專利名稱：一種1型鴨病毒性肝炎rt-lamp檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
鴨病毒性肝炎(Duck Viral !fepatitiS，DHV)是一種傳播迅速、高度致死性雛鴨的病毒病由三種不同內型的病毒引起，分別是1型、2型和3型鴨肝炎病毒，其中，1型鴨肝炎流行最廣，我國主要的流行株也是1型鴨肝炎。該病毒主要侵害1周齡內的雛鴨，主要病理變化是肝臟腫大，出血等，發病率高，病死率高，耐過鴨多成僵鴨，生長遲緩，造成極大的經濟損失，是目前危害禽類養殖業的主要傳染病之一。目前，已有多種檢測1型鴨肝炎抗原的方法，如病毒中和試驗、免疫電鏡和 Dot-ELISA，也有許多免疫血方法，如ELISA、單克隆抗體-PAP法等，但上述方法所需檢測時間長、特異性和靈敏性低且必須配備專用設備，操作復雜，常有非特異性出現，不利于快速、 準確診斷，因而未得到廣泛推廣和應用。近年來，由Notomi T等開發的一種簡單、迅速、特異的核酸擴增方法環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，被廣泛的應用于多種病毒性疾病和細菌性疾病的診斷中(Notomi, T.，Okayama, H.，Masubuchi, H.，et al. Nucleic Acids Res. 2000 (28), e63； K. Nagamine, Τ. Hase, Τ. Notomi. Molecular and Cellular Probes . 2002(16) :223-229).該技術使用4條不同引物識別6個不同區域的靶基因，應用鏈置換擴增反應在恒溫條件下完成擴增；具有很高的擴增效率，在15到60min內可將DNA擴大IO9-IOw倍；不需要特殊試劑和精密設備。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、特異性和靈敏性高的1型鴨病毒性肝炎檢測試劑盒和檢測方法。為此，本發明公開了一種1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒，其含有熒光染料、10 X反應緩沖液、DNA聚合酶、dNTP、AMV逆轉錄酶、Mg2+、TritonX-100和引物，其特征在于所述引物為2對引物F3和B3 ；FIP和BIP ；LF和LB，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID N0. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示。在一些實施例中，所述1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒還含有甜菜堿 (Betaine solution, 5M)和 RNase 酶抑制劑。所述熒光染料為能與雙鏈/ 似結合產生熒光的染料，可為溴化乙錠、STOR Green I 熒光染料或Hoechst 33258，最優選為STOR Green I熒光染料。另一方面，本發明還公開了一種1型鴨病毒性肝炎的檢測方法，包括下列步驟 a) 取禽類的體液或組織液，抽提RNA，并以此為模板；b)利用2對引物F3和B3、FIP和BIP進行LAMP反應，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述FIP的核酸序列如 SEQ ID NO. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO. 4所示，反應條件為63°C 40-60 分鐘，80°C滅活；
c)檢測RT-LAMP反應產物。在一些實施例中，所述禽類為鴨。在一實施例中，步驟b中所述反應條件為63V 45分鐘，80°C滅活；
在一些實施例中，步驟c中所述檢測RT-LAMP反應產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳法、熒光顯色法或分光光度計法。所述熒光顯色法為STOR Green I熒光顯色法。與現有技術相比，本發明具有如下的優點
1) 4條引物對序列的8個特異區域進行識別，擴增反應只有在4條引物完全識別靶序列的情況下才能進行，在很大程度上減少了擴增反應的背景，保證了 RT-LAMP擴增的高度特異性。2)對硬件設備基本無要求，在普通的生物學實驗室就可完成檢測工作，減少了污染的機會并方便了實驗過程中的質控工作。3)檢測時間可以縮短到40分鐘，最低可以檢測到15pg RNA，提高了靈敏度。4)可視化鑒定，向反應產物中加入熒光染料，如果有擴增，熒光染料就會和DNA結合，通過肉眼即可觀察反應液呈現明亮的橙黃色，如反應液沒有橙黃色，則說明呈陰性反應。本發明所述檢測試劑盒及其檢測方法具有快速、敏感、特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前鴨病毒性肝炎檢測方法上的不足，可以滿足當前該病的檢測需求， 易于大范圍推廣應用，可減少該病在鴨等動物中的流行，具有廣闊的市場前景和較大的經濟效益。
圖1本發明設計的RT-LAMP引物對不同病毒、細菌RT-LAMP擴增結果； 圖2反應產物熒光染料顯色示意圖3 RT-LAMP反應產物進行BamH I酶切結果； 圖4不同作用時間對RT-LAMP檢測1型鴨肝炎病毒的影響； 圖5 RT-LAMP敏感性實驗結果； 圖6 RT-PCR敏感性實驗結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。實施例1 1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測
按下列組成配制鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測反應液(1)反應液a含有iox反應緩沖液、feidna聚合酶、dntp (2. 5mm each)、betaine solution (5m)、amv、rnase inhibitor、。. l%tritonx_100，mg2+、2 對引物其序列為
f3 3' gctatgacatcaaccaatgt 5' (seq id no. 1)
b3 :3’ tctatctccataggggctag 5’ (seq id no. 2)
fip 3' tagttttgagatatcgcgcacctc—tgtcgttagttatggggatga 5’ (seq id no. 3)
bip :3’ tcgcactatttcaagcttttctttg—gttatgtcactttctttgtcactag5’ (seq id no. 4)
(2)反應液b :10000x sybr green i
反應液a每管23pl體系組成為
權利要求
1.一種1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒，其含有熒光染料、10 X反應緩沖液、 DNA聚合酶、dNTP、AMV逆轉錄酶、Mg2+、TritonX-IOO和引物，其特征在于所述引物為2對引物F3和B3、FIP和BIP，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.根據權利要求1所述的1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于其還含有甜菜堿和RNase酶抑制劑。
3.根據權利要求2所述的鴨1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述熒光染料為能與雙鏈ft紛結合產生熒光的染料。
4.根據權利要求3所述的1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述熒光染料為溴化乙錠、STOR Green I熒光染料或Hoechst 33258中之一。
5.根據權利要求3所述的1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述熒光染料為STOR Green I熒光染料。
6.一種1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP的檢測方法，包括下列步驟取禽類的體液或組織液抽提RNA，并以此為模板；利用2對引物F3和B3 ；FIP和BIP進行LAMP反應，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID N0. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示，反應條件63°C 40-60分鐘，80°C 5-10分鐘滅活；檢測RT-LAMP反應產物。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于所述禽類為鴨。
8.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于步驟b中所述反應條件為63°C40-60 分鐘，80 0C 5-10分鐘滅活。
9.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于步驟c中所述檢測RT-LAMP反應產物的方法為m瓊脂糖凝膠電泳法、熒光顯色法或分光光度計法。
10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于所述熒光顯色法為STORGreen I熒光顯色法。
全文摘要
本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。本發明公開了1型鴨病毒性肝炎RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于其包含2對引物，它們的核酸序列如SEQIDNO.1-4所示。本發明所述檢測試劑盒及其檢測方法具有快速、敏感、特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前鴨病毒性肝炎檢測方法上的不足，可以滿足當前該病的檢測需求，易于大范圍推廣應用，可減少該病在鴨等動物中的流行，具有廣闊的市場前景和較大的經濟效益。
文檔編號C12Q1/70GK102453771SQ201110256049
公開日2012年5月16日 申請日期2011年9月1日 優先權日2011年9月1日
發明者丁鏟, 于圣青, 仇旭升, 宋翠萍, 胡青海, 譚磊, 韓先干 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所