專利名稱：一種克隆山羊pid1基因編碼區全序列的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其是一種克隆山羊磷酸酪氨酸互作結構域I (Phosphotyrosine interactiondomain containing 1，PID1)基因編碼區全序列的方法。
背景技術：
磷酸酪氨酸互作結構域(PIDl)是以抑制性消減雜交(Suppressionsubtractivehybridization, SSH)技術篩選肥胖與正常人腹膜后脂肪組織中的差異表達基因，研究人員曾按其工作単位和姓氏的首個英文字母將該基因命名為NYGGF4基因，提交NCBI后，根據該基因的結構特征被國際統一命名為PIDl基因。該基因有ー個PTB(磷酸酪氨酸作用位點)結構域，與信號蛋白Shc上的PTB結構域相似，參與生長因子刺激下細胞增 殖等下游效應。PIDl基因在3T3-L1脂肪細胞中過表達能夠顯著下調脂肪細胞胰島素信號途徑中與胞膜葡萄糖轉運密切相關的基因-葡萄糖轉運子4 (GLUT4)的表達，從而推測PIDl基因可能參與了多種組織的胰島素敏感性調節，而脂肪細胞胰島素敏感性的高低與脂肪沉積密切相關，研究發現PIDl基因過表達通過下調胰島素刺激的GLUT4的轉位而減少脂肪細胞的葡萄糖攝取率，其機制與抑制PI3K/AKT信號通路、減少GLUT4向胞膜轉位有夫，推斷它的過量表達可能促進了脂肪細胞的増殖，并抑制了葡萄糖的轉換，進而影響機體的胰島素敏感性，導致脂肪的沉積，山羊肌內脂肪的含量對羊肉品質具有直接影響，研究該基因的作用和功能將對動物遺傳改良和培育新品系提供理論基礎。RT-PCR克隆是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)以及分子克隆相結合的技木。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的基因片段，將合成的目的基因片段克隆到載體細胞基因中，然后用質粒PCR產物測序。此技術利用PCR技術能在體外進行有效的基因擴增，而不需要內切酶消化和連接酶處理，可利用這ー技術很快獲得其他依靠限制性內切酶消化的方法難于得到的PCR產物；克隆載體PCR測序能克服PCR產物測序引物近端的十幾個堿基無法測序獲得的缺點。與RACE (cNDA末端快速擴增)技術相比較而言，目的基因片段的長度明確，成本低，工作量小。該技術成功的關鍵是PCR引物的設計，在起始密碼子的上游設計上游引物，在終止密碼子的下游設計下游引物，使得PCR產物包含完整的基因編碼區全序列。分段PCR克隆法將目的基因分成幾段來分別克隆，然后做亞克隆測序拼接。成本高，工作量大耗吋，ー個基因分成幾段就需要做幾次克隆，然后再做序列接拼。現有技術中采用RACE (cNDA末端快速擴增)技術是基于PCR技術基礎上由已知的一段cDNA片段，通過往兩端延伸擴增從而獲得完整的3’端和5’端的方法。I、目的PCR產物的基因片段長度不明確。2、試驗成本高。3、工作量大，實驗技術要求高。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種簡單、快捷的獲取山羊PIDl基因的完整編碼區序列的方法，填補了該基因在山羊上的空白。
本發明采用以下技術方案一種克隆山羊PIDl基因編碼區全序列的方法，包括以下步驟Al、提取山羊腹肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA ；A2、引物的設計及PCR反應以哺乳動物該基因的保守區作為模板在起始密碼子上游和終止密碼子的下游設計保守引物；設計的引物為上游引物P 1:5' -CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3'下游引物P 2:5' -TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3'用cDNA為模板進行梯度PCR操作確定普通PCR的擴增條件，溫度為范圍在50°C到65°C之間的8個溫度點.PCR反應體系為IOul體系(5 μ L的2 XMaster Mix Tap,上下游引物各O. 5 μ L，2 μ L的cDNA，2 μ L的ddH20.)，反應條件為95°C預變性5min，38個循環(94°C, 30s ；61°C,40s ;72°C，40s)，最后 72°C 7min ；A3、PCR產物的回收和純化；A4、克隆。所述的方法，所述步驟Al包括以下步驟用液氮將眼肌磨成粉末裝入I. 5mE管，放入_80°C的超低溫冰箱中備用；取新的I. 5ml的EP管，加入Iml的Trizol液，然后加入約80mg的眼肌組織粉末，用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置5分鐘；加入O. 2ml的氯仿，蓋緊離心管，4°C下13000rpm離心8分鐘，取上層水相于一新的離心管，加入等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘；棄去上清液,加入Iml的75 %こ醇混勻，4°C下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的こ醇，加入30ul到IOOul的DEPC水；瓊脂糖凝膠檢測RNA的質量，將效果好的RNA立即反轉錄成cDNA。所述的方法，所述步驟A3包括以下步驟a.將60μ I PCR產物于I %的瓊脂糖凝膠中電泳。用干凈的手木刀割下所要回收的DNA的瓊脂塊，放入I. 5ml離心管稱取重量。b.按每O. I克膠塊加入300 μ I溶膠液；于50°C水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉EP管，以確定膠塊充分溶解；c.溶解后的凝膠溶液加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12000r/min離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；d.向吸附柱加入700 μ I漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱
重新放入收集管中；e.向吸附柱加入500 μ I漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液；將吸附柱徹底晾干，以防止殘留漂洗液影響下一歩的試驗；f.將吸附柱置于另ー個干凈的EP管中，向吸附膜中間位置懸空加入30uL洗脫液，室溫放置2min, 12000r/min離心Imin收集DNA溶液；g.取2uL回收產物于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測回收效率和純度；所述的方法，所述步驟A3包括以下步驟(I)目的片段與載體連接將回收、檢測后的目的片段與PMD-18T載體連接，根據TaKaRa的pMD_18T載體試劑盒使用說明書，操作連接體系為
PMD-18T Vector0.5 μ L
純化回后的PCR片段5UL
Solution I4.5 μ L
Total10.0 μ L以上操作在冰上進行，稍離心混勻，16°C在PCR儀中連接12h，_20°C保存備用；(2)大腸桿菌感受態細胞的制備a.從無抗生素平板上挑取新鮮的E. coli JM109單菌落結種于10ml LB液體培養基中，37°C，250r/min搖菌培養過夜；b.取2ml活化過夜的菌液接種于含50ml LB液體培養基的錐形瓶中，37°C，250r/min搖菌培養至0D_ = 0. 3 ；c.將細菌培養物無菌操作下轉移至50ml EP管中，冰浴lOmin，然后4°C 4000r/min離心IOmin,棄上清,收集菌體沉淀；d.加入20ml冰預冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次4°C 4000r/min離心lOmin，棄上清，收集菌體沉淀；e.加入2ml冰預冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置過夜；f.按200ul/份加入15%冰預冷甘油，混勻分裝，_70°C凍存備用；(3)連接產物的轉化a.吸取IOul連接物介入冰預冷的I. 5ml EP管中，再取出_70°C凍存的E. coli感受態細胞置于冰上融化，輕彈管壁使細胞混勻；b.小心吸取100 μ I細胞懸液加入到含有連接產物的EP管中，輕彈管壁，混勻后冰浴 30min ；c. 42°C水浴熱激90sec,立即冰浴3min ；d.加入500 μ I預熱至37°C的LB液體培養基，37°C，250r/min搖菌培養45min ；e.吸取200 μ I菌液,用滅菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固體培養基平板上,室溫溫浴至完全吸收，37°C培養箱中倒置過夜培養；(4)陽性菌落的篩選隨機挑選菌落接種于LB氨節培養液中，培養至中等濃度后以菌液為模板，用于相應基因PCR擴增相同的引物及反應條件進行擴増。擴增產物用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定為所克隆基因后，取20 μ I交送北京六合華大生物工程技術有限公司完成測序。該技術相比較分段克隆和RACE技術而言，目的PCR片段的長短大致明確，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的優勢。
圖1是山羊mi基因的PCR產物電泳圖。圖2是PIDl基因mRNA在不同組織中的表達情況；y軸表示的是相對表達量，x軸表示的是組織。圖3是western bloting檢測PIDl基因推測編碼的蛋白在不同組織中的表達情況；1_8表示的是心、肝、脾、肺、腎、腿肌、腹肌和背最長肌。
具體實施例方式以下結合具體實施 例，對本發明進行詳細說明。實施例I步驟ー提取山羊眼肌組織中的總RNA(核糖核酸)，然后將總RNA反轉錄成cDNA ；I.組織的采集選取周歲的天府肉羊頸動脈放血后立即取約Ig腹肌放入液氮罐中用于提取總RNA。2. RNA的制備及cDNA的合成在實驗室用液氮將腹肌磨成粉末裝入I. 5ml的EP管。放入零下80°C的超低溫冰箱中備用。取新的I. 5ml的EP管，加入Iml的Trizol液，然后加入約80mg的眼肌組織粉末。
用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置5分鐘。4°C下13000rpm離心3分鐘將液體用移液槍轉運到另ー個新的I. 5ml的EP管，并往這個新EP管中加入O. 2ml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒，然后4°C下13000rpm離心8分鐘。離心結束以后用移液槍將這個EP管中的上層水相約移入一新的離心管,加入等體積的異丙醇,室溫放置10分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘。棄去上清液，加入Iml的75%こ醇混勻，4°C下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的こ醇，注意不要把RNA吸掉，然后根據RNA量的多少。加入適量的DEPC水。用I. 5%瓊脂糖電泳法檢測RNA的質量。將效果好的RNA立即反轉錄成cDNA。步驟ニ引物的設計及PCR反應；依據已發表的牛、豬、人、小鼠等的PIDl基因的序列設計保守引物，上游引物在起始密碼子的上游區域設計，下游引物在終止密碼子的下游區域設計。設計的引物為上游引物Pl :5' -CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3' (SEQIDN0:1)下游引物P2:5' -TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3' (SEQID NO 2)用cDNA為模板進行PCR操作擴增PIDl基因，退火溫度為61 °C。PCR反應體系為 IOul 體系(5μ L 的 2XMaster Mix Tap，上下游引物各(λ 5 μ L，2 μ L 的 cDNA，2 μ L 的ddH20.)，反應條件為 95°C 預變性 5min，38 個循環(94 °C, 30 s ；61°C,40s ;72C，40s)，最后72°C 7min。反應結束后將約有896bp的PCR產物收集到ー個EP管中并切膠回收(圖1)，將回收的基因片段克隆到質粒載體中，然后挑取陽性菌進行PCR反應，產物送測序公司測序。步驟三PCR產物的回收和純化；PCR產物OMEGA公司純化回收試劑盒Gel Extraction Mini Kit回收PCR產物，具體操作步驟為a.將60 μ I PCR產物于I %的瓊脂糖凝膠中電泳。用干凈的手木刀割下所要回收的DNA的瓊脂塊，放入I. 5ml離心管稱取重量。在判定DNA片斷位置吋，要盡可能使用長波及外線，而且還要注意在紫外光下照射的時間應盡可能的短。b.按每O. I克膠塊加入200 μ I溶膠液。于50°C水浴放置，并不斷溫和地上下翻
轉EP管，到凝膠完全凝固為止。c.溶解后的凝膠加入帶有吸附柱的收集管中，12000r/min離心30sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。 d.向吸附柱加入700 μ I漂洗液PW(含無水こ醇),12000r/min離心30sec,倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。e.向吸附柱加入500 μ I漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱徹底晾干，以防止殘留漂洗液影響下一歩的試驗。f.將吸附柱置于另ー個干凈的EP管中，向吸附膜中間位置懸空加入30uL洗脫液，室溫放置2min，12000r/min離心Imin收集DNA溶液。g.取2uL回收產物于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測回收效率和純度。步驟四克隆；(I)目的片段與載體連接將回收、檢測后的目的片段與PMD-18T載體連接，根據TaKaRa的pMD_18T載體試
劑盒使用說明書，操作連接體系為
PMD-18T Vector0.5 μ L
純化回后的PCR片段5UL
Solution I4.5 μ L
Total10.0 μ L以上操作在冰上進行，稍離心混勻，16°C在PCR儀中連接12h，_20°C保存備用。(2)大腸桿菌感受態細胞的制備(CaCl2法)a.從無抗生素平板上挑取新鮮的E. coli JM109單菌落結種于10ml LB液體培養基中，37°C，250r/min搖菌培養過夜。b.取2ml活化過夜的菌液接種于含50ml LB液體培養基的錐形瓶中，37°C，250r/min搖菌培養至OD600 = 0 . 3。c.將細菌培養物無菌操作下轉移至50ml EP管中，冰浴lOmin,然后4°C 4000r/min離心lOmin,棄上清,收集菌體沉淀。d.加入20ml冰預冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次4で4000r/min離心IOmin,棄上清,收集菌體沉淀。e.加入2ml冰預冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置過夜。f.按200ul/份加入15%冰預冷甘油，混勻分裝，_70°C凍存備用。(3)連接產物的轉化a.吸取IOul連接物介入冰預冷的I. 5ml EP管中，再取出_70°C凍存的E. coli感受態細胞置于冰上融化，輕彈管壁使細胞混勻。
b.小心吸取100 μ I細胞懸液加入到含有連接產物的EP管中，輕彈管壁，混勻后冰浴 30min。c. 42°C水浴熱激90sec,立即冰浴3min。d.加入500 μ I預熱至37°C的LB液體培養基，37°C，250r/min搖菌培養45min。e.吸取200 μ I菌液,用滅菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固體培養基平板上,室溫溫浴至完全吸收，37°C培養箱中倒置過夜培養。(4)陽性菌落的篩選隨機挑選菌落接種于LB氨芐培養液中，培養至中等濃度后以菌液為模板，用于相應基因PCR擴增相同的引物及反應條件進行擴増。擴增產物用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定為所克隆基因后，取20 μ I交送寶生物工程技術有限公司完成測序。步驟五檢驗試驗的正確性；將測序結果在NCBI上運用blast在線比對軟件以驗證序列的正確性和該方法的可靠性。結果表明該方法獲得的山羊PIDl基因完整編碼區序列的核苷酸序列與其他已知的9種哺乳動物的同源性為76% 97%。表明該方法能達到獲得山羊PIDl基因的完整編碼區序列的目的。獲得的山羊PIDl基因序列為(SEQID NO 3)山羊PIDl基因預測編碼的氨基酸序列為(SEQ ID NO 4)本技術簡單、快捷的獲取了山羊PIDl基因的完整編碼區序列，填補了該基因在山羊上的空白。該技術相比較分段克隆和RACE技術而言，目的PCR片段的長短大致明確，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的優勢。實施例2實時熒光定量PCR(I)PIDl和GAPDH基因實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序如下表2-5PCR 反應體系 Table. 2_5Reaction system of PCR
上游引物0.5 μ I
下游引物0.5 μ I
SYBR Premix Ex Taq (2 X )12.5 μ I
模版 cDNA2 μ I (IdH2O9.5 μ I Total25 μ I
PIDl和GAPDH基因實時熒光定量PCR的反應條件95°C預變性IOsec — 45個循環(95°C變性 IOs — 61°C退火 30s)。反應體系在伯樂iq5熒光定量PCR儀上進行。在PCR反應過程中，設定無cDNA樣品的空白管作為陰性對照。
(2)標準曲線的繪制取103、104、105、106、107、108、109、101Q的標準品各I μ I加入和上面完全相同的反
應體系中，在同樣的反應條件下進行PCR擴增。根據熒光定量PCR儀繪制的PCR動力學曲線，以樣品拷貝數的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標，分別擬合PID1、GAPDH基因的PCR標準曲線。(3) PIDl基因mRNA表達水平計算利用熒光定量PCR分別檢測出目的基因MPIDl和管家基因GAPDH的Ct值后，可計算出目的基因與管家基因的相對表達量。相同組織不同時間的天府肉羊PIDl基因的相對表達設成年羊的表達量為對照，相同時間不同組織的天府肉羊PIDl基因的相對表達設各年齡階段背最長肌的表達量為對照。不同品種羊PIDl基因的相對表達設天府肉羊的表達量為對照。計算公式如下
權利要求
1.一種克隆山羊PIDl基因編碼區全序列的方法，其特征在于，包括以下步驟Al、從健康的山羊腹肌組織中提取總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA ；A2、引物的設計及PCR反應以哺乳動物該基因的保守區作為模板在起始密碼子上游和終止密碼子的下游設計保守引物；設計的引物為上游引物 PI : 5' -CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3'下游引物 P2 :5' -TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3'用cDNA為模板進行梯度PCR，優化PIDl基因普通PCR的條件，溫度為范圍在50°C到 65°C之間的8個溫度點。PCR反應體系為IOul體系(5 μ L的2 XMaster Mix Tap，上下游引物各O. 5 μ L，2 μ L的cDNA, 2 μ L的ddH20.)，反應條件為95°C預變性5min, 38個循環(94°C， 30s ；61°C,40s ;72°C，40s)，最后 72°C 7min ；A3、PCR產物的回收和純化；A4、克隆。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟Al包括以下步驟用液氮將腹肌磨成粉末裝入I. 5ml的EP管，放入_80°C的超低溫冰箱中備用；取新的I. 5ml的EP管， 加入Iml的Trizol液，然后加入約SOmg的眼肌組織粉末，用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后冰上放置5分鐘；加入O. 2ml的氯仿，蓋緊離心管，4°C下13000rpm離心8分鐘， 取上層水相于一新的離心管，加入等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘，4°C下12000rpm離心 10分鐘；棄去上清液，加入Iml的75%乙醇漂洗RNA中混合的雜質，4°C下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液,瞬時尚心后小心倒置EP管用移液槍引導管內液體流出，盡量吸干，加入適量的DEPC水；瓊脂糖凝膠檢測RNA的質量，將效果好的RNA立即反轉錄成cDNA。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟A3包括以下步驟a.將60μ1PCR產物于I %的瓊脂糖凝膠中電泳。用干凈的手術刀割下所要回收的 DNA的瓊脂塊，放入I. 5ml離心管稱取重量。b.按每O.I克膠塊加入200 μ I溶膠液；于50°C水浴放置，并不斷溫和地上下翻轉EP 管，凝膠完全溶解為止；c.溶解后的凝膠溶液全部加入到有吸附柱的收集管中，12000r/min離心30sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；d.向吸附柱加入700μ I漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；e.向吸附柱加入500μ I漂洗液PW，12000r/min離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液；將吸附柱徹底晾干，以防止殘留漂洗液影響下一步的試驗；f.將吸附柱置于另一個干凈的EP管中，向吸附膜中間位置懸空加入30uL洗脫液，室溫放置2min，12000r/min離心Imin收集DNA溶液；g.取2uL回收產物于I.O %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測回收效率和純度。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟A3包括以下步驟(I)目的片段與載體連接將回收、檢測后的目的片段與PMD-18T載體連接，根據TaKaRa的pMD_18T載體試劑盒使用說明書，操作連接體系為PMD-18T Vector0.5 μ L純化回后的PCR片段5ULSolution I4.5 μ LTotal10.0 μ L 以上操作在冰上進行，稍離心混勻，16°C 在PCR儀中連接12h，_20°C保存備用； (2)大腸桿菌感受態細胞的制備 a.從無抗生素平板上挑取新鮮的E.coli JM109單菌落結種于IOml LB液體培養基中，370C，250r/min搖菌培養過夜； b.取2ml活化過夜的菌液接種于含50mlLB液體培養基的錐形瓶中，37°C，250r/min搖菌培養至OD600 = O. 3 ； c.將細菌培養物無菌操作下轉移至50mlEP管中，冰浴lOmin，然后4°C 4000r/min離心IOmin,棄上清,收集菌體沉淀； d.加入20ml冰預冷的0.lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次40C 4000r/min離心IOmin,棄上清,收集菌體沉淀； e.加入2ml冰預冷的0.lmol/L CaCl2溶液重懸細胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置過夜； f.按200ul/份加入15%冰預冷甘油，混勻分裝，_70°C凍存備用； (3)連接產物的轉化 a.吸取IOul連接物介入冰預冷的I.5ml EP管中，再取出_70°C凍存的E. coli感受態細胞置于冰上融化，輕彈管壁使細胞混勻； b.小心吸取100μ I細胞懸液加入到含有連接產物的EP管中，輕彈管壁，混勻后冰浴30min ； c.42°C水浴熱激90sec,立即冰浴3min ； d.加入500μ I預熱至37°C的LB液體培養基，37°C，250r/min搖菌培養45min ； e.吸取200μ I菌液,用滅菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固體培養基平板上,室溫溫浴至完全吸收，37°C培養箱中倒置過夜培養； (4)陽性菌落的篩選 隨機挑選菌落接種于LB氨節培養液中，培養至中等濃度后以菌液為模板，用于相應基因PCR擴增相同的引物及反應條件進行擴增。擴增產物用I. O %瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定為所克隆基因后，取20 μ I交送北京六合華大工程技術有限公司完成測序。
全文摘要
本發明公開了一種克隆山羊PID1基因編碼區全序列的方法，包括以下步驟A1、提取山羊背最長肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA；A2、引物的設計及PCR反應以哺乳動物該基因的保守區作為模板在起始密碼子上游和終止密碼子的下游設計保守引物上游引物P15′-CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3′下游引物P25′-TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3′。A3、PCR產物的回收和純化；A4、克隆。提供一種簡單、快捷的獲取山羊PID1基因的完整編碼區序列的方法，填補了該基因在山羊上的空白，為進一步研究山羊的該基因奠定了基礎。
文檔編號C12N15/70GK102618550SQ20111044545
公開日2012年8月1日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者萬璐, 徐剛毅, 徐洪剛, 汪代華, 鄭程莉, 馬基斯 申請人:四川農業大學