專利名稱：一株具有高產γ-氨基丁酸能力的菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株具有產Y-氨基丁酸能力的菌株。
背景技術：
乳酸菌指發酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。 絕大部分乳酸菌都是人體內必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。目前已被國內外生物學家所證實，腸內乳酸菌與健康長壽有著非常密切的直接關系。植物乳桿菌是乳酸菌的一種，屬于乳桿菌屬，有很強的發酵碳水化合物的能力，較耐鹽，與其它乳酸菌有協同作用，具有免疫調節、拮抗致病菌、抗突變和防癌等益生性質，其代謝產生的有機酸、過氧化氫、雙乙酰、細菌素等物質能夠抑制病原菌的生長和粘附，調節宿主腸道、陰道、尿道的微生態平衡、預防和治療由于微生態失衡而造成的腹瀉、感染；植物乳桿菌是厭氧細菌(兼性好氧)，能夠降低血清膽固醇。在繁殖過程中能產出特有的乳酸桿菌素，乳酸桿菌素是一種生物型的防腐劑。
發明內容
本發明提供了一株具有高產Y-氨基丁酸(GABA)能力的菌株。一株具有高產Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌(LactcAacillus ρlantarum)NDC 75017，屬于乳桿菌屬(LactcAacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為 CGMCC NO :5448，保藏日期為2011年11月08日；它為革蘭氏陽性菌，呈短桿狀、兩端呈圓形，長為1. 0 μ m 1. 7 μ m，寬為0. 4 μ m 0. 9 μ m，無芽孢，無鞭毛；在MRS培養基上形成白色的圓形菌落、直徑為0. 5 2mm、菌落邊緣整齊、細致有光澤、中央有凸起。本發明中一株具有高產Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌 (Lactobacillus ρ lantarum) NDC 75017，該菌株能夠利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α -甲基-D-甘露糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七葉靈、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、棉子糖、攏牛兒糖、D-阿拉伯糖醇和葡萄糖酸鹽發酵產酸；該菌株不能利用甘油、赤癬醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、 L-木糖、阿東醇、β -甲基-D-木糖甙半乳糖、山梨糖、鼠李糖、衛茅醇、肌醇、山梨醇、α -甲基-D-甘露糖甙、菊糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-來蘇糖、D-塔格糖、D-巖糖、L-巖糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽和5-酮基-葡萄糖酸鹽發酵產酸；該菌株過氧化氫酶實驗呈陰性、明膠液化實驗呈陰性、硝酸鹽還原實驗呈陰性、硫化氫實驗呈陰性、吲哚實驗呈陰性、 動力實驗為不運動；該菌株的最適生長溫度為30 35°C，10°C能生長，45°C不生長，生長ρΗ 為4. 5 9. 5，最適合生長ρΗ為5. 8。本發明中一株具有高產Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌 (Lactobacillus ρ lantarum) NDC 75017，經 16S rDNA 序列測序，結果在 NCBI 上進行同源個生比罾，Iiftt NDC 75017 % Lactobacillus ρlantarum JDMU Lactobacillus ρlantarum subsp. plantarum ST-II I、Lactobacillus ρ lantarum WCFSl 的親緣關系最近，同源性達 99.8%。經IGS(intergenic spacer)序列測序，將IGS測序結果的785個堿基在NCBI 上進行同源性比較，菌株 NDC75017 與 Lactobacillus plantarum WCFSU Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III 的親緣關系最近，同源性達 99. 5%。本發明中一株具有高產Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)NDC 75017，屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號， 保藏編號為CGMCC NO :5448，保藏日期為2011年11月08日。本發明中一株具有高產Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)NDC 75017，該菌具有高產Y -氨基丁酸的能力，經高效液相色譜檢測其產量高達138mg/L ； γ -氨基丁酸是一種重要的抑制性神經遞質，它參與多種代謝活動，具有很高的生理活性，已報道的生理活性有調節血壓、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活力、營養神經細胞、增加生長激素分泌、健肝利腎、預防肥胖、促進乙醇代謝 (醒酒)、改善更年期綜合癥等多種功效，也可與各種各樣的食品組合，制造成各種各樣富含Y-氨基丁酸的功能食品。
圖1為具體實施方式
一中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 個菌的電鏡圖；圖2為具體實施方式
一中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 個菌的電鏡圖；圖3為具體實施方式
一中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 16SrDNA的系統發育樹；圖4為具體實施方式
一中植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC IGS的系統發育樹。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式一株具有高產Y-氨基丁酸能力的菌株，它為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) NDC 75017，屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC N0:5448，保藏日期為2011年11月08日；它為革蘭氏陽性菌， 呈短桿狀、兩端呈圓形，長為1. 0 μ m 1. 7 μ m，寬為0. 4 μ m 0. 9 μ m，無芽孢，無鞭毛；在 MRS培養基上形成白色的圓形菌落、直徑為0. 5 2mm、菌落邊緣整齊、細致有光澤、中央有凸起。本實施方式中植物乳桿菌(LactcAacillus plantarum)NDC 75017的最適生長溫度為30 35°C，10°C能生長，45°C不生長，生長pH為4. 5 9. 5，最適合生長pH為5. 8。本實施方式一株具有高產Y -氨基丁酸能力的菌株，它從內蒙古傳統發酵乳制品中分離得到，篩選方法按以下步驟實現
75017 單 75017 多 75017 的 75017 的
4
一、樣品的采集采集樣品時雙手戴上無菌的一次性乳膠手套，用一次性無菌注射器吸取內蒙古通遼地區牧民家庭中自制的傳統酸奶樣品，放入事先已經滅菌的器皿中，用記號筆在器皿上標注樣品編號并封好放入冰盒內，將冰盒放入含有冰袋的保溫箱；測定采集樣品的PH值與溫度，并記錄采集地點到調查采樣表中，同時用相機采集樣品的圖片資料；采集后的樣品帶回實驗室于4°C冰箱中保存備用。二、乳酸菌的分離與純化用滅菌移液器取ImL酸奶樣品，接種于滅菌的生理鹽水中，進行梯度稀釋；在滅菌培養皿中倒入滅菌、冷卻至50°C的含有0. 75% CaCO3的MRS固體培養基，冷卻至凝固后，將稀釋的樣品接入MRS固體培養基中，放入恒溫厭氧培養箱，37°C培養48 72h。觀察并記錄菌落特征。從平板上長出的菌落中挑選出周圍形成透明圈的單個菌落，進行革蘭氏染色，將 G+菌株繼續劃線于MRS固體培養基，直至確定為純菌；將純化的菌株再進行革蘭氏染色并做H2A酶試驗，凡革蘭氏染色陽性、H2O2酶試驗陰性的菌株可初步確定為乳酸菌；三、乳酸菌分離株的保存將純化菌株接種到MRS斜面培養基中，經培養后置4°C冰箱中保存備用，同時將分離菌株的純培養物接種于MRS液體培養基中，37°C厭氧培養16h，連續傳代培養3次，將培養液與30%滅菌甘油以1 1的比例混合均勻，置于-80°C冰箱冷凍保存；其中所述MRS固體培養基(IOOOmL)由5g的蛋白胨、5g的牛肉膏、5g的酵母粉和 IOg的胰蛋白胨、1. OmL的Tween-80、20g的葡萄糖、各10毫升的5種鹽溶液和余量的蒸餾水組成，調PH至5. 8，121°C高壓滅菌15min ；其中5種鹽溶液:20g K2HPO4 · 3H20+IOOmL蒸餾水，20g檸檬酸氫二銨+IOOmL蒸餾水，50g乙酸鈉+IOOmL蒸餾水，5. 8gMgS04 ·7Η20+IOOmL 蒸餾水，2. 5g MnSO4 · H2O+IOOmL 蒸餾水。本實施方式篩選所得菌的電鏡圖見圖1和2。對篩選所得菌進行生理生化試驗依據《伯杰氏細菌學鑒定手冊》(第八版)和《常見細菌系統鑒定手冊》對其進行常規生理生化鑒定，實驗結果為該菌株能夠利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α -甲基-D-甘露糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七葉靈、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、棉子糖、攏牛兒糖、D-阿拉伯糖醇和葡萄糖酸鹽發酵產酸；該菌株不能利用甘油、赤癬醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、阿東醇、β -甲基-D-木糖甙半乳糖、山梨糖、鼠李糖、衛茅醇、肌醇、山梨醇、α -甲基-D-甘露糖甙、菊糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-來蘇糖、D-塔格糖、D-巖糖、L-巖糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽和5-酮基-葡萄糖酸鹽發酵產酸；該菌株過氧化氫酶實驗呈陰性、明膠液化實驗呈陰性、硝酸鹽還原實驗呈陰性、硫化氫實驗呈陰性、吲哚實驗呈陰性、動力實驗為不運動。分子生物學鑒定對篩選所得菌經16S rDNA序列測序，結果在NCBI上進行同源性比較，菌 ^ NDC75017 與 Lactobacillus ρlantarum JDM1> Lactobacillus ρlantarum subsp. ρ lantarum ST-III, Lactobacillus ρ lantarum WCFSl 的親緣關系最近，同源性達 99. 8%
5(如圖3所示)。經IGS(intergenic spacer)序列測序，將IGS測序結果的785個堿基在 NCBI 上進行同源性比較，菌株 NDC 75017 與 Lactobacillus ρlantarum WCFSU Lactobacillus ρ lantarum subsp. plantarum ST-III 的親緣關系最近，同源性達 99. 5 % (如圖4所示)。結合菌株NDC 75017形態學觀察、生理生化試驗鑒定結果，確定菌株NDC 75017為乳桿菌屬(Lactobacillus)的一個新菌株，命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017。 本實施方式篩選所得植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017，通過高效液相色譜檢測對其進行產Y-氨基丁酸的能力的測試，結果為138mg/L。
權利要求
1. 一株具有高產Y-氨基丁酸能力的菌株，其特征在于它為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)NDC 75017，屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號， 保藏編號為CGMCC NO :5448，保藏日期為2011年11月08日。
全文摘要
一株具有高產γ-氨基丁酸能力的菌株，它涉及具有產γ-氨基丁酸能力的菌株。它為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017，屬于乳桿菌屬，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC NO5448，保藏日期為2011年11月08日。本發明中菌株NDC 75017具有高產γ-氨基丁酸的能力，經高效液相色譜檢測其產量高達138mg/L；γ-氨基丁酸是一種重要的抑制性神經遞質，具有很高的生理活性，有調節血壓、促使精神安定、促進腦部血流、營養神經細胞、增加生長激素分泌、改善更年期綜合癥等多種功效。
文檔編號C12R1/25GK102424807SQ20111043969
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者單藝, 周艷秋, 姜毓君, 張光輝, 楊士芹, 滿朝新, 王今雨, 董鑫悅, 薛玉清, 遲濤, 郎友, 郭穎 申請人:黑龍江省乳品工業技術開發中心