平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因和克隆MhSERK4基因cDNA全長序列的方法
【專利摘要】本發明公開了平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因和克隆MhSERK4基因cDNA全長序列的方法，蘋果屬平邑甜茶無融合生殖MhSERK4基因，核酸序列為SEQIDNO:1。基因的編碼區序列為SEQIDNO:2。基因的編碼區序列編碼氨基酸為：SEQIDNO:3。本方法包括：SERK4基因片段的分離；提取平邑甜茶子房的總RNA反轉錄成cDNA；引物設計及PCR反應；PCR產物的回收和純化；克隆、測序。在植物的生長發育過程中SERK基因及其家族成員在小孢子發育、體胚發生、激素感應、無融合生殖中都具有一定的功能；對生產上利用無融合生殖固定雜種優勢，通過基因工程手段培育優良品種具有重要的實踐意義。
【專利說明】平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因和克隆MhSERK4基因cDNA全長序列的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體涉及蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因和克隆MhSERK4基因cDNA全長序列的方法。
【背景技術】
[0002]無融合生殖是發育生物學領域的重要科學問題。與有性生殖獲得的種子相比，無融合生殖后代的遺傳背景與母本一致，不發生性狀分離，在植物育種中，無融合生殖可以固定雜種優勢；對于一些無性繁殖的植物，無融合生殖產生無性種子可以克服無性繁殖的不便，避免長期營養繁殖造成的親本退化；因此，有關植物生殖機理方面的研究成為生命科學研究領域的熱點之一。
[0003]平邑甜茶(Malushupehensis Rehd.var.pingyiensis Jiang)是薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)湖北海棠(Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.)的一個變種，也是典型的無融合生殖型三倍體植物。主產于山東平邑縣蒙山白云巖和惡峪一帶，小葉呈紅色，似茶葉故稱平邑甜茶。平邑甜茶是蘋果的優良砧木之一，也是我國特有的植物資源，其耐澇性和耐鹽性較強，在生產上具有重要的應用價值，同時平邑甜茶具有高度的無融合生殖能力，與西府海棠、山定子等其它蘋果砧木相比，其實生苗整齊一致，個體差異小，遺傳穩定，因此，平邑甜茶是無融合生殖型矮化砧木育種的重要母本材料。多年來，平邑甜茶的相關研究主要集中在遺傳育種、胚胎發育、抗性等方面的研究，近年來隨著分子生物學的發展，在基因的克隆、功能鑒定以及生理功能等方面開展無融合生殖分子機理和遺傳機理方面的研究，并通過基因工程方法對其生殖機理和功能進一步加以驗證。
[0004]近年來,對植物體細胞胚胎發生相關類受體蛋白激酶(Somatic embryogenesisreceptor-like kinases, SERKs)類基因的研究表明:富亮氨酸重復類受體蛋白激酶(IeUcine-ric hrepeatreceptor-likeproteinkinase, LRR-RLK)在植物受體類蛋白激酶家族中是一個較大的亞家族，而體細胞胚發生受體類激酶基因(Somatic embryogenesisreceptor-like kinase, SERK)屬于LRR-RLKs家族的第二亞類。已經發現LRR-RLKs在許多生理過程中有重要的調節作用，比如體細胞胚發生、無融合生殖、小孢子分化發育、花序結構、給管組織分化、油菜素內酯信號通路、花器官去木質化、細胞死亡調控、和防御反應等都具有功能。課題組在前期研究過程中在平邑甜茶子房中已分離獲得MhSERK4基因片段，該序列經NCBI數據庫Blast比對，預測為體胚發生類受體蛋白激酶基因(本發明將其命名為MhSERK4)，而MhSERK4基因的功能是什么，是否可以使普通植物也具有無融合生殖特性，于是本研究發明了通過克隆平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因及獲得該基因cDNA全長序列的簡便方法。為進一步研究蘋果屬無融合生殖的分子機理奠定基礎。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種在植物無融合生殖發育過程中起關鍵作用的基因。[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因及其克隆MhSERK4基因cDNA全長序列的方法，
[0007]本發明平邑甜茶無融合生殖相關基因MhSERK4，其特征在于該基因包括1836bp的開放閱讀框，編碼612個氨基酸，有ATG起始密碼子和TGA終止密碼子；MhSERK4基因編碼蛋白的激酶結構域高度保守，而且該基因具有I個SP信號肽，I個亮氨酸拉鏈結構域，5個富亮氨酸重復序列結構域LRR，I個SPP絲氨酸-絲氨酸-脯氨酸模序，I個TM跨膜結構域以及3個胞內激酶活性結構域和C末端結構域特征，屬于典型的SERK/LRR-RLKs類基因。
[0008]本發明所述平邑甜茶無融合生殖相關基因MhSERK4的核苷酸序列為:
【權利要求】
1.一種平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因，其特征在于，氨基酸序列為SEQ IDNO:3 ；
MTSSTSVSVWLILLFGFFHLHKLAANVE⑶ALNALKTNLADPNNVLQSWDPTLVNPCTWFHVTCNSENSVTRVDLGNANLSGQLVAQLGVLSKLQYLELYSNNITGTIPEELGGLADLVSLDLYLNKLHGNIPAALGNLAKLRFLRLNNNTLSGTIPLTLTNIQSLQVLDLSNNNQTCDIPVNGSFSLFTPISFANNPLKPLPPSPPPPVSPNPPSSPGTTATGAIAGGVAAGAALLFAAPAIALAYWRRRKPQDHFFDVPAEEDPEVHLGQLKRFSLRELQVATDTFSNKNILGRGGFGKVYKGRLADGTLVAVKRLKEERTQGGELQFQTEVEMISMAVHRNLLRLRGFCMTPTERLLVYPYMSNGSVASCLRDRPEGQPALDffPIGQRIALGSARGLAYLHDHCDPKIIHRDVKAANILLDEEFEAVVGDFGLAKLMDYKDTHVTTAVRGTIGHIAPEYLSTGKSSEKTDVFGYGVMLLELITGQRAFDLARLANDDDVMLLDWVKGLLKDRKLETLVDADLNGNYVDDQVEQLIQVALLCTQGTPGERPKMSEVVRMLE⑶GLAERWEEWQKEEVFRQDFNPIHHPSTTffIIDSTSHIPPDELSGPRZ。
2.根據權利要求1所述的平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因，其特征在于核苷酸序列為 SEQ ID NO:1 ；
5’ -ATGACGTCTTCCACCTCTGTTTCCGTCTGGCTGATTCTGCTGTTTGGCTTCTTTCACCTCCATAAGCTCGCTGCCAACGTCGAAGGTGACGCATTGAACGCGTTGAAGACCAATCTAGCTGATCCAAATAATGTTCTGCAGAGTTGGGATCCGACTCTCGTCAATCCCTGCACCTGGTTTCATGTCACTTGTAATAGCGAAAACAGCGTTACTCGAGTTGATCTTGGCAATGCCAATCTCTCTGGTCAATTGGTTGCACAGCTTGGTGTGCTTTCCAAGTTGCAGTACTTGGAACTTTACAGTAATAACATAACTGGAACCATTCCCGAAGAGCTTGGGGGTTTGGCAGACTTGGTCAGTTTGGATCTTTACTTGAACAAGTTACATGGTAACATTCCAGCGGCACTTGGCAACCTTGCAAAACTACGTTTCCTGCGTCTCAACAACAACACCTTGTCAGGGACTATTCCCTTGACTTTGACTAACATCCAATCATTGCAAGTCCTGGATCTTTCAAATAACAATCAGACAGGGGATATTCCAGTCAATGGATCTTTTTCACTTTTTACTCCCATCAGTTTTGCCAATAATCCTCTGAAACCACTTCCACCCTCTCCACCTCCTCCTGTTTCTCCGAACCCACCAAGTTCTCCAGGTACCACTGCTACTGGGGCTATTGCTGGAGGGGTTGCTGCTGGTGCTGCTTTGCTATTTGCTGCACCTGCAATTGCCCTTGCTTATTGGCGACGAAGAAAACCACAGGATCATTTCTTTGATGTACCTGCTGAGGAGGATCCAGAAGTTCATTTAGGACAGCTCAAAAGGTTTTCTTTGCGCGAACTACAAGTTGCAACGGATACCTTTAGTAACAAAAATATTCTTGGTAGAGGTGGATTTGGTAAGGTTTATAAAGGACGCTTAGCTGATGGAACTCTGGTTGCTGTAAAAAGACTTAAAGAGGAGAGAACCCAAGGTGGGGAGCTACAGTTTCAAACAGAGGTTGAAATGATTAGCATGGCTGTCCACCGCAATCTGCTTCGTCTGCGTGGTTTTTGCATGACACCAACAGAAAGGCTGCTTGTATATCCTTATATGTCTAATGGAAGTGTGGCATCATGTTTAAGAGATCGTCCAGAAGGACAACCTGCACTTGATTGGCCAATAGGACAACGCATTGCGTTGGGATCTGCAAGAGGCCTTGCTTATTTACATGATCACTGTGATCCAAAAATTATTCACCGTGATGTGAAAGCAGCAAACATATTGTTGGATGAGGAATTCGAAGCAGTTGTTGGAGACTTTGGGTTGGCTAAACTCATGGACTACAAGGATACACATGTTACCACAGCTGTACGTGGCACAATTGGTCATATAGCACCAGAGTACCTTTCAACTGGAAAATCTTCCGAGAAAACTGATGTTTTTGGATACGGAGTCATGCTTCTTGAACTCATCACTGGGCAGAGGGCTTTTGATCTTGCTCGGCTTGCGAATGATGATGATGTCATGTTACTTGATTGGGTCAAAGGACTACTGAAAGATCGGAAGTTGGAAACACTTGTTGATGCTGATCTGAATGGAAATTATGTTGACGATCAAGTGGAGCAGCTCATCCAAGTAGCTCTACTGTGCACACAAGGCACCCCAGGGGAACGACCCAAGATGTCAGAGGTTGTCCGGATGCTGGAAGGCGATGGTTTGGCTGAAAGATGGGAGGAGTGGCAAAAGGAGGAGGTGTTCCGCCAAGATTTCAACCCTATTCATCATCCAAGTACTACTTGGATCATAGACTCCACTTCTCATATTCCTCCGGATGAGTTGTCCGGTCCTAGATGA-3’。
3.根據權利要求1或2所述的平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因，其特征在于，所述基因cDNA全長序列為SEQ ID NO: 25’ -ATGACGTCTTCCACCTCTGTTTCCGTCTGGCTGATTCTGCTGTTTGGCTTCTTTCACCTCCATAAGCTCGCTGCCAACGTCGAAGGTGACGCATTGAACGCGTTGAAGACCAATCTAGCTGATCCAAATAATGTTCTGCAGAGTTGGGATCCGACTCTCGTCAATCCCTGCACCTGGTTTCATGTCACTTGTAATAGCGAAAACAGCGTTACTCGAGTTGATCTTGGCAATGCCAATCTCTCTGGTCAATTGGTTGCACAGCTTGGTGTGCTTTCCAAGTTGCAGTACTTGGAACTTTACAGTAATAACATAACTGGAACCATTCCCGAAGAGCTTGGGGGTTTGGCAGACTTGGTCAGTTTGGATCTTTACTTGAACAAGTTACATGGTAACATTCCAGCGGCACTTGGCAACCTTGCAAAACTACGTTTCCTGCGTCTCAACAACAACACCTTGTCAGGGACTATTCCCTTGACTTTGACTAACATCCAATCATTGCAAGTCCTGGATCTTTCAAATAACAATCAGACAGGGGATATTCCAGTCAATGGATCTTTTTCACTTTTTACTCCCATCAGTTTTGCCAATAATCCTCTGAAACCACTTCCACCCTCTCCACCTCCTCCTGTTTCTCCGAACCCACCAAGTTCTCCAGGTACCACTGCTACTGGGGCTATTGCTGGAGGGGTTGCTGCTGGTGCTGCTTTGCTATTTGCTGCACCTGCAATTGCCCTTGCTTATTGGCGACGAAGAAAACCACAGGATCATTTCTTTGATGTACCTGCTGAGGAGGATCCAGAAGTTCATTTAGGACAGCTCAAAAGGTTTTCTTTGCGCGAACTACAAGTTGCAACGGATACCTTTAGTAACAAAAATATTCTTGGTAGAGGTGGATTTGGTAAGGTTTATAAAGGACGCTTAGCTGATGGAACTCTGGTTGCTGTAAAAAGACTTAAAGAGGAGAGAACCCAAGGTGGGGAGCTACAGTTTCAAACAGAGGTTGAAATGATTAGCATGGCTGTCCACCGCAATCTGCTTCGTCTGCGTGGTTTTTGCATGACACCAACAGAAAGGCTGCTTGTATATCCTTATATGTCTAATGGAAGTGTGGCATCATGTTTAAGAGATCGTCCAGAAGGACAACCTGCACTTGATTGGCCAATAGGACAACGCATTGCGTTGGGATCTGCAAGAGGCCTTGCTTATTTACATGATCACTGTGATCCAAAAATTATTCACCGTGATGTGAAAGCAGCAAACATATTGTTGGATGAGGAATTCGAAGCAGTTGTTGGAGACTTTGGGTTGGCTAAACTCATGGACTACAAGGATACACATGTTACCACAGCTGTACGTGGCACAATTGGTCATATAGCACCAGAGTACCTTTCAACTGGAAAATCTTCCGAGAAAACTGATGTTTTTGGATACGGAGTCATGCTTCTTGAACTCATCACTGGGCAGAGGGCTTTTGATCTTGCTCGGCTTGCGAATGATGATGATGTCATGTTACTTGATTGGGTCAAAGGACTACTGAAAGATCGGAAGTTGGAAACACTTGTTGATGCTGATCTGAATGGAAATTATGTTGACGATCAAGTGGAGCAGCTCATCCAAGTAGCTCTACTGTGCACACAAGGCACCCCAGGGGAACGACCCAAGATGTCAGAGGTTGTCCGGATGCTGGAAGGCGATGGTTTGGCTGAAAGATGGGAGGAGTGGCAAAAGGAGGAGGTGTTCCGCCAAGATTTCAACCCTATTCATCATCCAAGTACTACTTGGATCATAGACTCCACTTCTCATATTCCTCCGGATGAGTTGTCCGGTCCTAGATGA-3,0
4.權利要求3所述的平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因cDNA全長的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一 SERK4基因片段的分離 SERK基因屬屬于LRR-RLKs家族的第二亞類，在序列上具有保守的激酶結構域。根據ArabidopsiS、carrot, cacao, Citrus and Medicago 的 SERK 基因 CDS 序列，用 Clustal W 進行多重序列比對，根據SERK基因的保守序列設計一對簡并引物采用RT-PCR的方法，獲得到671bp的SERK基因家族片段。PCR擴增的簡并引物序列為SERK4-F: TATCC (ACT)TA (CT)ATGGC(ACT)AATGGAAGSERK4-R:CC(AG)TA (AGC)CCAAA (AG)ACATC (AG)GT (CT)TTC 克隆，測序，序列分析。其氨基酸序列具有SERK/LRR-RLKs區域保守的氨基酸序列，命名為SERK4。與SERK4相似性最高的是模式植物擬南芥的同源性在96%以上、與煙草的同源性在84%以上，證明所獲得的片段即為平邑甜茶SERK4基因。SERK4基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列為:
I TATCCATACATGGCAAATGGAAGTGTGGCATCTTGTTTAAGAGgtactcatctaaattgt
YPYMANGSVASCLRG
5.根據權利要求4所述的平邑甜茶無融合生殖相關MhSERK4基因cDNA全長的克隆方法，其特征在于:所述步驟三中，所述PCR反應體系為25uL體系(上下游引物各l.0uL、10XPCR Buffer2.5uL, dNTP (2.5mM) 2.0uL, 1.0uL 的 cDNA、ExTaq0.25uL、17.25uL 的ddH20.)，反應條件為 95°C預變性 5min, 35 個循環(94°C，40s ；60°C，40s ；72°C，2min)，最后 72 °C IOmin。
【文檔編號】C12N15/54GK104017815SQ201310641281
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】董文軒, 張麗杰, 王玉霞, 高秀巖, 劉月學, 祁慶欽 申請人:沈陽農業大學