專利名稱：脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及一種來源于花生的脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
鐵在植物生長發育過程中具有不可替代的作用，是植物生長發育所必需的微量元素之一。盡管鐵在土壤中的含量較高，在有氧及堿性土壤中鐵的溶解性卻很低，在石灰性土壤上很多植物面臨著缺鐵脅迫。促進植物對鐵的吸收轉運效率從而提高作物的耐低鐵脅迫能力具有重要的實踐意義。在低鐵環境下植物在長期進化過程中形成了機理I和機理II兩種不同的適應性反應機制。雙子葉和非禾本科單子葉植物屬于機理I植物。此類植物在缺鐵時主要的生理反應表現為根系伸長受阻，根尖部分直徑增加，并產生根毛，根部形態發生變化，Fe3+還原酶的活性增加，受ATP酶控制的質子分泌增加，使根際pH降低，提高鐵的有效性。而單子葉禾本科植物為機理II植物，它們在缺鐵時無機理I植物的明顯的根形態上的變化，而是根系中植物鐵載體的合成和分泌量增加。在分子生物學水平，植物吸收利用鐵的關鍵基因在模式植物中逐漸研究清楚。機理I植物以模式植物擬南芥研究得相對清楚，缺鐵時通過根表皮細胞質膜上鐵還原酶基因AtFR02將三價鐵還原成二價鐵，然后通過根細胞質膜上的二價鐵轉運蛋白AtIRTl將二價鐵轉運到根細胞內供植物吸收利用。機理II植物以水稻，大麥及玉米研究得相對清楚。在缺鐵條件下主要通過體內合成并分泌脫氧麥根酸類植物鐵載體(MAs)，禾本科植物根系分泌的脫氧麥根酸將根際中難溶性鐵螯合，再通過細胞質膜上的YSl轉運蛋白將脫氧麥根酸鐵螯合物轉運到根細胞內。YSl轉運蛋白首次在玉米中分離得到，因該基因缺失后玉米葉片表現為黃色條紋(yellow stripe)表型命名而來。研究者們通過酵母功能互補試驗確定了 ZmYSl基因對脫氧麥根酸鐵三價螯合物(MAs-Fe(III))的轉運能力。此外研究發現在大麥中HvYSl及水稻中0sYSL15也參與從根際土壤中吸收轉運MAs-Fe (III)供植物吸收利用。最近的研究表明，大麥中的HvYSL2及水稻0sYSL18對MAs-Fe(III)也具有轉運作用。機理I植物中也存在YSL同源基因。NA(尼克煙酰胺)為脫氧麥根酸類植物鐵載體合成的前體，通常與二價金屬離子結合形成穩定的復合物在植物體內轉運。目前已有的研究表明機理I植物YSL基因主要負責NA與金屬離子螯合物的轉運。在模式植物擬南芥中存在8個YSL基因。AtYSLl對于Fe-NA向籽粒中的運輸起到了很重要的作用。AtYSL2對Fe (II)-NA、Fe (II)-PS及Cu (II)-NA具有轉運作用。此外，Gendre等人對于超累積植物天藍遏藍菜中存在的YSL同源基因進行了一些研究。他們在天藍遏藍菜中找到了三個YSL同源基因，根據分別與擬南芥中YSL基因的同源性高低而命名為TcYSL3、TcYSL5、TcYSL7。研究表明TcYSL7主要在植物的花中表達，TcYSL5主要在葉片中表達，而TcYSL3在各器官中表達量都比較均一。進一步通過酵母功能互補實驗發現，其中只有TcYSL3對于Fe(II)-NA以及Ni (II)-NA復合物具有運輸作用。盡管機理I植物自身不合成脫氧麥根酸，令人驚奇的是最近的研究表明擬南芥AtYSL3對MAs-Fe (III)及Fe (II)-NA具有轉運作用。YSL基因家族無論在機理I植物及機理II植物中都具有重要的意義，該基因家族對于鐵在土壤中的吸收運輸及鐵向地上部和籽粒中的運輸都起到至關重要的作用。花生是我國重要的油料作物之一，但是在我國北方石灰性土壤上花生缺鐵黃化成為限制其產量和品質的重要因子。同時花生又是迄今為止非測序植物之一，這將極大地限制從分子水平對花生鐵營養的研究。運用分子生物學及基因工程手段，對花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白AhYSLl基因的獲得與功能研究將為揭示花生吸收利用鐵的分子機制起到極大的推動作用。盡管花生不合成脫氧麥根酸，這將為在特定環境下理解花生利用脫氧麥根酸鐵提供重要的依據。同時運用該基因也將為從分子育種或基因工程培育耐低鐵脅迫花生或其它植物品種提供重要的理論基礎，具有深遠的實踐意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白及其編碼基因。本發明所提供的脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白，名稱為AhYSLl，來源于豆科、落花生屬、花生(A.hypogaea)品種魯花14,是如下I)或2)的蛋白質:I)由序列表中序列2所示的·氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運活性的由I)衍生的蛋白質。序列表中的序列2由679個氨基酸殘基組成，編碼上述AhYSLl蛋白的基因也屬于本發明的保護范圍。編碼所述脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白的基因為如下1)-4)中任一種:I)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)編碼序列是序列表中序列I的第319-2358位的DNA分子；3)在嚴格條件下與上述I)或2)所限定的DNA分子雜交的DNA分子,且該DNA分子編碼AhYSLl ；4)與I)或2)或3)限定的基因序列具有90%以上同源性的DNA分子，且該DNA分子編碼AhYSLl ；所述4)中的基因，與I)或2)或3)限定的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列I由2660個核苷酸組成，包括5'端非編碼區，一個完整的開放閱讀框(ORF)和包含ployA尾巴的3'端非編碼區，自5'端第319-2358堿基為該基因的編碼區，編碼了序列表中序列2所示的脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白。含有上述編碼AhYSLl蛋白的基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。所述重組表達載體為在pDR195的多克隆位點間插入所述脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白編碼基因得到的重組表達載體；在本發明的實施例中，所述多克隆位點具體為Not I 和 BamH I。所述表達盒由能夠啟動所述編碼脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白的基因表達的啟動子，所述編碼脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白的基因，以及轉錄終止序列組成。所述重組菌為攜帶有所述編碼脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白的基因的酵母。
所述AhYSLl蛋白，或所述編碼脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白的基因，或所述重組表達載體，或所述表達盒在下述a)或b)中的應用也屬于本發明的保護范圍:a)提高生物對脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運；b)培育耐低鐵脅迫生物；所述低鐵中的鐵為脫氧麥根酸三價鐵螯合物。在本發明的實施例中，所述生物具體為酵母。培育具有高脫氧麥根酸三價鐵螯合物性能的生物的方法也屬于本發明的保護范圍。所述培育具有高脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運性能的生物的方法包括如下步驟:將所述重組表達載體轉化目的生物，得到脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運性能高于所述目的生物的重組生物。在本發明的實施例中，所述生物具體為酵母；所述重組表達載體具體為在PDR195的多克隆位點Not I和BamH I之間插入AhYSLl基因得到的重組表達載體。另夕卜，擴增所述AhYSLl基因的全長或任一片段的引物也屬于本發明的保護范圍，如核苷酸序列如下的引物對:5’ -CAAGAAGGCAAAGTTGATGGTT-3’和5’ -AATTCCTATGGCACTAGAAAGC-3’。實驗證明本發明所提供的AhYSLl蛋白能夠使fet3和fet4基因缺失的酵母突變體菌株DEY1435恢復對脫氧麥根酸三價鐵螯合物的轉運功能，這證實了 AhYSLl蛋白具有脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運的功能，進而為培育耐低鐵脅迫植物品種提供了重要的理論基礎。
圖1為AhYSLl基因在轉錄水平表達受鐵供應水平的影響。其中，橫坐標中的字母R代表根系，NL代表新葉，O L代表老葉；數字(4、7或11)代表處理天數。縱坐標的數值為AhYSLl基因拷貝數與內參基因Ahubiquitin拷貝數的比值。圖2為AhYSLl基因酵母功能互補試驗結果。其中，A為DEY1453在Fe (II)-NA的SD平板上的生長情況；B為DEY1453在Fe(III)-NA的SD平板上的生長情況；C為DEY1453在Fe(III)-DMA的SD平板上的生長情況；D為DEY1453在FeCl3的SD平板上的生長情況。A、B、C、D 中第一排均為 DEY1453/pDR195，第二排均為 DEY1453/pDR195_AhYSLl ;且從左到右四列 DEY1453 的 0D600 值均分別為 1，ΚΓ1，1(Γ2，1(Γ3。圖3為AhYSLl基因花生根系原位雜交定位結果。其中，A代表反義探針；B代表正義探針。
具體實施例下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。水培營養液配方如下:終濃度為0.5mM的KH2PO4、終濃度為0.75mM的K2SO4、終濃度為0.1mM的KCl、終濃度為0.65mM的MgSO4.7H20、終濃度為2mM的CaSO4.2H20、終濃度為
Iμ M的H3BO3、終濃度為I μ M的MnSO4.4Η20、終濃度為I μ M的ZnSO4.7Η20、終濃度為0.1 μ M的 CuSO4.5Η20、終濃度為 0.005 μ M 的(NH4)6Mo7O24.4Η20、終濃度為 80 μ M 的 EDTA-Fe, pH為5.8 6。缺鐵處理營養液配方為上述水培營養液配方不加EDTA-Fe，其余組分與上述水培
營養液完全一致。實施例1、花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白及其編碼基因的獲得一、水培花生的培養將花生品種“魯花14”的種子用10%雙氧水消毒20-30分鐘后，清洗置于飽和硫酸鈣溶液中通氣8小時，然后置于鋪有吸水紙的托盤中，并蓋好避光，于人工培養室中培養。培養室設置條件為光照14小時30°C，黑暗10小時25°C。1_2天左右花生發芽后移入石英砂中培養，待長出1-2片葉子后轉入水培營養液中培養。正常培養一周后轉入缺鐵處理營養液中，缺鐵處理一周后觀察花生新葉表現脈間失綠的缺鐵癥狀，取花生根系及葉片，迅速放入液氮中，并于_80°C冰箱保存備用。二、花生總RNA的提取將上述步驟一制備的兩種花生樣品(根系和葉片)分別放入已經用液氮預冷的研缽中，迅速加入液氮研磨植物樣品直至成粉末狀，各取出約0.1克粉末樣品于1.5μ I無RNase離心管中，加入Iml的RNA提取液Trizol (Invitrogen),立即潤旋震蕩15秒,使核蛋白充分解離，室溫靜置5分鐘，加入200 μ I氯仿，充分混勻，靜置5分鐘，放入事先已經預冷到4°C的離心機中，以12000 Xg的速度離心15分鐘，取上清液入新的1.5ml的離心管中，力口Λ 500 μ I異丙醇，上下顛倒充分混勻，室溫放置10分鐘，然后4°C 12000 Xg離心10分鐘，取出后倒掉上清液，加入Iml的75%乙醇，4°C 7500 X g離心5分鐘，重復洗滌兩次，取出后倒掉乙醇，并吸出所有上清液后置于超凈臺中室溫下風干。加入適量的DEPC水和RNA酶抑制劑，得到兩種樣品的RNA，均放于-20°C或_80°C冰箱中貯存備用。三、AhYSLl基因全長序列的獲得從NCBI 數據庫中(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)搜索花生的 EST 序列并保存，用數據庫中已知的大麥HvYSl及玉米ZmYSl序列在BioEdit軟件中對保存的花生EST序列文本文件進行Local Blast，這樣就獲得了花生中YSL基因家族EST片段序列。利用該序列設計擴增3端上游引物及通用dT17-adap引物作為下游引物(invitrogen公司)，引物分別為:AhYSLl-3’GSP:5’-CAAGAAGGCAAAGTTGATGGTT-3’(序列表中序列 I 的第 2223-2244位)dT17-adap:5’ -GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’取已提好的花生根系RNA樣品約2 μ g,用ReverTraAce反轉錄酶(Τ0Υ0Β0公司)進行反轉錄cDNA的合成。反轉錄體系為:RNA 2 μ g，5X反應緩沖液4 μ 1，dNTPs (IOmM) 2 μ 1，Oligo (dT) 12_18 (10 μ Μ) 0.5 μ I，ReverTraAce 反轉錄酶 I μ I，用水補足到 20 μ I 體系，42°C反應I小時，99°C 5min終止反應。然后將以上反應液稀釋5倍備用。PCR 反應體系為:10 X 反應緩沖液 2 μ 1，dNTPs (2mM) 2 μ I, MgS04 (25mM) 0.8 μ I,正向引物 AhYSLl-3，GSP (0.0lmM) 0.6 μ 1，反向引物 dT17-adap (0.0lmM) 0.6 μ 1，ddH2013.7 μ 1，反轉錄后cDNA稀釋產物2μ l，K0D-plus DNA聚合酶(Τ0Υ0Β0公司)0.4μ 1，用滅菌水補足到20 μ I體系。 PCR反應程序為:96°C預變性2min ;98°C變性10s，55°C退火30s，68°C延伸lmin，35個循環；72°C延伸lOmin。PCR反應后瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，然后將回收得到的DNA連接到pCR -Blunt I1- TOPO 載體(Invitrogen公司)。具體連接體系為:切膠回收PCR產物2 μ 1，鹽溶液0.5 μ l，pCR -Blunt I1-TOPO 載體0.5 μ 1，混勻后常溫放置5-30min。冰上放置后轉化到大腸桿菌。涂于含Kan (卡那霉素)的LB平板后37°C過夜培養，挑單克隆于LB液體培養基中37°C過夜搖菌，收集菌體提取質粒后進行測序，得到花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白基因的3’端序列。根據上述獲得的花生中YSL基因家族EST片段序列設計如下引物，利用
51RACESystem for Rapid Amplification of cDNA Ends 試劑盒(Invitrogen 公司)擴增花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白基因的5’端序列:AhYSLl-5’ GSPl:5’ -TTAGGGTCTCCCACATT-3’ (序列 I 的第 1927-1943 位)AhYSLl-5，GSP2:5，-CACATGAACATTGCTCTGGGAGAGGTT-3’ (序列 I 的第 1830-1856位)AhYSLl-5，GSP3:5，-GATACCCTTGCTGCTCAGCTGCTAC-3，(序列 I 的第 1429-1453位) AhYSLl-5’ GSP1-2:5’ -GACTGTGAAAACAAGGTATC-3’ (序列 I 的第 1523-1542 位)AhYSLl-5，GSP3-2:5，-GCCATATAAGCCCTTCATGTTGGTTTC-3，(序列 I 的第 1270-1296位)參照5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 試劑盒說明書，以上述獲得的cDNA為模板，經過兩輪PCR擴增，得到花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白基因的5’端序列。經測序拼接獲得花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白基因的核苷酸序列(如序列表中序列I所示，將其命名為AhYSLl基因)。進一步，根據此序列設計PCR擴增花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白編碼序列(⑶S)的引物如下=Adap-AhYSLl-F:5，-TCAAAAGAAAGAAAAAAAATATACCCCAGCCTCGAATGATGTTTTCCCCATCAAGT-3 ’(劃線部分為序列I的第319-339位)Adap-AhYSLl-R:5，-ACTTGACCAAACCTCTGGCGAAGAAGTCCAAAGCTCTAGGAAGGGACAAATTTCAT-3，(劃線部分為序列I的第2388-2359位)以上述步驟中反轉錄獲得的“魯花14”花生根系的cDNA為模板，以Adap-AhYSLl-F和Adap-AhYSLl-R為引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行測序，得到含有花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白的編碼序列(如序列表中序列I的第319-2358位所示)的片段。利用DNAman軟件翻譯AhYSLl基因序列得到其編碼的氨基酸序列，如序列表中序列2所示。應用 TMHMM 跨膜區域分析軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對 AhYSLl 轉運蛋白序列進行分析表明該AhYS LI蛋白具有14個跨膜區域。實施例2、花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白AhYSLl基因表達對鐵的響應一、水培花生處理水培培養花生(“魯花” 14)，具體方法同實施例1步驟一。在正常條件下培養約一周后轉入缺鐵的營養液中培養(實驗組)，同時設置正常供鐵對照組。處理4、7、11天后分別取實驗組和對照組花生的根系、新葉及老葉樣品，然后提取花生根系及葉片RNAjiJ用DNaseI (Takara公司)消化去除可能污染的基因組DNA，然后進行反轉錄，通過相對定量Real-time PCR方法，利用Ahubiquitin基因作為內參基因，分析AhYSLl基因在加鐵和缺鐵處理條件下轉錄水平表達量。二、相對定量 Real time PCR以步驟I提取的RNA為模板，使用如下引物進行反轉錄PCR(具體操作同實施例1)，得到AhYSLl基因片段(序列I的第2223-2421位):QAhYSLl-F(同 AhYSLl-3， GSP):5， -CAAGAAGGCAAAGTTGATGGTT-3’QAhYSLl-R:5’ -AATTCCTATGGCACTAGAAAGC-3’ (序列 I 的第 2400-2421 位)以步驟I提取的RNA為模板，使用參照文獻Luo et al.，2004中的Ubiquitin-F:AAGCCGAAGAAGATCAAGCAC, Ubiquitin-R:GGTTAGCCATGAAGGTTCCAG 引物進行反轉錄 PCR (具體操作同實施例1)，得到Ahubiquitin內參基因片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測上述獲得的AhYSLl基因片段，得到大小約為199bp的單一目的條帶，檢測上述獲得的Ahubiquitin內參基因片段，得到大小約為145bp的單一目的條帶。
利用Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit (Invitrogen 公司)，對上述經瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的AhYSLl基因片段和Ahubiquitin內參基因片段，分別從各自剩下的PCR產物中取I μ I,加0.5μ I的鹽溶液，I μ I滅菌水,及0.5μ L的pCR -Blunt I1-TOPO 載體(Invitrogen公司)，室溫連接約30分鐘，然后將3 μ I連接反應液加到TopolO感受態細胞中(Invitrogen公司)按照如下步驟進行轉化:冰上放置30分鐘左右，然后42度水浴放置約45秒，迅速放到冰上，3分鐘后加200 μ I LB液體培養基，置于37度搖床搖I小時，然后把該菌液涂到含有卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上，37度培養箱過夜培養。約13-15小時后，可見單一的小菌落，挑單菌落于2ml的LB液體培養基中，在37度搖床搖12小時左右，提取質粒，進一步測序鑒定分析，保證所有堿基序列無誤后選擇該質粒待用。將上述測序表明含有AhYSLl基因片段的重組質粒，及含有Ahubiquitin內參基因片段的重組質粒均稀釋成不同的濃度梯度，使分別為IO3拷貝數/ μ 1，IO4拷貝數/ μ 1，IO5拷貝數/μ 1，IO6拷貝數/ μ 1，IO7拷貝數/ μ 1，對于每種質粒，上述不同濃度各取I μ I作為模板，制作本實施例Real time PCR的標準曲線。每次Real time PCR時都要分別以上述稀釋好的質粒為模板作標準曲線，以便根據標準曲線計算該基因在樣品中的拷貝數。用花生的根系及葉片樣品RNA反轉錄后的cDNA稀釋5倍加2 μ I為模板，反應體系為TaKaRa SYBR Green premix (Takara公司)6.25 μ 1，ROX Reference Dye 0.25 μ 1，正向反向引物各0.2 μ mol，然后以滅菌水補足到12.5 μ I體系，應用 Applied Biosystems StepOne PlusTM Real Time PCR System進行 PCR反應。PCR反應程序為:95°C預變性2min30s ;95°C變性15s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s，同時收集熒光；40個循環；溶解曲線95°C 15s,60°C lmin，95°C 15s。PCR后儀器將自動通過用質粒作為模板所做的標準曲線得出在不同模板條件下AhYSLl基因及Ahubiquitin內參基因的拷貝數。最后通過計算用AhYSLl基因拷貝數/內參基因Ahubiquitin的拷貝數得到AhYSLl基因在不同處理下的相對表達值。結果如圖1所示。這一結果表明該花生AhYSLl基因在根系中缺鐵處理11天時表達明顯高于正常供鐵水平。在新葉中缺鐵處理11天時在缺鐵處理條件下表達增強的反應更明顯。而在老葉中在缺鐵處理7天時表達就顯著高于正常供鐵，但在處理11天，加鐵與正常供鐵表達量沒有差異。實施例3、酵母功能互補試驗驗證AhYSLl蛋白在酵母中對脫氧麥根酸三價鐵螯合物的轉運功能酵母轉化主要試劑如下:10XTE:0.1M Tris, IOmM EDTA 調節 PH 至 7.5，121 度高壓滅菌 20min。IOXLiAc:g卩IM醋酸鋰，稱取10.2g醋酸鋰加適量高純水溶解，用冰醋酸調節PH值到7.5，定容至Ij 100ml, 121度高壓滅菌20min。50% PEG (聚乙二醇):50g PEG加水定容到100ml，120度高壓滅菌20min。Yro培養基:20g蛋白胨、IOg酵母提取物、20g葡萄糖，加水定容到1L，調節PH為4.7。SD 平板(IL):(NH4)2S04 5g、MgS04 5 00mg、NaCl 500mg、CaCl2 500mg、KH2P048 50mg、K2HPO41 50mg>H3BO3 500 μ g>CuSO4 40 μ g>KI 100 μ g>FeCl3 200 μ g、MnS04400 μ g、Na6Mo7O24200 μ g、ZnS04 400 μ g、生物素20 μ g、泛酸2mg、葉酸2ug、肌醇10mg、煙酸400 μ g、對氨基苯酸200 μ g、維生素B6 400 μ g、核黃素200 μ g、維生素BI 400 μ g、色氨酸20mg、亮氨酸lOOmg、組氨酸20mg、葡萄糖20g、瓊脂粉20g，加水定容至1L，121度高壓滅菌后倒約30個平板。缺鐵的SD平板(IL):與上述SD平板(IL)相比，缺少"FeCl3 200 μ g”，其余組分
完全一致。一、pDR195-AhYSLl轉化酵母突變株DEY1453及鑒定在AhYSLl基因序列編碼區(序列I的第319-2358位)兩端設計引物，包括起始密碼子與終止密碼子,并在正反向引物5’端分別加上載體pDR195 (Haruhiko Inoue, TakanoriKobayashi，Tomoko Nozoye, Michiko Takahashi，Yusuke Kakei，Kazumasa Suzuki, MikioNakazono，Hiromi Nakanishi，Satoshi Mori,and Naoko K.Nishizawa.Rice OsYSL 15 isan iron-regulated iron (III)-deoxymugineic acid transporter expressed in theroots and is essential for iron uptake in early growth of the seedlings.TheJournal of Biological Chemistry.2009.284，3470—3479.)用 Not I 和 BamH I 酶切后線性載體兩端約35bp序列，最后所用引物如下:Adap-AhYSLl-F:5，-TCAAAAGAAAGAAAAAAAATATACCCCAGCCTCGAATGATGTTTTCCCCATCAAGT-3，(劃線部分為序列I的第319-339位)Adap-AhYSLl-R:5，-ACTTGACCAAACCTCTGGCGAAGAAGTCCAAAGCTCTAGGAAGGGACAAATTTCAT-3，(劃線部分為序列I的第2388-2359位)用KOD-plus DNA聚合酶PCR擴增含線性載體兩端序列的AhYSLl基因全長，PCR反應體系為 10XK0D-plus 緩沖液 2μ l，2mM dNTPs 2 μ l,25mM MgSO4 0.8μ1，正向反向引物分別 10 μ M 0.6μ 1，“魯花”14 花生根系 cDNA 0.5μ I, KOD-plus DNA 聚合酶 0.4 μ 1，加滅菌水至 20 μ I 體系。PCR 反應程序為:94°C 2min，94°C 15s，60°C 30s，68°C 2min，30 個循環，72°C IOmin0 PCR反應后電泳檢測鑒定條帶大小(約2110bp)正確后備用，測序結果表明該PCR產物具有序列I的第319-2358位核苷酸。
將pDR195載體用Not I和BamH I進行酶切，雙酶切體系為:pDR195載體質粒5 μ I, Buffer M I μ I, Not I和BamH I酶各0.5 μ 1，滅菌水補足到10 μ I體系。37°C酶切5小時后獲得線性的PDR195載體。將6μ1酶切后的線性pDR195載體質粒與3μ1 PCR擴增后獲得的含線性載體pDR195兩端序列的AhYSLl基因全長的PCR產物同時轉化到酵母突變體菌株DEY1453(Haruhiko Inoue, Takanori Kobayashi, Tomoko Nozoye, Michiko Takahashi,Yusuke Kakei,Kazumasa Suzuki,Mikio Nakazono, Hiromi Nakanishi,Satoshi Mori,andNaoko K.Nishizawa.Rice OsYSL 15 is an iron-regulated iron(III)-deoxymugineicacid transporter expressed in the roots and is essential for iron uptake inearly growth of the seedlings.The Journal of Biological Chemistry.2009.284,3470-3479.)(缺失高親和力鐵轉運基因fet3和低親和力鐵轉運基因fet4)。具體操作如下:將少量酵母突變體DEY1453菌株接種到4ml YPD培養基中，30°C搖16-18小時。向50ml新的YPD培養基中加入適量的上述菌液，調節0D600值為0.2-0.3，30°C搖3_4小時使0D600約為0.4-0.6，收集菌液，IOOOg 25°C離心5min,去上清，向沉淀中加8ml TE，混勻后IOOOg 25°C離心5min，去上清后，在沉淀的菌中加入1200 μ I滅菌水、150 μ I IOXTE及150 μ I 10 X LiAc，震蕩數秒使菌株懸浮起來，得到酵母突變株菌懸浮液。取2個1.5ml離心管分別加入pDR195載體10 μ I (對照組)，6 μ I酶切后的線性pDR195載體質粒與3 μ I PCR擴增后獲得的含線性載體兩端的AhYSLl基因全長的PCR產物的混合物(實驗組)。再分別加入80 μ I滅菌水和10 μ I已經過煮沸處理的鮭魚精DNA，然后加入上述已處理好的酵母突變株菌懸浮液100 μ 1，震蕩混勻，加480 μ I的50%PEG,60 μ I IOXTE及60 μ I 10 X LiAc后30度搖30min，再加70ul 二甲基亞砜溫和混勻，42度水浴15min，冰上放置90s，短暫離心后去上清，加200 μ I滅菌雙蒸水并輕輕混勻。取100 μ I涂于含鐵的SD平板上。約2-3天左右長出菌落。挑單菌落，放入10 μ I滅菌水中，取2 μ I作為PCR模板， 以Adap-AhYSL 1-F，Adap-AhYSLl-R為正反向引物進行PCR反應，電泳鑒定AhYSLl是否轉化到酵母中。將經鑒定表明含有AhYSLl基因的重組酵母(PCR鑒定得到21 IObp條帶)命名為DEY1453/pDR195-AhYSLl ;轉入pDR195空載體的重組酵母命名為 DEY1453/pDR195。二、酵母功能互補試驗1、含 Fe (II)-NA，Fe(III)-NA, Fe(III)-DMA 的 SD 平板配制首先，分別配制Iml濃度為IOmM的FeSO4溶液、Iml濃度為IOmM的FeCl3溶液，Iml濃度為30mM的煙酰胺(NA)溶液，以及Iml濃度為30mM的脫氧麥根酸(DMA)溶液。其次，從上述配制好的溶液中，取30 μ I濃度為IOmM的FeSO4溶液和15 μ I濃度為30mM的煙酰胺溶液混合，配成Fe (II) -NA溶液；取30 μ I濃度為IOmM的FeCl3溶液和15 μ I濃度為30mM的煙酰胺溶液混合，配成Fe (III) -NA溶液；取30 μ I濃度為IOmM的FeCl3溶液和15 μ I濃度為30mM的脫氧麥根酸溶液混合，配成Fe (III) -DMA溶液；上述三種配制好的溶液均在常溫放置4小時左右后，用0.2μπι過濾離心管13500rpm離心10分鐘，取上清待用。再次,配制缺鐵的SD平板液45ml,并將pH調至7.0后,平均分成三份,每份15ml,高壓滅菌后，待溶液溫度降至60度左右分別加入經上述步驟離心后的Fe(II)-NA溶液，Fe (III)-NA溶液及Fe (III)-DMA溶液(三種溶液各自45 μ I)，倒板冷卻。2、酵母功能互補試驗具體操作如下:挑單菌落到YPD培養基中，30度過夜搖菌。向20ml新的YPD培養基中加入適量上述菌液，調節0D600值為0.2，接著搖4小時左右，取Iml菌液離心30s，去上清，加Iml 10 X TE渦旋混勻，離心30s，去上清，重復2遍后加Iml滅菌水重復洗2遍，最后加300 μ I滅菌水渦旋混勻，測定0D600值，用滅菌水將0D600值稀釋調節為1，然后依次稀釋10倍，得到0D600值分別為1，ΙΟ—1，10_2，10_3濃度梯度的菌液，然后分別將該菌液依次點5μ I于配制好的Fe (II)-NA，Fe (III)-NA及Fe (III)-DMA的SD平板，放置30°C培養室培養3-4天左右，比較酵母的生長狀況。同時，設置含FeCl3的SD平板作為Fe的對照。結果如圖2所示，轉入AhYSLl基因的酵母(DEY1453/pDR195_AhYSLl)在提供Fe (II)-NA及Fe (III)-NA鐵的平板上都沒有正常生長，與轉入pDR195空載體的酵母(DEY1453/pDR195)生長情況一致；而在提供Fe(III)-DMA的SD平板上轉入AhYSLl基因的酵母(DEY1453/pDR195-AhYSLl)明顯比轉入pDR195空載體的酵母(DEY1453/pDR195)長勢好；在FeCl3 (非螯合態的三價鐵)對照平板上，DEY1453/pDR195-AhYSLl酵母與DEY1453/PDR195酵母生長一致。這一結果說明該AhYSLl轉運蛋白對Fe (II)-NA及Fe (III)-NA都不具有轉運能力，僅對脫氧麥根酸三價鐵具有轉運作用。實施例4、花生脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白AhYSLl基因根系原位雜交組織定位一、原位雜交探針制備首先用KOD-plus DNA聚合酶PCR擴增得到制備探針的模板DNA。所用引物如下:AhYSLlprobe-F:5’ -TGCCATTCTTGCTCTTGCAA-3’
AhYSLlprobe-R:5’ -TGGGTGCAAGAATACAGGC-3’PCR后得到 261bp 的DNA片段。用 Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit (Invitrogen公司)將該片段克隆到pCR -Blunt I1-TOPO 載體(Invitrogen公司)，然后進行測序，確定序列正確及插入片段的方向，選取方向不同的插入片段分別制備正義和反義探針。將得到的插入不同方向片段的載體質粒約3μ g分別用BamH I酶切后，用等體積的苯酚:氯仿:異戍醇(25: 24:1)進行抽提，13500rpm離心IOmin,取上清加等體積的氯仿:異戊醇(24: I)混勻后13500rpm離心IOmin,取上清加20 μ I濃度為3Μ的醋酸鈉和500 μ I冷的無水乙醇，_20°C放置Ih后，13500rpm離心15min，倒掉上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，離心5min后室溫晾干,加13.5 μ I的DEPC水溶解。在純化后的13.5 μ I線性載體質粒中加入DIG RNA Labeling Mix (Roche公司)2 μ I，T7 RNA聚合酶I μ I (Τ0Υ0Β0公司)，反轉錄緩沖液2 μ I，用DEPC水補足到20 μ I體系，37°C 放置2h。再加 2μ I DNaseI (Takara 公司)，37°C 放置 15min，然后加0.8μ I 0.5ΜEDTA (ρΗ8.0)終止反應。最后加2 μ I濃度為5Μ的LiCl和75 μ I冷的無水乙醇，_20°C放置2h，沉淀純化探針，13500rpm離心15min，70%乙醇洗滌后，用24 μ I的DEPC水溶解正反義探針，均按4μ I每管分裝，_80°C保存備用。_■、花生根系樣品石臘切片制備花生水培正常培養一周后，轉入缺鐵營養液中，缺鐵處理一周后取花生根系樣品，并用刀片將根系樣品切為0.5-lcm的小段，放入冰上冷卻的FAA固定液(50%乙醇90ml，冰醋酸5ml，甲醛5ml)中固定，將置于冰上的含樣品的FAA固定液抽真空lOmin，放氣后重復抽真空2次(每次IOmin)，然后4度過夜固定。將固定后的樣品用DEPC水洗兩遍，然后依次換溶液50%乙醇Ih ;50%乙醇+10%叔丁醇1.5h ;50%乙醇+20%叔丁醇2h ;50%乙醇+35%叔丁醇2h ;50%乙醇+50%叔丁醇2h ;25%乙醇+75%叔丁醇2h ;25%乙醇+75%叔丁醇(含0.1%伊紅Y)過夜；100%叔丁醇2h; 100%叔丁醇2h ;67%叔丁醇+33%石蠟油3h-5h ;倒出1/3叔丁醇石蠟油混合液，補充同體積60°C融化的石蠟于上層，60°C，6-12h ;倒出1/2體積叔丁醇石蠟油混合液，補充同體積60°C融化的石蠟，60°C，6-12h，并重復2遍；倒出全部液體，加入純的融化石蠟，60°C，8h，重復2遍；最后將含有樣品的石蠟在65°C燙板上迅速倒入平整光滑的四方小紙盒中，并使根系樣品擺放均勻。慢慢冷卻到常溫使石蠟凝固。切取含有根系樣品的蠟塊，使一個蠟塊中含有一段根系，切成四方均勻的小塊，然后用切片機將小蠟塊切成10 μ m連續的蠟帶，再將蠟帶平展到滴有DEPC水放置于45°C燙板上的玻片上，待蠟帶平展開后，將玻片傾斜，倒掉玻片上的水，并用濾紙尖將蠟帶下的小水珠小心吸出，然后將玻片放置于45°C燙板上36-48小時，4°C或_20°C保存備用。三、原位雜交IOX 雜交 buffer:100 μ I 濃度為 IM 的 Tris-HCl ρΗ7.5，20 μ I 濃度為 0.5Μ 的EDTA,600y I濃度為5Μ的NaCl，補充至1ml。20 X SSC 組成:17.53g NaCl，8.82g 檸檬酸鈉，pH 調至 7.0，配成 IOOml。NTE:50ml 濃度為 5M 的 NaCl，5ml 濃度為 IM 的 Tris-HCl ρΗ7.5，Iml 濃度為 0.5Μ的EDTA，用水補足到500ml。將準備好的花生根系石蠟切片玻片依次放入二甲苯10min，2遍；100%乙醇2min，
2遍；95% 乙醇 Imin ；85% 乙醇 Imin ；70% 乙醇 Imin ；50% 乙醇 Imin ；30% 乙醇 Imin ；DEPC水 Imin, 2 遍；蛋白酶 K (0.5μ g/ml) 37 °C，20min ；DEPC 水 lmin, 2 遍；4 % 多聚甲醒,2min ；PBS (NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.15g, KH2PO4 0.2g 配成 1L, PH7.4)2min，2 遍；0.1M 三乙醇胺(PH8.0)，加上250 μ I乙酸酐攪拌后迅速放入玻片，IOmin ;PBS，5min，2遍；DEPC水 5min, 2 遍；30 % 乙醇 Imin ；50 % 乙醇 Imin ；70 % 乙醇 Imin ；85 % 乙醇 Imin ；95 % 乙醇Imin ;100%乙醇2min,2遍；抽真空,30_60min ;雜交(每張玻片雜交液組成:去離子甲酰胺 100 μ 1，50XDehardts 4 μ 1，IOX 雜交 buffer 20 μ 1,10mg/ml SSDNA 10 μ 1，50%硫酸葡聚糖 40μ 1，用 DEPC 水補足至Ij 200 μ l)，50°C，16h ；0.1 X SSC50°C, 30min ；0.1XSSC50°C,lh30min ；NTE 37°C，5min，2 遍；20 μ g/ml RNaseA 于 NTE 中，37°C，30min ;NTE 37°C,5min,
3遍；0.I X SSC 50 °C, Ih ；PBS 常溫，5min ;1 % 封閉液(blocking reagent) (Roche 公司)Ih ;抗地高辛抗體(Roche公司)I μ I加到500 μ I濃度為I %的blocking reagent中稀釋，然后滴加到玻片上，放置2h;PBS10min，3遍；緩沖液(0.1M Tris-HCl pH7.5,0.15MNaCl) 10min，3 遍；加顯色緩沖液(0.1M Tris-HCl pH9.5,0.1M NaCl,50mM MgCl2)放置5min ;將20 μ L的NBT/BCIP (Roche公司)稀釋到980 μ I顯色緩沖液中，滴加到玻片上進行顯色，8-16h后PBS洗玻片，5min, 3遍，然后用顯微鏡觀察根系組織切片染色。如圖3所示，相對于對照(正義探針)，AhYSLl基因反義探針染色信號明顯在花生根系表皮細胞，表明AhYSLl基因定位在花生根系表皮。
權利要求
1.蛋白質，為下述I)或2): 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； 2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添力口，且具有脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運活性的由I)衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因為如下1)-4)中任一種: 1)序列表中的序列I所示的DNA分子； 2)編碼序列是序列表中序列I的第319-2358位的DNA分子； 3)在嚴格條件下與上述I)或2)所限定的DNA分子雜交的DNA分子,且該DNA分子編碼權利要求1所述蛋白； 4)與I)或2)或3)限定的基因序列具有90%以上同源性的DNA分子，且該DNA分子編碼權利要求1所述蛋白； 所述4)中的基因，與I)或2)或3)限定的基因最好有95%以上的同源性。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體或重組菌，其特征在于:所述重組表達載體為在PDR195的多克隆位點間插入權利要求2或3所述基因得到的重組表達載體；所述重組菌為攜帶有權利要求2或3所述基因的酵母。
6.權利要求1所述的蛋白，或權利要求2或3所述的基因，或權利要求4所述的重組表達載體或表達盒在在下述a)或b)中的應用: a)提高生物對脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運； b)培育耐低鐵脅迫生物；所述低鐵中的鐵為脫氧麥根酸三價鐵螯合物。
7.培育具有高脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運性能的生物的方法，所述方法包括如下步驟:將權利要求4或5所述的重組表達載體轉化目的生物，得到脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運性能高于所述目的生物的重組生物。
8.根據權利要求6所述的應用或權利要求7所述的方法，其特征在于:所述生物為酵母。
9.擴增權利要求2或3所述基因的全長或任一片段的引物。
全文摘要
本發明公開了一種脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的蛋白為下述1)或2)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運活性的由1)衍生的蛋白質。實驗證明本發明所提供的AhYSL1蛋白能夠使fet3和fet4基因缺失的酵母突變體菌株DEY1435恢復對脫氧麥根酸三價鐵螯合物的轉運功能，這證實了AhYSL1蛋白具有脫氧麥根酸三價鐵螯合物轉運的功能，進而為培育耐低鐵脅迫植物品種提供了重要的理論基礎。
文檔編號C12N15/11GK103159837SQ201110409999
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者左元梅, 熊宏春, 筧雄介, 西澤直子, 張福鎖 申請人:中國農業大學