專利名稱：一種快速定量檢測植物乳桿菌st-ⅲ的方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測技術領域，特別涉及一種快速定量檢測植物乳桿菌ST-III 的方法及其試劑盒。
背景技術：
益生菌是“當攝入一定數量后，能對宿主健康起有益作用的微生物活體”。隨著生物技術及醫學等學科的發展，益生菌對人體健康的有益功效越來越多地得到證實，益生菌制品也因此日益受到人們的追捧，生產及銷售量也逐年呈上升趨勢。大量研究表明，只有產品中益生菌的活菌數達到IX IO6個/ML才能夠發揮其應有的功效。然而由于我國尚沒有系統地研究和制定益生菌制品的標準，特別是市場上對所含益生菌活菌數以及在貨架期益生菌存活數沒有進行嚴格限定，導致益生菌及制品市場異常混亂，甚至出現在益生菌制品中檢驗不出該益生菌的以假亂真現象。如此以來，對其質量的監督管理，尤其對其所含益生菌的種類及其數量的檢測就顯得尤為重要。傳統方法中對益生菌的定性、定量檢測，仍采用生理生化反應和選擇性培養基純培養分離計數的方法。這些方法易受培養條件、菌種特性等因素影響，檢測效率有限，特別是很難區分同種的不同的細菌，使得在含有多種細菌的復雜體系中很難檢測到目標益生菌的實際數量。隨著科技的進步，以PCR為基礎分子生物學方法以其較高的準確性及穩定性等優點已成功介入到益生菌的鑒定領域。特別是實時熒光定量PCR(Real-time PCR)的出現更是實現了 PCR技術從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，成為了分子生物學和微生物學領域定量檢測的重要方法。采用實時熒光定量PCR技術建立簡便、快速、準確的益生菌乳制品中益生菌定量檢測方法，可以簡化益生菌的檢測程序、提高檢測效率，能提高我國益生菌的定量檢測能力、完善保健食品的質量監管，并為益生菌產業的長遠發展提供技術保障。植物乳桿菌ST-III是一種從是從泡菜中分離得到的具有降膽固醇、降血脂、粘附腸道上皮細胞等多種功能的益生菌。該菌株已作為生產發酵劑在光明乳業有限公司正式投產上市，市場反映良好。為了更好地發揮ST-III的益生功能，就必須要保證產品活菌數達到IX IO6個/ML，這就需要測定ST-III在益生菌產品中的實際數量。因此建立一種快速、 簡便、特異地檢測產品中ST-III實際數量的方法對于實際生產和應用有重要意義。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對目前尚不存在植物乳桿菌ST-III菌株分子檢測手段的現狀，提供一種快速、特異性強、靈敏度高、成本低的定量檢測植物乳桿菌ST-III 的方法及其試劑盒。本發明采取的技術方案之一為一種快速定量檢測植物乳桿菌ST-III的方法，包括以下步驟1)提取待檢樣品的總RNA ；
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2)將步驟1)提取的總RNA反轉錄成cDNA ；3)采用特異性擴增植物乳桿菌ST-III的引物對，以步驟2)所得cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增檢測；4)通過比較待檢樣品和定量外標準品的循環閾值而對待檢樣品中的實際拷貝數
進行定量。本發明步驟；3)所述的引物對中，一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列相同，引物長度為15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列互補，引物長度為15-40bp，更佳的是 20-30bp，最佳的是27bp ；該引物對的擴增片段為200-867bp，優選M2bp ；所述的植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III KilA結構域蛋白的基因；優選的是編碼植物乳桿菌ST-III的KilA結構域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中連續的200-867個，優選242個核苷酸片段；更優選的，是編碼植物乳桿菌ST-III的KilA結構域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最優選的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第360位至第601位所示。最優選的，所述的引物對中，一條引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一條引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。本發明步驟3)所述的PCR反應體系為常規，只要能夠擴增出特異性產物即可。PCR 反應體系優選包括上游引物，下游引物，dNTP, PCR buffer, Mg2+，Taq DNA聚合酶，cDNA模板和SYBR Green I。其中，上游引物或者下游引物優選的終濃度為0. 1-Ι.ΟμΜ，更優選 0. 2 μ M ；cDNA模板的終濃度優選為0. 5-2ng/ μ L，更優選的lng/ μ L。而其他組分的濃度如常規，一般是 0. 2mmol/L dNTP, IXPCR buffer, 1. Ommol/L Mg2+，0. 02U/μ L Taq DNA 聚合酶。步驟3)所述的PCR反應參數為常規，只要能夠擴增出特異性產物即可。較佳的為 950C 30S ；950C 5S,60°C 25S，72°C 30S,40 個循環；4°C保存。本發明步驟4)所述的定量外標準品優選植物乳桿菌ST-III的總RNA反轉錄后的總cDNA。優選的，采用定量外標準品的10倍梯度水稀釋液，稀釋度從IO-1UO-2UO-3UO^ 10_5、10_6、ΙΟ"7, ΙΟ"8,進行在熒光定量PCR，根據梯度稀釋的定量標準品的不同Ct值定量待檢樣品中的cDNA分子數量。本發明采取的技術方案之二為一種檢測植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR試劑盒，包括特異性擴增植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子的的引物對。該引物對中，一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列相同，引物長度為15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列互補，引物長度為15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp ；該引物對的擴增片段為 200-867bp，優選M2bp ；所述的植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III KilA結構域蛋白的基因；優選的是編碼植物乳桿菌ST-III的KilA結構域蛋白基因的第1 位至第867位所示序列的核苷酸中連續的200-867個，優選242個核苷酸片段；更優選的， 是編碼植物乳桿菌ST-III的KilA結構域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最優選的其核苷酸序列如SEQ IDN0. 1的第360位至第601位所示。最優選的，所述的引物對中，一條引物的序列如SEQ ID N0. 2所示，另一條引物的序列如SEQ ID N0. 3所示。本發明所述的檢測植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR試劑盒，還包括STOR Green I熒光定量檢測試劑。
本發明所述STOR Green I熒光定量檢測試劑一較佳方式含有熒光定量反應液，其中包括STOR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、TaqDNA聚合酶、無菌雙蒸水、MgCl2 溶液等組分，使用時只需加入引物和模板即可進行PCR反應。本發明所述STOR Green I熒光定量檢測試劑另一較佳方式含有熒光定量總反應液，其中包含了 STOR Green I熒光染料、引物、PCR緩沖液、dNIPs溶液、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水、MgCl2溶液等所有組份，使用時只需加入模板即可進行PCR反應，操作非常快捷簡單。本發明所述的檢測植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR試劑盒，還包括定量外標準品。所述的定量外標準品是植物乳桿菌ST-III的總RNA反轉錄后的總CDNA。本發明所述的檢測植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR試劑盒，還包括RNA提取試劑和/或反轉錄試劑。所述的RNA提取試劑較佳的含有Trizol、RNA酶抑制劑。所述的反轉錄試劑較佳的含有逆轉錄酶(AMV)、AMV緩沖液。AMV緩沖液含有dNTPs、隨機引物、RNA 酶抑制劑、無菌雙蒸水。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。本發明中，植物乳桿菌ST-III是現有技術，為CGMCC No. 0847。本發明提供了一種快速檢測植物乳桿菌ST-III菌株數量的方法及試劑盒，具有如下優點1、檢測速度快、特異性強對于微生物的普通生化鑒定一般需要2-3天，PCR鑒定只需要2_3小時；且普通生化鑒定無法鑒定同種植物乳桿菌之間的不同菌株，本發明設計的PCR引物對根據編碼植物乳桿菌ST-III菌株的KilA結構域蛋白基因的特異性標志片段設計，該引物對可以在植物乳桿菌ST-III菌株中擴增出相應的DNA片段，并且只特異性的擴增植物乳桿菌ST-III的基因，而不能在其他相關植物乳桿菌中擴增出相應片段，包括NCBI已報道的經過全基因組測序的三種植物乳桿菌菌株，說明以該基因片段為基礎設計的PCR反應系統具有良好的特異性。2、靈敏度高、成本低熒光定量PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克級的起始待測模板擴增到微克水平，即使待測樣品中只含有3個目標細菌，PCR也可以檢出，因此靈敏度高。本發明檢測限達到2. 85xl03CFU/mLo普通生化鑒定方法所用試劑種類多，步驟復雜，而PCR鑒定試劑種類少，操作簡單，成本較低。此外，與通過全基因組序列測序區分同類細菌間不同菌株的方法相比，費用大為降低、實驗周期也大為縮短，可以很方便地投入實際應用。3、本發明的獨特之處在于，特異引物的設計使得該方法只對ST-III的特征片段進行擴增，排除了其他細菌特別是其他植物乳桿菌的干擾；以RNA為基礎的熒光定量PCR可以排除已死亡的ST-III，只檢測產品的活菌數量。
以下結合
本發明的特征和有益效果。圖1是植物乳桿菌的熒光定量PCR標準曲線。
具體實施例方式本發明人經過深入而廣泛的研究，從植物乳桿菌ST-111 (lactobacil Ius plantarum ST-III)的KilA結構域蛋白基因中發現較合適的擴增序列。其中，KilA結構域蛋白為一類DNA結合蛋白。該蛋白對于為DNA復制、重組和修復至關重要。選擇KilA結構域蛋白基因序列作為引物，具有很好的特征性。本發明根據NCBI已報道的三株植物乳桿菌Lactobacillus plantarum WCFSl(Genebank number :AL935263. 1), Lactobacillus plantarum 14917 (Genebank number :ACGZ00000000)，Lactobacillus plantarum JDMl(Genebank number :CP001617.1) 的全基因組序列，運用blast程序找出ST-III所獨有的核苷酸序列，根據這些核苷酸序列設計相應引物。經過對這些引物的篩選和驗證，得到了能夠用于鑒定植物乳桿菌ST-III的特異性引物。由此，本發明提供了使用該引物的熒光定量PCR檢測試劑盒和檢測方法。本發明對植物乳桿菌ST-III的檢測具有快速、特異性強、靈敏度高、成本較低的特點。本發明發現一種植物乳桿菌(LactcAacillus plantarum) ST-III菌株的遺傳標記分子，其是編碼植物乳桿菌ST-III KilA結構域蛋白的基因。KilA結構域蛋白(KilA domain protein)是一類DNA結合蛋白。編碼植物乳桿菌ST-III KilA結構域蛋白的基因的核苷酸序列較佳的是GenBank AccessionNo.為YP_0039M036. 1。優選的，所述的遺傳標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III的KilA結構域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中連續的200-867個，優選242個核苷酸片段。更優選的，所述的遺傳標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III的KilA結構域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸。所述的遺傳標記分子最優選的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第360位至第601位所示。本發明還發明了一種檢測植物乳桿菌(LactcAacillus plantarum) ST-III菌株的引物對。該引物對中，一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列相同，弓丨物長度為15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列互補，引物長度為15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。該引物對的擴增片段為200-867bp，優選M2bp。優選的，所述的引物對中，一條引物的序列如 SEQID N0. 2所示，另一條引物的序列如SEQ ID N0. 3所示。本發明所述的特異性擴增植物乳桿菌ST-III菌株的引物，根據本發明的遺傳標記物的序列(SEQ ID NO. 1)進行設計，并通過常規的DNA合成方法獲得，例如可以用商業化的DNA自動合成儀合成。定量檢測方法將本發明的引物與熒光染料技術結合，便得到了本發明的植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒。這種方法不僅克服了常規PCT方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。為了實現對植物乳桿菌ST-III定量的功能，使用熒光定量PCR。優選采用嵌合熒光染料法，采用熒光染料STOR Green I。SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結合染料，與雙鏈DNA非特異性結合。在游離狀態下，STOR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000倍。所以，一個反應發出的全部熒光信號與出現的雙鏈DNA 量呈比列，且會隨擴增產物的增加而增加。在PCR反應過程中，當STOR Green I與擴增產生的雙鏈DNA結合，通過測定熒光強度，即可確定雙鏈DNA的含量。STOR Green I特別是能用于所有PCR反應體系，無需熒光探針，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。 并且在PCR結束后可直接進行融解曲線反應分析。通過融解曲線的分析，能判斷是否存在著變異或非特異性的擴增。STOR Green I的最大吸收波長約為497nm，發射波長最大約為 520nmo本發明提供一種快速定量檢測植物乳桿菌ST-III的方法，包括以下步驟1)提取待檢樣品的總RNA ；2)將步驟1)提取的總RNA反轉錄成cDNA ；3)采用特異性擴增植物乳桿菌ST-III的引物對，以步驟2)所得cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增檢測；4)通過比較待檢樣品和定量外標準品的循環閾值而對待檢樣品中的實際拷貝數
進行定量。本發明的待測樣品為任何可能含有植物乳桿菌ST-III菌株的物質，較佳的比如益生菌類發酵乳制品，包括酸奶，也包括發酵豆奶等。本發明中，步驟1)提取待檢樣品的總RNA的方法是常規技術，如Trizol提取法， 為本領域技術人員所熟知。本發明中，步驟2)將總RNA反轉錄成cDNA的方法也是常規技術，一般用反轉錄酶進行反應，一般在PCR儀上在反轉錄酶適宜的溫度下反應一段時間即可，這也是為本領域技術人員所熟悉的方法。本發明中，步驟3)采用本發明的特異性引物進行熒光定量PCR擴增，較佳的在實時熒光PCR儀中進行。所用的引物為本發明所特別提供的特異性擴增植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子的的引物對。該引物對中，一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列相同，引物長度為15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列互補，引物長度為15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。該引物對的擴增片段為200-867bp，優選M2bp。所述的植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III KilA結構域蛋白的基因；優選的是編碼植物乳桿菌 ST-III的KilA結構域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中連續的200-867 個，優選242個核苷酸片段；更優選的，是編碼植物乳桿菌ST-III的KilA結構域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最優選的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第360 位至第601位所示。最優選的，所述的引物對中，一條引物的序列如SEQ IDN0.2所示，另一條引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。它們的擴增片段長度為M2bp。其中，所述的PCR反應體系為常規，只要能夠擴增出特異性產物即可。PCR反應體系優選包括上游引物，下游引物，dNTP, PCR buffer, Mg2+，TaqDNA聚合酶，cDNA模板和 SYBR Green I。其中，上游引物或者下游引物的終濃度為0. 1-1. 0 μ M，優選0. 2 μ M ； cDNA模板的終濃度為0. 5-2ng/yL，優選的Ing/μ L。而其他組分的濃度如常規，一般是 0. 2mmol/L dNTP, 1 XPCRbuffer, 1. Ommo 1/L Mg2+，0. 02U/μ L Taq DNA 聚合酶。步驟 3)所述的PCR反應參數為常規，只要能夠擴增出特異性產物即可。較佳的為95°C 30S ；95°C 5S， 60°C 25S，72°C 30S,40 個循環；4°C保存。步驟4)通過比較待檢樣品和定量外標準品的循環閾值而對待檢樣品中的實際拷貝數進行定量。所述的定量外標準品是植物乳桿菌ST-III的總RNA反轉錄后的總cDNA。采用定量外標準品的10倍梯度水稀釋液，稀釋度從IO-1UO^ 10_3、10_4、10_5、10_6、IO-7, IO-8, 進行在熒光定量PCR，由于每個稀釋度中CDNA分子不同，得到的Ct值就不同，根據梯度稀釋的定量標準品的不同Ct值定量待檢樣品中的cDNA分子數量如拷貝數。熒光定量PCR試劑盒本試劑盒采用了 STOR Green I嵌合熒光法進行Real Time PCR的專用試劑，可快速對目的基因進行定量檢測。在一優選例中，本發明提供快速檢測植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括特異性擴增植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子的引物對。 該引物對中，一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列相同，引物長度為 15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列互補，引物長度為15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。該引物對的擴增片段為200-867bp，優選M2bp。所述的植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III KilA結構域蛋白的基因；優選的是編碼植物乳桿菌ST-III的KilA結構域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中連續的200-867個，優選242個核苷酸片段；更優選的，是編碼植物乳桿菌ST-III的KilA結構域蛋白基因的第360位至第601 位所示序列的核苷酸；最優選的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第360位至第601位所示。 最優選的，所述的引物對中，一條引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一條引物的序列如SEQ ID NO. 3 所示。 在另一優選例中，本發明的快速定量檢測植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR試劑盒包括STOR Green I熒光定量檢測試劑。所述STOR Green I熒光定量檢測試劑的一較佳方式是含有熒光定量反應液，其中包括STOR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、 Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水、MgCl2溶液等組分，使用時只需加入引物和模板即可進行PCR 反應。所述STORGreen I熒光定量檢測試劑的另一較佳方式是含有熒光定量總反應液，其中包含了 STOR Green I熒光染料、引物、PCR緩沖液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水、MgCl2溶液等所有組份，使用時只需加入模板即可進行PCR反應，操作非常快捷簡單。熒光可以被定量PCR儀內的熒光信號采集系統檢測，熒光量的增加與PCR產物的積累量成正比例關系。對植物乳桿菌ST-III的定量可以通過與定量標準品的循環閾值 (Ct, Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環數。Ct值與起始模板數成一定比例關系，Ct值越小，起始模板數越多；相反，Ct值越大，起始模板數越少。利用梯度稀釋標準品的Ct值制成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可以準確測出該樣品的起始拷貝數。本發明提供的快速定量檢測植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR試劑盒較佳的還包括定量外標準品。所述的定量外標準品是植物乳桿菌ST-III的總RNA經過測量^Onm的吸光度計算得到其實際的拷貝數，后反轉錄后的總cDNA，定量時采用10倍梯度水稀釋液， 稀釋度從κγ^ΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΚΓ^ΙΟΛ在熒光定量PCR中，由于每個稀釋度中 cDNA分子不同，得到的Ct值就不同，根據定量標準品(梯度稀釋的定量外標準品)Ct值定量樣品中的cDNA分子。本試劑盒較佳的還包括常規的兩步法RT-PCR SYBR Green I熒光定量檢測試劑盒所包含的成分，如可以包括RNA提取試劑、反轉錄試劑。其中較佳的RNA提取試劑含有 Trizol、RNA酶抑制劑。反轉錄試劑含有逆轉錄酶(AMV)、AMV緩沖液。AMV緩沖液含有dNIPs、隨機弓I物、RNA酶抑制劑、無菌雙蒸水。本發明的檢測植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR試劑盒，通過對各組分，如引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優化，反復實驗，試劑盒完全可以滿足快速特異檢測植物乳桿菌ST-III的實際需求。下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1益生菌乳制品中植物乳桿菌的定量檢測方法a.樣品總RNA的制備采用Trizol法提取將市場上購買的含有植物乳桿菌ST-III發酵乳飲料(光明暢優植物乳酸菌飲品)做為實施樣品，分別是距離生產日期為19天，15天和13天的三個樣品，置于盛有液氮的研缽中研磨，然后迅速加入ImLTrizol試劑，按Trizol試劑盒說明書 (TRIzol Plus RNA Purification System，美國 invitrogen 公司，貨號 12183-555)提取樣品RNA，然后用DNaseI處理兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA樣本， 測濃度，RNA完整性通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。b.反轉錄擴增依據反轉錄試劑盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，大連寶生物工程有限公司，貨號D6130)說明書進行RNA反轉錄擴增。c.實時熒光定量PCR熒光定量PCR按照SYBR Prim必cript RT-PCR Kit (大連寶生物工程有限公司，貨號 DRR063A)說明書進行。反應體系 25. ομ L :SYBR PremixEx Taq (2X) 12. 5 μ L, 10 μ mol/L 上、下游引物(分別是 SEQ ID NO. 2 和 SEQID N0. 3)各 0. 5 μ L，cDNA 模板 2. O μ L (反應濃度 Ing/ μ L)，CldH2O 9. 5 μ L。熒光定量PCR 反應參數95°C 30S ；95°C 5S，60°C 25S，72°C 30S，40 個循環；4°C保存。d.定量外標準品的制備和標準曲線的繪制提取植物乳桿菌ST-III的總RNA，紫外分光光度計測定吸光度值Q60nm)后，根據 ST-III的基因組大小計算出拷貝數。反轉錄得到CDNA，做10倍系列稀釋，以此作為模版進行如上熒光定量PCR反應。以不同拷貝數的陽性模板的對數為橫坐標，以PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數(Ct)為縱坐標得到植物乳桿菌ST-III的標準曲線，見圖1。稀釋的最低濃度是2. 85xl03CFU/mL，低于此濃度，熒光信號雜亂，因而該方法的檢測限為 2. 85xl03CFU/mL。e.結果及判斷以待測樣品的cDNA為模板，用植物乳桿菌ST-III的菌株特異性引物，以相同的體系進行植物乳桿菌特征片段的熒光定量PCR擴增，結果見表1。依據公式Y = -3. 3691gX+39. 84和待測樣品的Ct值，可以計算出樣品中植物乳桿菌ST-III的數量，見表1。表1.產品中ST-III含量的定量結果
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權利要求
1.一種快速定量檢測植物乳桿菌ST-III的方法，其特征在于，包括以下步驟1)提取待檢樣品的總RNA；2)將步驟1)提取的總RNA反轉錄成cDNA；3)采用特異性擴增植物乳桿菌ST-III的引物對，以步驟2、所得cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增檢測；4)通過比較待檢樣品和定量外標準品的循環閾值而對待檢樣品中的實際拷貝數進行定量。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的引物對中，一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列相同，引物長度為15-40bp ；另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列互補，引物長度為15-40bp，該引物對的擴增片段為200-867bp，所述的植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III KilA結構域蛋白的基因。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物對中，一條引物的序列如SEQID NO. 2所示，另一條引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述的定量外標準品是植物乳桿菌 ST-III的總RNA反轉錄后的總cDNA，采用定量外標準品的10倍梯度水稀釋液進行在熒光定量PCR，根據梯度稀釋的定量標準品的不同Ct值定量待檢樣品中的cDNA分子數量如拷貝數。
5.一種檢測植物乳桿菌ST-III的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，包括特異性擴增植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子的的引物對，該引物對中，一條引物和植物乳桿菌 ST-III菌株的遺傳標記分子的序列相同，引物長度為15-40bp;另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的遺傳標記分子的序列互補，引物長度為15-40bp ；該引物對的擴增片段為 200-867bp ；所述的植物乳桿菌ST-III遺傳標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III KilA結構域蛋白的基因。
6.如權利要求5所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述的引物對中，一條引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一條引物的序列如SEQ IDN0. 3所示。
7.如權利要求5所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述的熒光定量PCR試劑盒中還包括熒光定量反應液，其中包括STOR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNIPs溶液、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水和MgCl2溶液。
8.如權利要求5所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述的熒光定量PCR試劑盒中包括熒光定量總反應液，其中包含了 STOR Green I熒光染料、引物、PCR緩沖液、dNIPs溶液、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水和MgC12溶液，所述的引物一條的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一條的序列如SEQ ID NO. 3所示。
9.如權利要求5所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述的熒光定量PCR試劑盒還包括定量外標準品。
10.如權利要求5所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述的熒光定量PCR試劑盒還包括RNA提取試劑和/或反轉錄試劑。
全文摘要
本發明公開了一種快速定量檢測植物乳桿菌ST-III的方法及其試劑盒。包括以下步驟1)提取待檢樣品的總RNA；2)將步驟1)提取的總RNA反轉錄成cDNA；3)采用特異性擴增植物乳桿菌ST-III的引物對，以步驟2)所得cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增檢測；4)通過比較待檢樣品和定量外標準品的循環閾值而對待檢樣品中的實際拷貝數進行定量。本發明可以快速的檢測樣品中的植物乳桿菌ST-III數量，快速、特異性強、靈敏度高，檢測限達到2.85x103CFU/mL。
文檔編號C12Q1/68GK102453767SQ20111043915
公開日2012年5月16日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者任婧, 周方方, 艾連中, 陳臣 申請人:光明乳業股份有限公司