專利名稱：一種具有原油降解功能的菌及適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤的生物修復劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物領域，具體涉及一種溶血不動桿菌及一種土壤修復劑。
背景技術：
在油田生產中，鉆井采油、井場作業、油氣集輸等過程都會產生地面溢油或落地原油。這些原油會在自身重力、表面張力及毛細現象的作用下侵蝕土層，進而改變土壤正常的理化性質，影響被污染區域的生態平衡。目前，我國每年產生落地原油約70萬噸，單井落地原油污染面積平均可達0.5 2. lm2，經回收處理后仍有7萬噸進入土壤。在北方產油地區， 被原油污染土壤的面積正在逐年擴大。原油滲入土壤后產生的危害主要表現在以下幾個方面(1) 土壤顆粒膠結成團，影響土壤的通透性，降低土壤質量，阻礙植物根系的呼吸與吸收，影響植物的根系生長；(2)使土壤氮、磷的含量相對減少，養分失衡，影響作物的營養吸收；(3)原油中的多環芳烴類(PAHs)有致畸、致癌和致基因突變的“三致”作用；(4)原油中不易被土壤吸附的組分會污染地下水；(5)原油中還可能含有少量重金屬元素，也會對植物和微生物的生長造成一定程度的影響。因此，為了保護油田周邊環境需要對原油污染土壤進行修復。我國松嫩平原的中北部和黃河三角洲地區油氣資源豐富，但是油區土地鹽堿化嚴重，且冬季氣溫很低，原油污染土壤的修復難度大。現有的對原油污染土壤的處理方法主要有兩種，一是集中堆放自然降解，二是運至污油回收站、污泥處理站進行熱沉降、調質離心等理化處理，處理后殘渣的含油量在洲左右。原油污染土壤自然降解到可利用狀態的時間長達5 10年，易污染地下水；而以回收原油為主的理化處理的設備投資和運行成本高。目前，尚未有適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤修復的修復劑。
發明內容
本發明的目的是為了解決目前尚未有適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤修復的修復劑的問題，而提供一種具有原油降解功能的菌及適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤的生物修復劑。本發明的具有原油降解功能的菌為溶血不動桿菌SJHX-2 CAcine tobac ter haemolyticus SJHX-2)，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為CGMCC No. M58。該溶血不動桿菌SJHX-2 {Acinetobacter haemolyticus SJHX-2)屬于莫拉氏菌 iMoraxellaceae)不動桿菌屬(Acinetobacter)0該溶血不動桿菌SJHX-2是從被原油污染的普通土壤及鹽堿土中分離、純化、篩選得到，其在LB平板培養基上3(T37°C培養18 24h即形成白色不透明圓形菌落，直徑2 4mm， 為革蘭氏陰性菌，菌體形態為較粗的短桿或球狀，直徑約1. 2 μ m ；氧化酶陰性，觸酶、明膠水解、溶血性皆為陽性；葡萄糖產酸微弱；可利用中長鏈烴、乙醇、蘋果酸等，不利用甲酸鹽、乳酸鹽和丙酸鹽等。經檢測，本發明的溶血不動桿菌SJHX-2的原油降解率可達9. 39%， 可耐受的溫度范圍為-3(T60°C ；該菌種在37°C時最佳培養時間為9 10h，LB培養液的 OD600=L 5 1. 6。本發明的溶血不動桿菌SJHX-2保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中科院微生物研究所，保藏日期為 2011 年 11 月 14 日，保藏號為 CGMCC No. 5458。本發明的適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤的生物修復劑由細菌培養液和營養液組成，所述的細菌培養液為溶血不動桿菌SJHX-2接種到LB液體培養基中培養的培養液；所述的營養液為含有無機鹽的水溶液，該營養液按摩爾百分比含有Ν4(Γ45%、 Ρ20 24%、Κ23 30%、Na6 10% 的、MgO. 03 0. 07%、CaO. θΓθ. 03%,營養液 ρΗ 值為 6. 6士0. 3。 該營養液是針對低溫氣候條件及鹽堿地區的土質配制而成的，能夠調節土壤的PH值和碳氮磷比例、促進菌株生長代謝的作用。溶血不動桿菌SJHX-2能夠在添加有2g/l葡萄糖的該營養液中正常生長。細菌培養液和營養液聯合使用，細菌培養液的添加量為每次每千克土 l(T20ml，營養液的添加量為每次每千克土 35、5ml。北方產油區自然環境的溫度范圍在-25 35°C之間，鹽堿土 ρΗ值一般不高于9。實驗表明，利用本發明的生物修復劑處理原油污染土壤在2年內可將土壤的含油量降至0. 3%以下，修復后土壤種植蘿卜白菜西瓜長勢良好。
圖 1 為本發明溶血不動桿菌 SJHX-2 {Acinetobacter haemolyticus SJHX-2)的形態圖2為具體實施方式
三的原油污染土壤含油量變化圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的具有原油降解功能的菌為溶血不動桿菌SJHX-2 Ucinetobacter haemo lyticus SJHX-2),該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. M58。該溶血不動桿菌SJHX-2是從被原油污染的普通土壤及鹽堿土中分離、純化、篩選得到的。具體步驟如下(一)菌種的分離純化在秋季室外溫度5°C左右時取自大慶油田井場或污油回收站附近被落地污油和溢油所污染的淺層土壤，將菌源土壤混合、粉碎后在室溫下用噴壺補充蒸餾水進行3、天的活化；取2 3g 土壤添加到裝有15ml LB培養基的 IOOml三角瓶中，在37°C、200rpm的條件下，搖床震蕩過夜培養。取初級培養液，用移液器以的接種量接種至裝有100ml LB培養基的搖瓶中傳代培養，培養至指數生長末期的培養液作為接種體，以的接種量進行轉接培養；按上述方法連續富集培養5代，取最后一次培養液ΙΟΟμΙ涂布到固體LB平板培養基上，連續涂布5飛塊平板；將平板置于培養箱中，在37°C下培養，待平板上形成高度分散的單菌落，根據菌落外觀形態挑取單菌落至 LB斜面培養基上，將斜面置于培養箱內在37°C下培養至形成菌苔；將斜面置于4°C冰箱中保藏；所得到的斜面菌種經染色鏡檢為純菌后進行篩選；
(二)菌種的初篩從斜面上挑取菌接種到LB液體培養基中培養1代，將培養液劃線涂布于選擇性平板培養基上，3(T33°C培養2 3d，觀察平板培養基上是否出現明顯的、生長良好的菌落；另從斜面中挑取菌接種到LB液體培養基中培養1代，培養液接入稀釋四倍的LB 液體培養基中培養，將2代培養液(0D_=1. Γ . 2)接入選擇性液體培養基中在35 37. 5°C、 180^200r/min的條件下培養144h，將選擇性液體培養基用溶劑汽油萃取，用分光光度計檢測含油量，計算原油降解率，原油降解率(％)=(起始油量一加菌處理后油含量)/起始油量X 100% ；所述的選擇性液體培養基為向無菌蒸餾水中加入MgS04。7H20 0. 2%，KH2PO4 0. 07 0. 12%, K2HPO4 (To. 05%, NH4NO3 0. 25%，外輸油0. 3 1% ；選擇性平板培養基為向選擇性液體培養基中添加瓊脂1. 8%，煮沸滅菌后倒入無菌培養皿室溫冷卻；
(三)菌種的復篩經初篩后得到4支降解原油能力強的菌株，經鏡檢染色確認是純菌后，進行菌種適應性評價最佳培養溫度測試將菌種分別接種到LB培養基中培養9h，測量在1(T50°C范圍內的不同培養溫度下菌種的OD6tltl值，測定菌種最佳培養溫度為35 40°C ； 菌種生長曲線測試將菌種分別接種到LB培養基中，分別測定第三代單菌培養液的生長曲線，測試溫度分別為33°C、35°C、37°C，搖床轉速180r/min ；耐溫性能測試將菌種分別置于-4(T60°C的環境中7d，然后接種至LB液體培養基中測試不同培養時間的OD6tltl值。對上述測試結果進行綜合評價后，從4支菌株中挑選出一支粗桿菌制備細菌培養液，經測定， 該菌株的原油降解率為9. 39%，高于其他三支菌株；該菌株的最佳培養溫度為37、0°C ；該菌種可耐受的溫度范圍為-3(T60°C ；該菌株在37°C時最佳培養時間為9 10h，LB培養液的 OD600=L 5 1. 6。將上述優選出的菌株送交天津科技大學生物工程學院進行菌種鑒定及DNA測序。 經鑒定，該菌株在LB平板培養基上3(T37°C培養18 24h即形成白色不透明圓形菌落，直徑2 4mm，為革蘭氏陰性菌，菌體形態為較粗的短桿或球狀，直徑約1. 2 μ m ；氧化酶陰性， 觸酶、明膠水解、溶血性皆為陽性；葡萄糖產酸微弱；可利用中長鏈烴、乙醇、蘋果酸等，不利用甲酸鹽、乳酸鹽和丙酸鹽等。菌株的的形態圖如圖1所示。鑒定結果為，該菌株為溶血不動桿菌Ucine tobac ter haemolyticus ),本發明將該溶血不動桿菌Ucine tobac ter Aaefflo^Fii^As)命名為溶血不動桿菌 SJHX—2 (Acinetobacter haemolyticus SJHX—2)。溶血不動桿菌SJHX-2 16S rDNA如SEQ ID NO :1所示。對溶血不動桿菌SJHX-2同源進行比對，此序列經GenBank中的BLAST比對為力acier haemolyticus (溶血不動桿菌)， 相近菌種有Accession No :NR_026207. 1，同源度99%。讀取Biolog微生物分析系統檢測結果數據，結果顯示溶血不動桿菌SJHX-2與力acter haemolyticus (溶血不動桿菌) 的可能性為100%，相似性為0.837 (在該鑒定系統中，相似率若大于0.5，結果較為可信)。經測試，本實施方式溶血不動桿菌SJHX-2的原油降解率可達9. 39%，具有良好的原油降解能力；其可耐受的溫度范圍為-3(T60°C，能夠適應北方寒冷氣候，適合用于寒冷地區油田被原油污染土壤的修復。
具體實施方式
二 本實施方式的適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤的生物修復劑由細菌培養液和營養液組成，所述的細菌培養液為溶血不動桿菌SJHX-2 Ucinetobacter haemolyticus SJHX-2)接種到LB液體培養基中培養的培養液，培養方式為1、2代各菌株單獨培養，第3代接入同一批搖瓶或發酵罐中大規模培養。最佳培養溫度為35 37°C，最佳培養時間為IOh。所述的營養液為含有無機鹽的水溶液，該營養液按摩爾百分比含有Ν4(Γ45%、P20 24%、K23 30%、Na6 10% 的、MgO. 03 0. 07%,CaO. θΓθ. 03%，營養液 ρΗ 值為 6. 6士0. 3。該
營養液是針對低溫氣候條件及鹽堿地區的土質配制而成的，能夠調節土壤的PH值和碳氮磷比例、促進菌株生長代謝的作用。溶血不動桿菌能夠在添加有2g/l葡萄糖的該營養液中正常生長。細菌培養液和營養液聯合使用，細菌培養液的添加量為每次每千克土 l(T20ml， 營養液的添加量為每次每千克土 35、5ml。北方產油區自然環境的溫度范圍在-25 35°C之間，鹽堿土 PH值一般不高于9。具體使用方法如下
(1)室外日最低氣溫介于(T5°C時按l(Tl5ml/kg開始投加的細菌培養液，少量補水， 翻土 ；3 4d后，按40ml/kg投加營養液，翻土，補水至土壤濕度約為50% ；細菌培養液每30d 投加一次，營養液每30d投加一次；
(2)室外日最低氣溫介于5 15°C時細菌培養液每30d投加一次，營養液每2(T25d投加一次；
(3)室外日最低氣溫大于15°C時細菌培養液每30d投加一次，營養液每15 20d投加一次；
(4)室外日最高氣溫低于0°C時停止投加生物修復劑，次年春季恢復投加；
(5)日常需要翻土澆水維護，以保持土壤濕度在4(Γ60%左右及足夠的透氣性。實驗表明，利用本發明的生物修復劑處理原油污染土壤在2年內可將土壤的含油量降至0. 3%以下，修復后土壤種植蘿卜白菜西瓜長勢良好。
具體實施方式
三本實施方式的的適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤的生物修復劑與具體實施方式
二的生物修復劑相同。將該生物修復劑應用于大慶油田采油九廠某井口附近的被原油污染的鹽堿土壤，土壤面積為2 X 2m, 土壤厚度0. 25m,含油量9. 81%， PH8.4。修復從2009年9月開始，修復期間共投加營養液14次共1480 L，投加細菌培養液次共517L，到2011年6月該地塊土壤含油量為0.四％，土壤中含油量變化如圖2所示。由上述實驗數據可以看出，本實施方式的生物修復劑能夠有效分解土壤中的原油，降低土壤中原油含量，從而修復被原油污染的土壤。
權利要求
1.一種具有原油降解功能的菌，其為溶血不動桿菌SJHX-2 Ucinetobacter haemolyticus SJHX-2)，該菌株保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No.5458。
2.一種適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤的生物修復劑，其特征在于該生物修復劑由細菌培養液和營養液組成，所述的細菌培養液為溶血不動桿菌SJHX-2 Ucinetobacter haemolyticus SJHX-2)接種到LB液體培養基中培養的培養液；所述的營養液為含有無機鹽的水溶液，該營養液按摩爾百分比含有Ν4(Γ45%、P20l4%、Κ23 30%、 Na6 10% 的、MgO. 03 0. 07%、CaO. θΓθ. 03%,營養液 ρΗ 值為 6. 6士0. 3。
全文摘要
一種具有原油降解功能的菌及適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤的生物修復劑。屬于微生物領域。它解決了目前尚未有適用于低溫和鹽堿地區的原油污染土壤修復的修復劑的問題。本發明的溶血不動桿菌SJHX-2保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No.5458。生物修復劑由細菌培養液和營養液組成，細菌培養液為溶血不動桿菌SJHX-2接種到LB液體培養基中培養的培養液；營養液為含有無機鹽的水溶液。本發明的生物修復劑處理原油污染土壤在2年內可將土壤的含油量降至0.3%以下，修復后土壤種植蘿卜白菜西瓜長勢良好。
文檔編號C12N1/20GK102417891SQ20111040998
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者喬麗艷, 張昌興, 王壽光, 蔡徇, 趙福龍, 鄭潤芬 申請人:中國石油天然氣股份有限公司, 大慶油田工程有限公司, 大慶油田有限責任公司