誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法與應用的制作方法

專利名稱：誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明為誘導干細胞分化的生物技術領域，特別涉及一種誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法與應用。
背景技術：
隨著人均壽命的延長，人口老齡化問題越來越嚴重，中老年男性雄激素部分缺乏癥(PADAM)患者越來越多。目前臨床上主要采用了外源性雄激素替代療法(ART)，目的是維持血清中睪酮的生理濃度，以替代內源性睪酮的生理功能。然而長期服用雄激素副作用較大，其一體內雄激素的靶細胞較多，長期服用外源雄激素治療容易會有毒副作用的發生，尤其是前列腺；其二不同個體間血清睪酮水平差異較大，病人需頻繁抽血檢查相關指標以調整用量；其三睪酮替代治療會破壞人體雄激素分泌晨高夜低的自然節律，還會抑制自身睪丸的雄激素分泌和生精功能。近年來隨著細胞移植療法的發展，人們把目光轉向了采用睪丸間質細胞(Leydig cells)的移植。由于睪丸間質細胞分泌的睪酮約占血漿睪酮的95%，人們試圖通過睪丸間質細胞的移植來治療睪酮分泌不足的問題，睪丸間質細胞移植可以升高患者血清睪酮水平。采用將分離提純的睪丸間質細胞微囊化的方法，既可以防止宿主對植入睪丸間質細胞的免疫排異反應，又保證微膠囊內睪丸間質細胞成活和睪酮分泌，微囊化后睪丸間質細胞能對人絨毛膜促性腺激素有良好的反應性，術后能在一定時間內保持患者血清睪酮水平。 以上研究說明睪丸間質細胞移植可能是一種有效的治療男性雄激素部分缺乏癥的方法，但目前尚無法解決移植細胞來源的問題。間充質干細胞具有多向分化能力，在一定的條件下，間充質干細胞能夠被誘導分化為多種細胞，包括成骨細胞，軟骨細胞，脂肪細胞，神經細胞和肝細胞等。向骨髓間充質干細胞中轉入類固醇生成因子-1 (SF-I)基因，能產生具有合成性腺激素和腎上腺類型類固醇激素能力的細胞。但骨髓間充質干細胞體外增殖能力、多向分化能力以及細胞穩定性都會隨著骨髓供體的年齡增長或疾病的影響逐漸不同程度的減弱甚至喪失；并且，骨髓間充質干細胞的分化效率較低，分泌的性腺激素量較低，需要尋找其他來源的干細胞和有效的誘導分化方法，可以更高效地將干細胞誘導分化為睪丸間質細胞。

發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種有效地誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法。本發明的另一目的在于提供所述誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞方法的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，包含以下步驟
(1)將SF-I基因(NM 139051，核苷酸序列171-1828，如SEQ ID NO. 1所示)插入腺病毒的穿梭質粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位點中，得到重組載體pAdtrack-CMV-SF-Ι ； 然后將重組載體pAdtrack-CMV-SF-Ι與腺病毒載體質粒pAdEasy-Ι共轉染大腸桿菌 BJ5183，得到攜帶SF-I基因的腺病毒質粒pAd-SF-Ι ；將腺病毒質粒pAd-SF-Ι單酶切線性化，轉染人胚腎細胞AD-293后得到腺病毒。(2)采用MOI = 200的量，將步驟(1)制備得到的腺病毒加入到誘導培養液中感染人臍帶間充質干細胞，將人臍帶間充質干細胞誘導分化為睪丸間質細胞；誘導培養液的組成為基礎培養基為DMEM/F12，含有體積百分比10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、 100 μ g/ml鏈霉素、500 μ M 二丁酰環磷酸腺苷(dbcAMP)。步驟(1)中所述的腺病毒質粒pAd-SF-Ι單酶切線性化是采用I^c I酶切進行線性化；步驟(1)中所述的轉染采用磷酸鈣共沉淀法進行；步驟O)中所述的人臍帶間充質干細胞通過如下方法制備得到從正常的足月新生兒的人臍帶中分離得到沃頓膠組織(Wharton’ s jelly)，將沃頓膠組織剪碎，用培養液培養，待從組織塊游離出來的細胞長至80 90%融合時，用胰酶消化游離出來的細胞，進行細胞傳代培養，得到人臍帶間充質干細胞；其中培養液為含有體積百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和1 μ g/ml兩性霉素B的LG-DMEM培養液。所述的人臍帶間充質干細胞的細胞表面抗原分子可用FACScan流式細胞儀檢測， 人臍帶間充質干細胞不表達造血標志分子⑶14、⑶19、⑶34、⑶45和HLA-DR，而強表達間充質干細胞表面特異性抗原⑶44、⑶73、⑶90和⑶105 ；流式細胞的鑒定條件為細胞的密度不低于 IO6 細胞/ml，采用 mouse anti IgGl/PE，mouse anti IgGl/FITC 作為同型對照；采用成脂分化、成骨分化和成軟骨分化鑒定干細胞的分化能力，成脂分化用油紅染色鑒定，成骨分化用堿性磷酸酶(ALP)染色及Von kossa染色鑒定，成軟骨分化用亞甲基藍染色鑒定。步驟O)中所述的誘導分化的條件采用胰酶將人臍帶間充質干細胞消化，離心收集，按5 X IO5個細胞/孔的密度接種到6孔板，在培養箱培養過夜讓細胞貼壁后，更換為誘導培養液，以MOI = 200的量將腺病毒加入到誘導培養液中，輕搖動培養板使病毒分布均勻，然后每兩天更換新鮮誘導培養液，誘導分化的時間為7天。上述的方法應用于誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞。一種睪丸間質細胞，通過上述方法得到。一種睪酮，通過上述睪丸間質細胞分泌得到。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(1)人臍帶沃頓膠組織(Wharton's jelly)來源的間充質干細胞取自免疫系統尚未發育完善胎兒的臍帶，具有增殖效率高，免疫原性低，在無免疫抑制的情況下不會出現免疫排斥。而骨髓間充質干細胞體外增殖能力、多向分化能力以及細胞穩定性都會隨著骨髓供體年衰或疾病的影響，逐漸不同程度的減弱甚至喪失。臍帶來源間充質干細胞比骨髓來源間充質干細胞更容易獲得，而且增殖能力更強，因此臍帶間充質干細胞可以成為干細胞治療中細胞移植的良好的細胞來源。(2)本發明所述的方法利用攜帶SF-I基因的腺病毒感染人臍帶間充質干細胞，并在DMEM-F12培養液中添加dbcAMP，整個分化時間短，僅需一周即可獲得睪丸間質細胞，具有更高的分化效率，能夠獲得更強睪酮分泌能力的睪丸間質細胞。本發明是一種高效地將間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，可為治療男性雄激素部分缺乏癥提供穩定的移植細胞的來源。


圖1是人臍帶間質干細胞原代與培養5代圖；圖(a)為原代細胞，圖(b)為培養5代的細胞，觀察倍數均為100倍。圖2是人臍帶間充質干細胞的流式細胞術鑒定圖。圖3是ALP染色鑒定人臍帶間充質干細胞的成骨分化能力圖；圖(a)為人臍帶間充質干細胞經過觀天成骨誘導分化后的堿性磷酸酶(ALP)染色圖，圖(b)為未分化的人臍帶間充質干細胞作為陰性對照。圖4是Von Kossa染色鑒定人臍帶間充質干細胞的成骨分化能力圖；圖(a)為人臍帶間充質干細胞經過觀天成骨誘導分化后的Von kossa染色圖，圖 (b)為未分化的人臍帶間充質干細胞作為陰性對照。圖5是油紅染色鑒定人臍帶間充質干細胞的成脂分化能力圖；圖(a)為人臍帶間充質干細胞經過21天成脂誘導分化后的油紅染色圖，圖(b)為未分化的人臍帶間充質干細胞作為陰性對照。圖6是亞甲基藍染色鑒定人臍帶間充質干細胞的軟骨分化能力圖；圖(a)為人臍帶間充質干細胞經過21天軟骨誘導分化后的亞甲基藍染色圖，圖 (b)為未分化的人臍帶間充質干細胞作為陰性對照。圖 7 是 PAdiTrack-CMV-EGFP 質粒圖。圖 8 是 pAdTrack-CMV-SF-Ι 質粒圖。圖 9 是 pAdEasy-Ι 質粒圖。圖10是攜帶SF-I基因的腺病毒的制備過程檢測圖；圖(a)為從小鼠睪丸間質瘤細胞中拷貝SF-I基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為回收的SF-I基因的PCR產物，泳道M為200bp DNA marker分子量標準；圖(b)為pAdtrack-CMV-SF-Ι陽性克隆篩選圖，泳道1 8為挑取的8個單克隆中所提取的質粒，泳道M為11Λ DNA marker分子量標準；圖(c)為采用EcoR I酶切驗證圖，泳道1 6分別為圖(b)中的1、2、4、5、7、8號質粒的EcoR I單酶切后產物，泳道M為11Λ DNA marker分子量標準；圖(d)為采用電穿孔法將pAdtrack-CMV-SF-Ι與pAdEasy-Ι共轉染大腸桿菌 BJ5183后的克隆篩選圖泳道1 4為所提取的質粒，泳道M為11Λ DNAmarker分子量標準。圖11是采用Real-time RT-PCR方法檢測將人臍帶間充質干細胞經過誘導分化為睪丸間質細胞的基因表達的圖。圖12是采用酶聯免疫吸附測定法檢測將人臍帶間充質干細胞經過誘導分化為睪丸間質細胞的睪酮分泌圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1人臍帶間充質干細胞的分離與擴增采用組織塊貼壁分離法。在無菌條件下取得臍帶，采用體積百分比0. 25%碘伏浸泡臍帶:3min消毒，采用生理鹽水沖洗除去臍帶表面及血管內的血塊，剪開臍帶，用鑷子撕下血管壁周圍的沃頓膠組織(Wharton's jelly)，將其剪成1. 5_2. 5mm3大小的組織塊，置于 24孔板內，加入800ml培養液(培養液含有體積百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和1 μ g/ml兩性霉素B的LG-DMEM培養液)，放于培養箱，37°C,5% CO2條件下靜置培養。 12-15天后，鏡檢可看見從貼壁的組織塊周圍游離出的大量長梭形細胞，這時可用PBS溶液 (貨號14190-144，GIBCO公司，以下所用PBS同)清洗去除組織塊，采用質量體積比0. 25% 的胰蛋白酶溶液消化貼壁細胞，200g離心收集細胞，進行傳代培養。等貼壁細胞長至90% 融合后，去除培養液，采用PBS溶液清洗，采用質量體積比0. 25%胰蛋白酶溶液消化，鏡檢等貼壁細胞收縮，胞間間隙變大時，加入含體積百分比10% FBS的LG-DMEM終止消化，輕輕吹打讓細胞懸浮，200g離心收集細胞，采用血球計數板計數，調整細胞密度為1 X IO5個細胞 /孔(6孔板)，放置于37°C，5% CO2培養箱培養，每兩天更換培養液。實施例2細胞形態學觀察將臍帶華爾通膠質組織塊接種至M孔板培養10天后，逐漸可見到少量細胞從組織塊中游離出來，貼壁生長，并不斷增殖(圖la)。在顯微鏡下觀察，可見細胞形態呈現均一的長梭形，為典型的成纖維細胞的形態，成平行排列生長或漩渦狀生長，隨著集落生長的不斷擴大而融合為單層貼壁細胞。常規傳代培養，長滿后可見細胞呈現漩渦狀(圖lb)。實施例3流式細胞術鑒定細胞表面抗原取正常培養的臍帶間充質干細胞，流式細胞術檢測細胞表面抗原的表達，包括 CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD19 和 HLA-DR。(1)細胞長至80 90%融合后，采用質量體積比0. 25%胰蛋白酶溶液消化，離心收集細胞，PBS溶液清洗2次，調整細胞懸液濃度到IO6細胞/ml。(2)加入2ml含體積百分比為2. 5% FBS的PBS溶液，吸打混勻細胞，200g離心。(3)所用抗體包括 CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD19 和 HLA-DR 的抗體， 非特異性背景以mouse anti IgGl/PE，mouse anti IgGl/FITC進行孵育作為對照。均按體積百分比1 50比例，用PBS溶液將抗體稀釋后，冰上避光孵育40min。(4)孵育完成后，離心去上清，PBS溶液重懸洗去抗體，重復1次。(5)最后用500 μ 1 PBS溶液重懸細胞，采用流式細胞儀檢測各組細胞的熒光值。利用流式細胞術分析臍帶間充質干細胞的細胞表面抗原的表達，在分離獲得的臍帶間充質干細胞中，⑶44、⑶73、⑶90、⑶105的表達為陽性，而⑶14、⑶19、⑶34、CD45及 HLA-DR的表達基本上為陰性(圖2)。這些表面抗原的表達結果與典型的間充質干細胞的表面抗原的表達是一致的。實施例4人臍帶間充質干細胞多向分化能力鑒定(1)檢測方法CN 102533659 A
取實施例1制備的傳代培養的臍帶間充質干細胞，按2X IO4細胞/孔的密度接種到M孔板內，等細胞長至60 70 %融合后，去除原來培養液，用PBS溶液清洗，加入成骨分化誘導培養液(基礎培養基為LG-DMEM，含體積百分比10% FBS, 0. 216g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，IOOnM地塞米松，IOmMβ -甘油磷酸鈉，0. 2mM L-抗壞血酸鹽)， 以后每3天更換一次成骨分化誘導培養液。誘導28天后，進行von-Kossa染色和堿性磷酸酶染色(ALP staining)的成骨分化鑒定。取實施例1制備的傳代的人臍帶間充質干細胞，按2X IO4細胞/孔的密度接種到 24孔板內，細胞長至60 70%融合后，去除原來培養液，PBS清洗，加入成脂分化誘導培養液(基礎培養基為LG-DMEM，含體積百分比10% FBS，2mML_谷氨酰胺，100U/ml青霉素， 100 μ g/ml鏈霉素，60μ M茚甲新，1 μ M地塞米松，0. 5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤IBMX， 5 μ g/ml胰島素)，以后每3天更換培養液一次，誘導21天后，進行Oil Red 0染色檢測。取實施例1制備的傳代的人臍帶間充質干細胞，經胰酶消化后，轉移Iml細胞懸液于15ml塑料離心管中，500g離心15分鐘，使其形成細胞微團結構，小心吸掉上層培養液， 加入2ml軟骨分化培養液(基礎培養基為LG-DMEM，含體積百分比10% FBS, 2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，質量體積比1 %胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS)，0. 1 μ M 地塞米松，50 μ g/mL 2-磷酸抗壞血酸，40 μ g/mL L-脯氨酸，100 μ g/mL丙酮酸鈉，10ng/mL 轉化生長因子β 1)，4天后首次換液，以后每隔2天換液，在21天后取出培養的細胞團塊。 進行固定、包埋、切片。將切片進行亞甲基藍染色，顯微鏡下觀察并拍照。(2)檢測結果間充質干細胞的一個重要的鑒定標準，就是間充質干細胞具有多向分化的能力。 人臍帶間充質干細胞在成骨分化誘導培養液中誘導觀天以后，通過von Kossa染色以及堿性磷酸酶(ALP)染色對分化的細胞進行成骨分化鑒定。圖3(a)中的棕紅色顯色顯示ALP 的染色結果，可見臍帶間充質干細胞經成骨誘導分化后，胞質中呈現了堿性磷酸酶活性。圖 4(a)中的黑色顆粒狀小結是礦質沉淀經Von Kossa染色的結果。而對照組則均呈陰性(圖 3(b)與圖 4(b))。臍帶間充質干細胞經成脂分化誘導培養液的誘導21天后，采用Oil Red O染色檢測脂滴。人臍帶間充質干細胞經過成脂誘導后，分化的細胞中出現細小的脂滴，呈現明顯的陽性(圖5(a))，而在未分化的細胞內，染色未見脂滴的存在(圖5(b))。在軟骨細胞分化誘導培養液中培養的細胞團約2天時與管壁分離形成球形結構， 并在培養過程中逐漸長大。培養21天后進行切片和亞甲基藍染色觀察，可見經誘導的人臍帶間充質干細胞呈現均一異染，細胞外基質呈淡藍色(圖6(a))，說明經誘導后細胞分泌的基質中含有大量的酸性蛋白多糖，而對照組未著色(圖6(b))。實施例5攜帶SF-I基因腺病毒的制備從小鼠睪丸間質瘤細胞(MLTC-1，中國科學院上海細胞所，上海，中國)中提取總 mRNA,通過反轉錄得到cDNA，用I^rimerSTAR高保真DNA聚合酶擴增SF-I基因(98°C，IOs ； 580C，20s ；72°C，1. 5min,反應30個循環)，回收SF-1的PCR產物，并將其磷酸化。擴增SF-1 基因的引物根據基因庫號NM 139051的序列設計如下正向PCR 引物5，-ATTCTCCTTCCGTTCAGCGGACG-3，；反向PCR 引物5，-GGCTGATGGAGGAAGGAATGGT-3，。
將擴增得到的SF-1基因插入腺病毒的穿梭質粒pAdtrack-CMV-EGFP內(見圖7，Stratagene公司，加利福尼亞州，美國)，具體步驟如下首先用內切酶MlI消化 pAdtrack-CMV-EGFP載體，然后將線性化的載體末端補平并去磷酸化。將制備好的SF-I片段和pAdtrack-CMV-EGFP載體按照3 1的比例進行連接構建pAdtrack-CMV-SF-Ι質粒 (見圖8)，連接產物轉化大腸桿菌toplO (Tiangen公司，北京，中國)，并挑取單克隆。由于 SF-I片段和載體內各有一個EcoR I酶切位點，用EcoR I消化單克隆，正向連接的質粒將被切成2. 8kb和8. Okb的DNA片段，反向連接的產物將被切成7. Ikb和3. 3kb的DNA片段，從而可以通過EcoR I酶切篩選得到陽性克隆，再通過測序進行驗證。將構建好的攜帶SF-I基因的穿梭質粒pAdtrack-CMV-SF-Ι與腺病毒載體質粒pAdEasy-Ι (見圖9，Stratagene公司，加利福尼亞州，美國)共轉染大腸桿菌 BJ5183 (Genmed公司，上海，中國)，兩質粒在BJ5183細菌內會發生重組，從而得到攜帶SF-I 基因的腺病毒質粒pAd-sf-1。將得到的攜帶SF-I基因的腺病毒質粒pAd-SF-Ι用I^c I酶切線性化后，采用磷酸鈣共沉淀法轉染人胚腎細胞(AD-293細胞，NIH，MD，美國)，可以產生腺病毒，腺病毒的產生可根據EGFP的綠色熒光來確定。當表達綠色熒光的AD-293細胞越來越多，并出現細胞變圓，核變大，細胞脫板懸浮的情況下，吸打收集AD-293細胞，PBS溶液清洗，離心，只保留 200 μ 1 PBS, -80°C和37°C反復凍融三次，使細胞破壁，釋放腺病毒，IOOOOg離心10分鐘，上清液含制備的第一代腺病毒。將得到的腺病毒直接用于感染AD-293細胞，進行再一輪的擴增，以提高腺病毒的滴度。將AD-293細胞按2 X IO4細胞/孔的密度接種到M孔板內，待細胞長至50%融合后，更換新鮮高糖培養液(培養液成分為10% (ν/ν)胎牛血清(FBQ，2mML-谷氨酰胺， 216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的HG-DMEM培養液)，將需要測定滴度的腺病毒懸液從KT1到10_12，按10倍的梯度進行稀釋，然后每個梯度取50 μ 1加到培養液中進行感染，每個梯度設3個重復孔。M小時后熒光顯微鏡下檢查綠色熒光的表達情況。如果在10_7梯度的孔中計數得到綠色細胞為50個，則病毒的滴度計為101(l(PFU/ml)。研究結果從小鼠睪丸間質瘤細胞中提取總mRNA，通過反轉錄得到cDNA，采用PCR 擴增SF-I基因，回收PCR產物(如圖10(a)所示)，跑膠結果顯示PCR產物符合目標基因大小。將制備好的SF-I片段和pAdtrack-CMV-EGFP載體按照一定的比例進行連接，將連接產物轉化toplO細菌，并挑取8個單克隆(如圖10 (b)所示)。用EcoR I酶切消化驗證連接產物(如圖10 (c)所示)，正向連接的質粒將被切成2. Skb和8. Okb的DNA片段，反向連接的產物將被切成7. Ikb和3. 3kb的DNA片段。從酶切結果可以判斷7號克隆為正向連接， 將7號克隆測序后發現該克隆DNA序列正確。將得到的pAdtrack-CMV-SF-Ι與pAdEasy-1 質粒采用電穿孔法共轉染BJ5183，挑選重組質粒，重組質粒大小約為44Kb (如圖10 (d)所示)，挑選2號質粒進行酶切轉化AD-293細胞，以產生攜帶SF-I基因的腺病毒。實施例6采用攜帶SF-I基因的腺病毒感染人臍帶間充質干細胞采用常規培養的實施例1制備得到的人臍帶間充質干細胞，酶消化，離心收集，按 5 X IO5的密度接種到6孔板內，在培養箱培養過夜讓細胞貼壁。第二天早上，更換為誘導培養液(基礎培養基為DMEM/F12，含體積百分10%的FBS，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，500 μ M dbcAMP)，以MOI = 200的量將腺病毒加入到培養液中，輕搖動培養板使病毒分布均勻。以后每兩天更換新鮮誘導培養液，誘導分化7天。
實施例7鑒定誘導分化的細胞的基因表達
采用攜帶SF-I基因的腺病毒感染人臍帶間充質干細胞后的第7天，用Real-time RT-PCR檢測類固醇合成相關基因的表達，包括P450SCC，17 β -HSD, LHR和3 β -HSD，引物及熒光探針如下
P450SCC-F 5' -GCGGGCTCCGGAAATTACTC-3’
P450SCC-R 5' -CTGGTAGATGGCATCAATGAATCG-3，
P450SCC-P 5' -(FAM)AGTGATGACCTGTTCCGCTTTGCCT(Eclipse)-3'
17 β -HSD-F 5，-TTAGTCAACAATGTCGGAATGCTTC-3，
17 β -HSD-R 5’ -ACTACGGAGGTGATGTTACAATGG-3 ’
17 β -HSD-P :5，-(FAM)CCCAAGCCATTTCCTGAACGCACCG(Eclipse)-3，
LHR-F :5，-CAATGTGAAAGCACAGTAAGGAAAG-3‘
LHR-R :5，-GGTGTCTTGGGTAAGCAGAAAC-3，
LHR-P :5，-(FAM)CCAGCCACTCAGTTCACTCTCAGCA(Eclipse)-3，
3 β -HSD-F 5’ -AAGCTAGTGTGCCAGTCTTCATC-3 ’
3 β -HSD-R 5’ -CGTTTTTCAGATTCCACCCGTTAG-3’
3 β -HSD-P :5，-(FAM)CGCCAGTACAGCCTTCTCAGCAAGC(Eclipse)-3，
反應擴增條件為
權利要求
1.一種誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于包含以下步驟(1)將核苷酸序列如SEQID N0:1所示的SF-I基因插入腺病毒的穿梭質粒 pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位點中，得到重組載體pAdtrack-CMV-SF-1 ；然后將重組載體pAdtrack-CMV-SF-Ι與腺病毒載體質粒pAdEasy-Ι共轉染大腸桿菌BJ5183，得到攜帶 SF-I基因的腺病毒質粒pAd-SF-Ι ；將腺病毒質粒pAd-SF-1單酶切線性化，轉染人胚腎細胞 AD-293后得到腺病毒；(2)采用MOI= 200的量，將步驟(1)制備得到的腺病毒加入到誘導培養液中感染人臍帶間充質干細胞，將人臍帶間充質干細胞誘導分化為睪丸間質細胞；誘導培養液的組成為 基礎培養基為DMEM/F12，含有體積百分比10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μ g/ml鏈霉素、500 μ M 二丁酰環磷酸腺苷。
2.根據權利要求1所述的誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于步驟(1)中所述的腺病毒質粒pAd-SF-Ι單酶切線性化是通過I^c I酶切進行線性化。
3.根據權利要求1所述的誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于步驟(1)中所述的轉染為通過磷酸鈣共沉淀法進行。
4.根據權利要求1所述的誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于步驟O)中所述的人臍帶間充質干細胞通過如下方法制備得到首先從正常的足月新生兒的人臍帶中分離得到沃頓膠組織，將沃頓膠組織剪碎，用培養液培養，待從組織塊游離出來的細胞長至80 90%融合時，用胰酶消化游離出來的細胞，進行細胞傳代培養， 得到人臍帶間充質干細胞；其中培養液為含有體積百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和1 μ g/ml兩性霉素B的LG-DMEM培養液。
5.根據權利要求1所述的誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于所述的人臍帶間充質干細胞的細胞表面抗原分子為通過FACScan流式細胞儀進行檢測，人臍帶間充質干細胞不表達造血標志分子⑶14、⑶19、⑶34、⑶45和HLA-DR，而強表達間充質干細胞表面特異性抗原⑶44、⑶73、⑶90和⑶105 ；流式細胞的鑒定條件為細胞的密度不低于106/ml，采用mouse anti IgGl/PE和mouse anti IgGl/FITC作為同型對照;所述的人臍帶間充質干細胞通過成骨分化，成脂和成軟骨分化鑒定干細胞的分化能力，成脂分化用油紅染色鑒定，成骨分化用堿性磷酸酶染色及Von kossa染色鑒定，成軟骨分化用亞甲基藍染色鑒定。
6.根據權利要求1所述的誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于步驟O)中所述誘導分化的條件為用胰酶將人臍帶間充質干細胞消化，離心收集， 按5X IO5細胞/孔的密度接種到6孔板，在培養箱培養過夜讓細胞貼壁，接著更換誘導培養液，以MOI = 200的量將腺病毒加入到誘導培養液中，輕搖動培養板使病毒分布均勻，然后每兩天更換新鮮誘導培養液；誘導分化7天。
7.權利要求1 6任一項所述的誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法的應用，其特征在于所述的誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法用于誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞。
8.一種睪丸間質細胞，通過權利要求1 6任一項所述的誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法得到。
9.一種睪酮，通過權利要求8所述的睪丸間質細胞分泌得到。
全文摘要
本發明公開了一種誘導人臍帶間充質干細胞分化為睪丸間質細胞的方法與應用。該方法包括如下步驟首先將小鼠類固醇生成因子-1基因克隆入腺病毒穿梭質粒pAdtrack-CMV-EGFP，得到重組載體pAdtrack-CMV-SF-1；然后將重組載體pAdtrack-CMV-SF-1與腺病毒載體質粒pAdEasy-1重組，得到攜帶SF-1基因的腺病毒質粒pAd-SF-1；將腺病毒質粒pAd-SF-1單酶切線性化，經人胚腎細胞AD-293包裝后得到腺病毒；再將該腺病毒加入到誘導培養液中感染人臍帶間充質干細胞，將人臍帶間充質干細胞誘導分化為睪丸間質細胞。經過本發明所述方法的誘導，人臍帶間充質干細胞在體外可以分化為睪丸間質細胞，需時僅為1周，從而為采用細胞替代或者基因方法治療睪酮缺乏癥提供了重要的細胞來源。
文檔編號C12N15/861GK102533659SQ20111043968
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年2月24日
發明者彭公峰, 魏星 申請人:暨南大學