專利名稱：一種芒屬植物Genic-SSR標記的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，更具體涉及一種芒屬植物GeniC-SSR標記的制備方法，同時還涉及一種芒屬植物Genic-SSR標記的用途。
背景技術：
芒屬植物屬于禾本科C4多年生草本植物，主要包括芒、五節芒、荻、南荻、奇崗，集中分布在亞洲東部及東南部。芒屬植物具有生命力強、光合利用效率高、抗逆性強等特點， 可用于制藥、造紙、水土保持和生態修復等。隨著人類對能源需求的不斷提高，全球能源儲量的不斷減少，芒屬植物作為一種潛在的能源植物越來越受到人們的高度關注。目前，在歐美實現廣泛種植的奇崗，年產可達每年10 40噸/公頃，被用于火力發電和燃料乙醇生產。隨著芒屬植物的遺傳多樣性研究、遺傳選育改良及遺傳圖譜繪制等工作的不斷深入，對芒屬植物分子標記的需求也越來越大。通過遺傳改良或重要基因的挖掘可有效提高芒屬能源植物的產量、抗逆性、廣適性。因此，挖掘芒屬植物的分子遺傳標記，對芒屬植物研究意義重大。簡單序列重復(simple sequence repeat, SSR)是一類l_6bp核苷酸基序構成的重復序列，廣泛分布于真核生物基因組的編碼區、非編碼區，SSR標記利用簡單序列重復的側翼保守序列設計引物，經過PCR擴增，根據條帶的大小來反映DNA序列的多態性。與其它分子標記如RFLP、AFLP, ISSR等相比，SSR標記具有多態性高、共顯性遺傳、重復性好、特異性強等特點，近年來成為遺傳多樣性研究、遺傳作圖、重要功能基因定位、分子輔助育種等領域應用最多的一種標記。傳統SSR標記的開發，一般使用文庫篩選法、磁珠富集法以及利用NCBI中已有EST數據庫信息挖掘等。其中，前兩種方法費時費力、開發成本高，第三種方法又依賴于現有NCBI中EST數據，對于EST測序少的物種其應用很有限。截止到2011年11月21日，在NCBI數據庫中可以檢索到的芒屬植物EST序列僅有5條，難以滿足開發EST-SSR標記的需要；而現有研究中，芒屬植物分子標記開發只局限在利用磁珠法或建立文庫挖掘，無法滿足現今芒屬植物研究需求，因此，通過轉錄組測序獲得大量EST序列信息，利用生物信息學挖掘SSR標記成為了一種高效的技術手段。
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種芒屬植物Genic-SSR標記的制備方法，方法易行，操作簡便，通過轉錄組測序獲得EST序列，挖掘SSR位點信息、設計引物，構建芒屬植物特異性Genic-SSR標記體系，為重要能源植物芒草的遺傳學研究及分子改良等奠定基礎。本發明的另一個目的是在于提供了一種芒屬植物Genic-SSR標記在芒屬植物遺傳多樣性研究中的應用，由于Genic-SSR標記的數量多且穩定性好，分析結果準確可靠。本發明通過以下技術方案實現一種芒屬植物Genic-SSR標記的制備方法，其步驟是1)、芒屬植物轉錄組序列的獲得
選取芒屬植物五個種(芒、五節芒、荻、南荻、奇崗)的幼嫩葉片，分別提取總RNA， 采用轉錄組測序方法(Illumina Solexa HiSeq2000)，得到轉錄組Reads，去除載體等RNA 序列污染，利用拼接軟件(如S0AP、iASSembler等)完成序列拼接，最終獲得芒屬植物五個種的非冗余Unigene-EST序列。所述的芒屬植物為芒、五節芒、荻、南荻、奇崗其中的任意一種。2)、芒屬植物ESR序列中SSR位點的鑒定采用SSR檢索軟件(如可選擇SSR hunter,BatchPrimer3. 0、MISA等)對上述步驟(1)得到的非冗余Unigene-EST序列進行SSR位點查找。檢索的限定條件為重復基序為2-6個堿基，且重復單元數依次大于6次，5次，4次，4次，3次；對于中間被< 50bp的間隔堿基打斷的復合型SSR計為一個SSR位點，從而獲得一系列含有SSR位點信息的Unigene 序列(請見表1)。表1測序產生的Unigene-EST統計信息
權利要求
1. 一種芒屬植物Genic-SSR標記的制備方法，其步驟是1)、芒屬植物轉錄組序列的獲得選取芒屬植物的幼嫩葉片，分別提取總RNA，采用轉錄組測序方法，得到轉錄組Reads， 去除載體RNA序列污染，利用拼接軟件完成序列拼接，最終獲得芒屬植物五個種的非冗余 Unigene-EST 序列；2)、芒屬植物ESR序列中SSR位點的鑒定采用SSR檢索軟件對上述步驟(1)得到的非冗余Unigene-EST序列進行SSR位點查找， 檢索的限定條件為重復基序為2-6個堿基，且重復單元數依次大于6次，5次，4次，4次，3 次；對于中間被< 50bp的間隔堿基打斷的復合型SSR計為一個SSR位點，獲得一系列含有 SSR位點信息的Unigene序列；3)、芒屬植物Genic-SSR引物的設計依據上述步驟( 得到的含有SSR位點的Unigene序列，采用引物設計軟件進行引物設計，獲得一系列Genic-SSR引物，引物設計參數主要包括引物長度為18_2^p，退火溫度為50-65°C，GC含量為45-65%，PCR擴增產物長度為90_300bp ；4)、芒屬植物Genic-SSR引物的擴增與篩選選取用于轉錄組測序的五個材料，用于檢測芒屬植物Genic-SSR標記的擴增狀況以及可轉移性。選取五個材料的幼葉50-100mg置于2. Omi離心管中，液氮冷卻后，用研磨棒迅速將樣品碾磨成粉末狀，基因組提取利用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒，利用質量體積比的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質量。采用上述步驟(3)合成的引物，以五個材料的基因組DNA進行擴增，以檢測引物設計的可靠性、擴增模式及其通用性。根據擴增結果，篩選可有效擴增的芒屬Genic-SSR引物。依據擴增結果，篩選出可以穩定擴增的Genic-SSR引物60對，具體如下 ms-It—1FCACCAGTGTTGGATGCTGAC RTGTTGTCTAGCCTCCCGTCT ms-It-2F:ACACTGTCCCAAATCCTTCC R:AAGAAATCTCACTCCTCTCCCC ms-It—3FCTCACAGGACAAGAGAGGGG R:GCATTCCAAAAGCATCCAGT ms-It—4FTGGAGCTGTGATCCTCTTCC RCGGCTCAAAAACCACAAAAT ms-It—5F:TCCAATCTAACCTCGTTGCC RTGAGGTCTCGAACTGCAAAA ms-It—6F:CACCGTCGAGTAGGGTGGR:CTGACGAGGGCACCAGAC ms-It-8F:ACCGGGGTCAGGAAGTAGAA RTGTTCGTCTACAACGCCACT ms-It—9F:CCAGCTTCTCCCACACCC R:CACCGAAGAGCCCCTCTC ms-It-10F :CTTGCAGTGCCTCCGTATG RCCTCATCGTCGACTTCAACA ms-It-12F:AGTGATGGAACTGCTGGAGG R CTTTGAGCGTCGATCCATTT ms-It-13F TGATGGTGTTGGTGATTTGG R :ATTTGCTGTTGCTGCTGTTG ms-It-18FTGGCTCCCACTATCACTTCC RCTTGCTGCAACAGATGGAAA ms-It-19F:CATGGACTCGGATCAGGACT RCGAGGAGGAACTTGGTGGAT ms-It-20F:GCAGGTTGCGATCCTAAGAC R:GATCACCTGAAAAGGCAAGC ms-It-21FCCAAGCTCTAAACAGGCTCG R:GATGGGAGTTTACGTGGGG ms-It-23FCAACCTCCTCTCCCTGATGA R:AGACGGAGATGAATCGTTGG ms-It-24F CATGGTTGAGTTCTACGCCC R:AGAAGAGGATGGTGGGGAAG ms-It-26F:GGTCCATGACGAAGTCGAAG RCCCGGAGTTCTACTGCTACG ms-It-27F :AAACATGCGTGCTTTGACTGR TTGCCTCTTTCGTGCTACCT ms-It-28F:ACCACCAAAACCAAACGAAG RTAGAGGGGAAGAAGGGGAAG ms-It-29F:GGTCTAATCGCCCCGTAGAT RCCCTTTACTCCCGAGGAGAC mf-ts-1F CAGATGAGACCAGCAGTGGA R :ACGCCAGTCAACCATCTCTT mf-ts-2F:ACAGGGAGAGGGGAGAAGAA RTCCATCGTTTTCTGGTGTGA mf-ts-4F:GTGCTCTTCCGCCTGAACTA R TCCTCCTCCTCACCATCATC mf-ts-5FCAAATGGTCGTCCCAAAGAC R:AGAGGAAGAATGGGTGGGAG mf-ts-6F:ATGGCTACCACTCAGTTCGC R :GTCGTCGTCCTCTTCAAGG mf-ts-9F:ACCGTCCATCCATCTGTAGC R:GCTTCCTGGACGACTCTGTT mf-ts-10F CTCGAGCGAGCTGTTCATTT RTGAAGATACCGTGGAGGAGG mf-ts-11F CTTGTCCCTCTTCACCAAGC RCCTTTCTTCCAGTGGCTCAA mf-ts-13FCCAGAGGGATAGGAGGAGGA RCACGTGTAGCAGGTCCTGAA mf-ts-14F:GCTCTCCGAGGTCGTGTC R CCTGTCTGAGGATGGTCCC mf-ts-15F:ACGTCCTTCTTTCTGCTGGARCGTCTCTGCTCCTGGCTTTA mf-ts-16F :GGAACGGGGAAACCTCTG RTCTCTTCTCTTCTCCGTCGC mf-ts-17F:AAAGGGTACGGCACTGAGGT R :GCAACGTGAACTCTGTCTGC mf-ts-18F:GAGGGGATCTAGATGAGGGC R:CCAGCTCGTTTCTTCCTCAG mf-ts-19FCGTCTGCGACACAAGAACAT R :ATGATGTTGCTGGCCTTGAT mf-ts-21F:GGACACCTACACGGTCACCT R:CTGCTGGCTGGTGGTGTT mf-ts-22F CATGGTTGAGTTCTACGCCC R:AGAAGAGGATGGTGGGGAAG mf-ts-23FCGCACAAAAGAATGCATCAC R:GGAACGCCACTTTCTAGCAC mf-ts-24F :ACCAGCACCGTCATCATCAG R :GAACAGGTTGCCGGTGTATC mf-ts-25FCTACGACCGCTGCTGCTAGT RTCTCCATACTGCTCTGGGCT mf-ts-28FTTCCGATCTCAAGGACCAAC R :AACCCTCCTGTCCATGATGA mf-ts-29FCTGCAAGTTTCTTTGCCCTC RTCTGAAAAGTGGTGGTGTGC mg-1F:ATCAGAGAGAGGCACCTGGA R:GAGTGAGGAGATGACCCGAC mg-2F:AGAAACGTGAAACCTGCTGAAR:AAGCTGACAGCACAACAACG mg-5F:GGCGGATAATCAGCAAGTGT R:GAAGAGTGGCTGGGTTGAAG mg-6F:GGAGAGTGAGAGCAGGGTTG R :GTTGCCACAAATCTGGCTG mg-7F:ACCAAGACCAAATCTGCCAC R :ACACAGCTACATCGGGTTCC mg-8F:AACTCTTTTACAACGTCAATTTGC RCAGCCTTTGGTTAGAGCACC mg-17F:AATAGGAGGCTGGCTGGTTT R:GCAATTTGCTCCTGCACATA mg-18F :GCAGCAGAGAGGAGAGGAGA R CCCGTCGTGTTGATGTACTG mg-19F :TCTCCTCCAGGTTCACCATC R:AGGTGCAAATCATCTACCGC mg-21F:ACAGGAACGGAGGAACTTGA R:GATACGCCGTCGCTGAAG mg-22F:GATCGCTCCTTCCATTGTGT R:AATCTCAAGTCCTCCTCCCC mg-23F TGAGATTCCTCCCTCCATTG R:GCGCTCTACTCCAGGAAAAA mg-25F:GCCCCTCAGATGGTTGAATA RTGTGGTACATCTCCCTGCAA mg-26F :GTCACTCTCCCCTCCCATTC RTGCACCCTTTACGAACTCCT mg-27FCCATGGCTAAGCCTCACTTCR:GCGCACACACACACACTACT mg-29F :AGCGTAAGAGGGAGGATGGT R :GGAGCTCCTCCTCGGTGT mg-30FTTGACGGTGACGATGAGGTA RTCAAATCTCATCAGTTCCCAAA所述的芒屬植物為芒、五節芒、荻、南荻、奇崗其中的任意一種。
2.權利要求1所述的一種芒屬植物Genic-SSR標記在芒屬植物遺傳多樣性分析中的應用；所述的芒屬植物為芒、五節芒、荻、南荻、奇崗、河八王。
全文摘要
本發明公開了一種芒屬植物Genic-SSR標記的制備方法及應用，其步驟是A、芒屬植物轉錄組序列的獲得選取芒屬植物的幼嫩葉片，分別提取總RNA，得到轉錄組Reads，去除載體RNA序列污染，拼接，獲得芒屬植物轉錄組序列；B、芒屬植物ESR序列中SSR位點的鑒定采用SSR檢索軟件對得到的非冗余Unigene-EST序列進行SSR位點查找，重復基序為2-6個堿基，獲得一系列含有SSR位點信息的Unigene序列；C、芒屬植物Genic-SSR引物的設計依據得到的含有SSR位點的Unigene序列，采用引物設計軟件進行引物設計，獲得一系列Genic-SSR引物。方法簡單，效率高，操作簡便，獲得的標記數量巨大，通過轉錄組測序獲得EST序列，為重要能源植物芒草的遺傳學研究及分子改良等奠定基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102424826SQ20111044396
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者余作平, 刁英, 游永寧, 胡中立, 胡小虎, 鄭興飛 申請人:湖北光芒能源植物有限公司