要，它們決定著載體內細胞生長、增殖、遷移和生長等過程[Burdett E, Kasper FK, Mikos AG, et al. Tissue Eng =Part B，2010，16 :351]。 傳統上，三維細胞培養模型主要有生物凝膠包埋、多細胞球、多層細胞和器官型培養等，它們均在一定程度上體現了體內三維微環境的異質性。其中，不使用三維生物材料的三維模型存在多細胞球直徑小、成熟時間長、細胞死亡等問題[Ong S M，Zhao Z Q，Arooz T， et al. Biomaterials, 2010, 31 :1180]。目前，三維培養體系常用材料為生物凝膠，如膠原和Matrigel等，其優點是具有細胞外基質的部分生物學性質，但存在批次差異性大、加工性能和強度差、致病風險等問題，致使研究重現性不夠理想。為此，人們正在積極尋找生物凝膠的替代物，這方面的研究主要集中于生物高分子材料，如藻酸鹽、透明質酸、殼聚糖、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乳酸和聚己內酯等，它們在分子設計靈活性、修飾改性方面表現優異，由其制成的三維多孔載體在空間結構、生物學性質、理化性質和力學性質等方面易調控。
然而，在越來越多的情況下，需要在三維共培養結束時需要將細胞與載體材料分離，便于深入研究載體三維多孔結構和理化性質、培養期間對細胞的人為干預因素對細胞生長行為、基因和蛋白表達情況的影響。如腫瘤學家在利用三維模型研究腫瘤細胞生長微環境與腫瘤表型和定量蛋白表達時，就需要在三維共培養結束時將細胞與載體材料分開， 才能進行蛋白質組學等的研究。然而，目前常用的多孔載體材料降解速度慢，難以滿足三維培養結束時細胞和載體材料快速有效分離的實際應用要求。因此，開發能響應各種刺激因素而實現解離的智能型多孔載體材料就成為當務之急。如采用對溫度敏感的可逆膠凝體系——聚己內酯-聚(聚乙二醇乙醚甲基丙烯酸酯)微粒，可在細胞培養后實現細胞與材料的有效分離[Ghanami RCA, Saunders B R, Bosquillon C, et al. Soft Matter, 2010, 6，5037]。在天津大學申請的中國發明專利(尹玉姬，等.殼聚糖修飾的海藻酸鹽水凝膠三維多孔載體及其制備方法.申請號201010116334.7)中，發明人利用含二硫鍵的二元胺為交聯劑制成了海藻酸鹽水凝膠，具有響應還原劑而解離的能力，但這種水凝膠力學性能不夠理想，需要殼聚糖強化處理。
此外，動物模型作為最高級三維模型，存在倫理爭議、昂貴、不可預知因素、時間限制等不足，尤其是難以單獨研究控制細胞行為和功能的各種信號轉導通路。而基于多孔載體材料的三維細胞培養模型可有效克服上述問題，將逐漸成為動物模型的替代模型。發明內容
針對現有技術存在的上述不足和生物醫學領域新的應用需求，本發明的目的在于提供一種適于三維細胞培養和培養結束后細胞-載體材料快速有效分離的可快速解離型三維細胞培養載體及制備方法。
為達到上述目的，本發明可快速解離型三維細胞培養載體，以殼聚糖衍生物—— 羧甲基殼聚糖為原料，溶解于pH = 5 8的緩沖液后，加入碳二亞胺活化的交聯劑二硫代二元酸酯，經酰胺化反應形成水凝膠，再經冷凍干燥得到。
所述的用于羧甲基殼聚糖交聯的交聯劑二硫代二元酸酯中的二硫鍵在相應還原劑作用下快速斷裂，使多孔載體在水相中解離而溶解為溶液。
所述的二硫鍵還原劑為谷胱甘肽、2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)膦。
本發明可快速解離型三維細胞培養載體的制備方法包括以下步驟
1)殼聚糖羧甲基化改性將殼聚糖分散于質量分數為60%氫氧化鈉水溶液和異丙醇混合物中，于60°C攪拌回流1小時后加入殼聚糖質量0. 5 2. 5倍的氯乙酸，繼續反應 4小時，反應體系經無乙醇沉淀、乙醇-水混合物洗滌后在50°C真空干燥得黃色粉狀產物， 即為羧甲基殼聚糖；
其中殼聚糖氫氧化鈉水溶液異丙醇的質量比為1:4:8;
將羧甲基殼聚糖溶于0. 02mol/L 0. lmol/L、pH = 5 8的磷酸鹽緩沖液或 2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中制成質量百分比濃度為2% 5%的羧甲基殼聚糖溶液；
2)交聯劑活化將交聯劑二硫代二元酸溶于無水有機溶劑中制成質量濃度為 5% 15%的交聯劑溶液，再向其中依次加入碳二亞胺型活化劑N，N’ - 二環己基碳二亞胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫反應30 60分鐘，得到活化的交聯劑二硫代二元酸酯；
其二硫代二元酸N，N’ - 二環己基碳二亞胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基硫代琥珀酰亞胺的功能基團摩爾比為 1 1. 5 1. 5 ；
3)化學交聯在室溫攪拌條件下，將活化的交聯劑二硫代二元酸酯在20分鐘內滴加入羧甲基殼聚糖溶液中攪拌均勻后轉移至M孔培養板中，室溫反應M 36小時形成水凝膠，然后將其在蒸餾水中浸泡M小時，每4小時置換一次蒸餾水；
其中活化的交聯劑中的羧基與羧甲基殼聚糖中氨基間的摩爾比為2% 10% ；
4)冷凍干燥將步驟3)中得到的水凝膠在零下40°C冷凍干燥3天，得到殼聚糖基水凝膠即三維細胞培養載體。
所述的步驟1)乙醇-水混合物中乙醇水的體積比為4:1。
所述的殼聚糖為脫乙酰度為55% 95%、分子量為10 50萬。
所述的交聯劑二硫代二元酸為2，2’ - 二硫代二乙酸、3，3’ - 二硫代二丙酸或4， 4’ - 二硫代二丁酸。
所述的無水有機溶劑為甲醇、乙醇、二甲基亞砜或二甲基甲酰胺。
本發明采用生物相容性優異、廣泛應用的天然高分子材料殼聚糖為原料，經羧甲基化改性后，與碳二亞胺活化的交聯劑二硫代二元酸發生化學交聯反應，制備出殼聚糖基水凝膠，再經冷凍干燥后獲得三維多孔載體。該載體具有良好的力學性能和細胞相容性以及特異性的快速解離行為，與細胞體外共培養后形成細胞/載體材料復合物，此時可通過向培養體系加入一定濃度的還原劑使交聯橋中的二硫鍵斷裂，致使多孔載體快速解離成為水溶性羧甲基殼聚糖而溶解于細胞培養液中，細胞經離心過程從培養體系中分離出來，用于后續細胞功能和行為的研究。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明作進一步說明。所用原料和試劑均為市售商品。
實施例1
1)殼聚糖羧甲基化改性將殼聚糖分散于質量分數為60%氫氧化鈉水溶液和異丙醇混合物中，于60°C攪拌回流1小時后加入殼聚糖質量2倍的氯乙酸，繼續反應4小時， 反應體系經無乙醇沉淀、乙醇水的體積比為4 1的乙醇溶液洗滌后在50°C真空干燥得黃色粉狀產物，即為羧甲基殼聚糖；
其中殼聚糖為脫乙酰度為55% 95%、分子量為10 50萬；殼聚糖氫氧化鈉水溶液異丙醇的質量比為1:4:8;
將羧甲基殼聚糖溶于0. 05mol/L、pH = 6. 5的2_(N_嗎啉代)乙磺酸緩沖液中制成質量百分比濃度為2%的羧甲基殼聚糖溶液；
2)交聯劑活化將交聯劑3，3’ - 二硫代二丙酸溶于無水乙醇中制成質量濃度為 5%的交聯劑溶液，再向其中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與 N-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應30 60分鐘，得到活化的交聯劑3，3’ - 二硫代二元酸酯；
其交聯劑3，3’ - 二硫代二丙酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽N-羥基琥珀酰亞胺的功能基團摩爾比為1 1.5 1.5；
3)化學交聯在室溫攪拌條件下，將活化的交聯劑3，3’_ 二硫代二元酸酯在20分鐘內滴加入羧甲基殼聚糖溶液中攪拌均勻后轉移至M孔培養板中，室溫反應M 36小時形成水凝膠，然后將其在蒸餾水中浸泡M小時，每4小時置換一次蒸餾水；
其中活化的交聯劑中的羧基與羧甲基殼聚糖中氨基間的摩爾比為2% ；
4)冷凍干燥將步驟幻中得到的水凝膠在零下40°C冷凍干燥3天，得到殼聚糖基水凝膠即三維細胞培養載體。
實施例2
1)殼聚糖羧甲基化改性將殼聚糖分散于質量分數為60%氫氧化鈉水溶液和異丙醇混合物中，于60°C攪拌回流1小時后加入殼聚糖質量1倍的氯乙酸，繼續反應4小時， 反應體系經無乙醇沉淀、乙醇水的體積比為4 1的乙醇溶液洗滌后在50°C真空干燥得黃色粉狀產物，即為羧甲基殼聚糖；
其中殼聚糖為脫乙酰度為55% 95%、分子量為10 50萬；殼聚糖氫氧化鈉水溶液異丙醇的質量比為1:4:8;
將羧甲基殼聚糖溶于0. lmol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中制成質量百分比濃度為4%的羧甲基殼聚糖溶液；
2)交聯劑活化將交聯劑2，2’_ 二硫代二乙酸溶于無水二甲基亞砜中制成質量濃度為12%的交聯劑溶液，再向其中依次加入N，N’ - 二環己基碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應30 60分鐘，得到活化的交聯劑2，2’ - 二硫代二元酸酯；
其交聯劑2，2’-二硫代二乙酸N，N’_ 二環己基碳二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺的功能基團摩爾比為1 1.5 1.5;
3)化學交聯在室溫攪拌條件下，將活化的交聯劑2，2’_ 二硫代二元酸酯在20分鐘內滴加入羧甲基殼聚糖溶液中攪拌均勻后轉移至M孔培養板中，室溫反應M 36小時形成水凝膠，然后將其在蒸餾水中浸泡M小時，每4小時置換一次蒸餾水；
其中活化的交聯劑中的羧基與羧甲基殼聚糖中氨基間的摩爾比為5% ；
4)冷凍干燥將步驟3)中得到的水凝膠在零下40°C冷凍干燥3天，得到殼聚糖基水凝膠即三維細胞培養載體。
實施例3
1)殼聚糖羧甲基化改性將殼聚糖分散于質量分數為60%氫氧化鈉水溶液和異丙醇混合物中，于60°C攪拌回流1小時后加入殼聚糖質量0. 5倍的氯乙酸，繼續反應4小時，反應體系經無乙醇沉淀、乙醇水的體積比為4 1的乙醇溶液洗滌后在50°C真空干燥得黃色粉狀產物，即為羧甲基殼聚糖；
其中殼聚糖為脫乙酰度為55% 95%、分子量為10 50萬；殼聚糖氫氧化鈉水溶液異丙醇的質量比為1:4:8;
將羧甲基殼聚糖溶于0. 03mol/L、pH = 8的磷酸鹽緩沖液中制成質量百分比濃度為3%的羧甲基殼聚糖溶液；
2)交聯劑活化將交聯劑4，4’ - 二硫代二丁酸溶于無水甲醇中制成質量濃度為 8%的交聯劑溶液，再向其中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與 N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫反應30 60分鐘，得到活化的交聯劑4，4’ - 二硫代二元酸酯；
其交聯劑4，4’ - 二硫代二丁酸1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽N-羥基硫代琥珀酰亞胺的功能基團摩爾比為1 1.5 1.5；
3)化學交聯在室溫攪拌條件下，將活化的交聯劑4，4’_ 二硫代二元酸酯在20分鐘內滴加入羧甲基殼聚糖溶液中攪拌均勻后轉移至M孔培養板中，室溫反應M 36小時形成水凝膠，然后將其在蒸餾水中浸泡M小時，每4小時置換一次蒸餾水；
其中活化的交聯劑中的羧基與羧甲基殼聚糖中氨基間的摩爾比為8% ；
4)冷凍干燥將步驟幻中得到的水凝膠在零下40°C冷凍干燥3天，得到殼聚糖基水凝膠即三維細胞培養載體。
實施例4
1)殼聚糖羧甲基化改性將殼聚糖分散于質量分數為60%氫氧化鈉水溶液和異丙醇混合物中，于60°C攪拌回流1小時后加入殼聚糖質量2. 5倍的氯乙酸，繼續反應4小時，反應體系經無乙醇沉淀、乙醇水的體積比為4 1的乙醇溶液洗滌后在50°C真空干燥得黃色粉狀產物，即為羧甲基殼聚糖；
其中殼聚糖為脫乙酰度為55% 95%、分子量為10 50萬；殼聚糖氫氧化鈉水溶液異丙醇的質量比為1:4:8;
將羧甲基殼聚糖溶于0. 02mol/L、pH = 5的2_(N_嗎啉代)乙磺酸緩沖液中制成質量百分比濃度為5%的羧甲基殼聚糖溶液；
2)交聯劑活化將交聯劑3，3’_ 二硫代二丙酸溶于無水二甲基甲酰胺中制成質量濃度為15%的交聯劑溶液，再向其中依次加入N，N’ - 二環己基碳二亞胺與N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫反應30 60分鐘，得到活化的交聯劑3，3’ - 二硫代二元酸酯；
其交聯劑3，3’-二硫代二丙酸N，N’_ 二環己基碳二亞胺N-羥基硫代琥珀酰亞胺的功能基團摩爾比為1 1.5 1.5;
3)化學交聯在室溫攪拌條件下，將活化的交聯劑3，3’_ 二硫代二元酸酯在20分鐘內滴加入羧甲基殼聚糖溶液中攪拌均勻后轉移至M孔培養板中，室溫反應M 36小時形成水凝膠，然后將其在蒸餾水中浸泡M小時，每4小時置換一次蒸餾水；
其中活化的交聯劑中的羧基與羧甲基殼聚糖中氨基間的摩爾比為10% ；
4)冷凍干燥將步驟幻中得到的水凝膠在零下40°C冷凍干燥3天，得到殼聚糖基水凝膠即三維細胞培養載體。
本發明相對于現有技術所具有的優點及有益效果
(1)以殼聚糖衍生物——羧甲基殼聚糖為原料，利用冷凍干燥法制備多孔載體，既保證了載體生物相容性和多孔性，又具有良好的力學性能和降解性能。
(2)采用條件溫和的化學交聯方法，即以二硫鍵二元酸作為交聯劑，經碳二亞胺活化后實現水溶性羧甲基殼聚糖交聯，制備的水凝膠載體可特異性響應谷胱甘肽等還原劑而快速解離，并溶解于培養液中。
(3)本發明的化學交聯過程、多孔載體還原解離與溶解均是在中性或接近中性條件下進行的，與細胞培養液的PH范圍一致，不會對細胞造成不利影響。
(4)作為載體原料的羧甲基殼聚糖，其中含有的羧基可用于直接修飾生物因子或蛋白質以提高生物學性能，也可作為仿生礦化的誘導活性點，適用于多種三維細胞培養和組織工程技術。
(5)本發明中雖然用到了有機溶劑，但它們均是與水混溶的溶劑，在多孔載體制備過程中均已除去，不會殘留于最終的多孔載體中，不對細胞生長造成任何有害影響。
權利要求
1.一種可快速解離型三維細胞培養載體，其特征在于以殼聚糖衍生物——羧甲基殼聚糖為原料，溶解于PH = 5 8的緩沖液后，加入碳二亞胺活化的交聯劑二硫代二元酸酯， 經酰胺化反應形成水凝膠，再經冷凍干燥得到。
2.根據權利要求1所述的可快速解離型三維細胞培養載體，其特征在于所述的用于羧甲基殼聚糖交聯的交聯劑二硫代二元酸酯中的二硫鍵在相應還原劑作用下快速斷裂，使多孔載體在水相中解離而溶解為溶液。
3.根據權利要求要求2所述的可快速解離型三維細胞培養載體的制備方法，其特征在于所述的二硫鍵還原劑為谷胱甘肽、2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)膦。
4.一種可快速解離型三維細胞培養載體的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)殼聚糖羧甲基化改性將殼聚糖分散于質量分數為60%氫氧化鈉水溶液和異丙醇混合物中，于60°C攪拌回流1小時后加入殼聚糖質量0. 5 2. 5倍的氯乙酸，繼續反應4小時，反應體系經無乙醇沉淀、乙醇-水混合物洗滌后在50°C真空干燥得黃色粉狀產物，即為羧甲基殼聚糖；其中殼聚糖氫氧化鈉水溶液異丙醇的質量比為1:4:8;將羧甲基殼聚糖溶于0. 02mol/L 0. lmol/L、pH = 5 8的磷酸鹽緩沖液或2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中制成質量百分比濃度為2% 5%的羧甲基殼聚糖溶液；2)交聯劑活化將交聯劑二硫代二元酸溶于無水有機溶劑中制成質量濃度為5% 15%的交聯劑溶液，再向其中依次加入碳二亞胺型活化劑N，N’ - 二環己基碳二亞胺或 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫反應30 60分鐘，得到活化的交聯劑二硫代二元酸酯；其二硫代二元酸N，N’ - 二環己基碳二亞胺或1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基硫代琥珀酰亞胺的功能基團摩爾比為 1 1. 5 1. 5 ；3)化學交聯在室溫攪拌條件下，將活化的交聯劑二硫代二元酸酯在20分鐘內滴加入羧甲基殼聚糖溶液中攪拌均勻后轉移至M孔培養板中，室溫反應M 36小時形成水凝膠，然后將其在蒸餾水中浸泡M小時，每4小時置換一次蒸餾水；其中活化的交聯劑中的羧基與羧甲基殼聚糖中氨基間的摩爾比為2% 10% ；4)冷凍干燥將步驟幻中得到的水凝膠在零下40°C冷凍干燥3天，得到殼聚糖基水凝膠即三維細胞培養載體。
5.根據權利要求要求4所述的可快速解離型三維細胞培養載體的制備方法，其特征在于所述的步驟1)乙醇-水混合物中乙醇水的體積比為4:1。
6.根據權利要求要求4所述的可快速解離型三維細胞培養載體的制備方法，其特征在于所述的殼聚糖為脫乙酰度為 95%、分子量為10 50萬。
7.根據權利要求要求4所述的可快速解離型三維細胞培養載體的制備方法，其特征在于所述的交聯劑二硫代二元酸為2，2’ - 二硫代二乙酸、3，3’ - 二硫代二丙酸或4，4’ - 二硫代二丁酸。
8.根據權利要求要求4所述的可快速解離型三維細胞培養載體的制備方法，其特征在于所述的無水有機溶劑為甲醇、乙醇、二甲基亞砜或二甲基甲酰胺。
全文摘要
一種可快速解離型三維細胞培養載體及制備方法。是以羧甲基改性的殼聚糖為原料，將其溶解于pH＝5～8的磷酸鹽或2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中，然后加入碳二亞胺活化的二硫代二元酸交聯劑，通過羧甲基殼聚糖中氨基與交聯劑中羧基間的酰胺化反應形成三維化學交聯的水凝膠，最后通過冷凍干燥得到三維多孔載體。該載體材料中的二硫鍵可被其還原劑迅速還原斷裂，實現多孔載體快速解離而溶解，能滿足多種體外三維細胞培養和培養結束后需要細胞-載體材料有效分離的特殊需求。本發明的殼聚糖基水凝膠三維細胞培養載體具有原料易得、工藝簡單、易生物活性改性，以及載體理化性質、力學性能和降解速率可控等優點，在各種三維細胞培養中具有良好的應用前景。
文檔編號C12M3/00GK102517211SQ20111040695
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者徐明輝, 金欣霞, 錢軍民, 鎖愛莉 申請人:西安交通大學