專利名稱：由人多潛能干細胞制備人黑色素細胞的方法
技術領域：
本發明涉及用于獲得源自人多潛能干細胞的人黑色素細胞群的離體方法。
背景技術：
黑色素細胞是色素產生細胞，其負責皮膚、眼睛和毛發的著色。在脊椎動物的發育中，黑色素細胞源于神經嵴，并且經歷命運特化、増殖、遷移、存活(survival)和分化的復雜過程后最終存在于表皮中。色素沉著(pigmentation)由在被稱為黑色素體的特定細胞器中高度受控的黑色素生產而獲得。通過被稱為黑素生成這ー過程，黑色素體沿著所述樹突進行運輸并被轉移至生長的毛發，或被轉移至周圍的角質形成細胞以在保護人組織抵抗導致DNA損傷和組織癌癥的陽光紫外線(UV)輻射的有害影響中發揮重要作用。在過去10年中，幾種基因已被關聯于涉及黑色素細胞的色素性疾病。這些疾病可分為三種類型。第 ー種，影響黑色素細胞從神經嵴中發育的疾病(斑駁病、瓦爾登布爾氏(Waardenburg)綜合征和遺傳性對稱性色素異常癥)，第二種，具有黑色素合成缺陷的疾病(白化病)以及第三種，黑色素體成熟或轉移疾病(赫曼斯基-普德拉克(Hermansky-Pudlak)綜合征、契-東(Chediak-Higashi)綜合征和格里塞利(Griscelli)綜合征)(Rose PT等)。有趣的是,盡管為更好地了解成熟黑色素細胞的功能和調控已經進行了大量的努力，但是對人體內涉及黑色素細胞從胚胎前體的發育和分化的分子和細胞機理仍然所知甚乏。用ー組胚胎轉化因子轉化體細胞產生了具有胚胎干細胞(hESC)的多潛能特性的細胞。這些誘導的多潛能干細胞(hiPSC)具有分化成為任意細胞類型的潛能，這使其成為潛在來源，從其中產生細胞以作為治療平臺用于廣泛疾病的治療。作為這些細胞治療效益的概念驗證(proof of concept),據表明源于hiPSC的骨髓細胞可在適當的人源化小鼠模型中逆轉錸刀型細胞貧血癥表型。黑色素細胞的體外誘導最初由Yamane等(1999)所報道，他們在21天期間在包含干細胞因子(SCF)、內皮素3 (EDN3)、12_0_十四烷酰-佛波醇13-こ酸酯(TPA)和地塞米松的培養基中將小鼠胚胎干細胞共培養于單層基質細胞系ST2之上。更近期間，Herlyn實驗室(Fang等,2006)已經表明通過使用人擬胚體,在不存在滋養細胞的情況下使用蛋白質誘導物的組合，即Wnt3a、內皮素-3和SCF，可從hESC產生黑色素細胞。但是，在先前領域中并無使用2D方案從人多潛能干細胞中產生人黑色素細胞的方法的報道。因此，該領域中仍然存在從人多潛能干細胞中產生人黑色素細胞的新方法的需求。發明簡述本發明涉及用于獲得源自人多潛能干細胞的人黑色素細胞群的離體方法，所述方法包括步驟a)在刺激表皮誘導的試劑和刺激角質形成細胞的終末分化的試劑存在下共培養人多潛能干細胞與支持外胚層分化的細胞。本發明還涉及可通過上述方法獲得的源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群。本發明還涉及藥物組合物，其包含上文所述的源自人多潛能干細胞的基本上純的同質人黑色素細胞群以及任選的藥學上可接受的載體或賦形劑。在進ー步方面，本發明還涉及用于治療方法的源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群或上文所述的藥物組合物。本發明還涉及制備人皮膚替代品的方法，其包括提供本發明的源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群的步驟和提供人角質形成細胞群的步驟。此外，本發明涉及可通過上文所述的方法獲得的人皮膚替代品并且涉及其在治療方法中的應用。在另ー個方面，本發明涉及用于篩選對人黑色素細胞具有給定生物效應的化合物 的方法，其包括以下步驟i)在測試化合物存在或不存在的情況下培養根據上文所述的源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群；ii)比較在所述測試化合物存在或不存在的情況下黑色素細胞群中的所述給定生物效應。本發明還涉及根據上文定義的源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群或人皮膚替代品用于篩選化合物的應用。發明詳述本發明涉及用于獲得源自人多潛能干細胞的人黑色素細胞群的離體方法，所述方法包括步驟a)在刺激表皮誘導的試劑和刺激角質形成細胞的終末分化的試劑存在的情況下將人多潛能干細胞與支持外胚層分化的細胞共培養。所述術語“黑色素細胞”具有其在本領域中的通常含義。它是指上皮和毛發中有色的黑色素分泌細胞，其負責所述皮膚和毛發的著色。有利地，本發明的離體方法是ー種2D方法，其實現了對所述人多潛能干細胞分化成人黑色素細胞的不同階段的監控。因此，本發明方法可用于篩選干預(正性或負性)該分化過程的化合物。“細胞培養表面”或“細胞培養基質”的表述是指適用于細胞培養的各種類型的表面或基質。所述術語“細胞培養表面”包括但不限于組織培養平板、碟、孔或瓶。在ー個特定的實施方案中，所述培養表面是所述培養平板、碟、孔或瓶的塑料表面。所述細胞培養表面與真皮成纖維細胞的包被相客。本文所使用的表述“支持外胚層分化的細胞”是指提供適當的底物并且分泌適當的因子以支持人多潛能干細胞的生長和分化的細胞。在ー個特定的實施方案中，支持外胚層分化的細胞選自成纖維細胞，更特別地選自人和小鼠成纖維細胞，并且更特別地選自真皮成纖維細胞。在ー個特定的實施方案中，支持外胚層分化的細胞是絲裂霉素滅活的或放射滅活的人真皮成纖維細胞。在本發明的一個實施方案中，支持外胚層分化的所述細胞是滋養成纖維細胞。本文所使用的表述“滋養成纖維細胞”是指作為多潛能干細胞的基底層使用并且為將干細胞維持在未分化狀態而不丟失多潛能性而提供分泌因子、細胞外基質和細胞接觸的細胞。滋養細胞可通過Y射線照射或絲裂霉素進行滅活。根據本發明的一個實施方案，所述滋養成纖維細胞可來自成纖維細胞，更特別地來自人和小鼠成纖維細胞，并且更特別地來自真皮成纖維細胞，其包括真皮成纖維細胞系。真皮成纖維細胞系的實例包括但不限于 CCD-1112SK (Hovatta O 等，2003)和 3T3-J2 (Rheinwald JG 等，1975)。在ー個具體的實施方案中，在被包被于所述培養表面之前，預先處理真皮成纖維細胞以終止其増殖。因此，可使用放射線照射或使用細胞周期阻斷劑如絲裂霉素處理真皮成纖維細胞。本文所使用的術語“真皮成纖維細胞”是指合成和維持真皮細胞外基質的細胞群。真皮成纖維細胞的特異性標記物包括波形蛋白和FAP(成纖維細胞活化蛋白)。根據本發明的一個實施方案，以真皮成纖維細胞可天然粘附其上的方式選擇所述細胞培養表面。可選擇各種材料的細胞培養表面。這些材料的實例包括但不限于塑料組織培養皿或以明膠包被的培養皿。本文所使用的表述“刺激表皮誘導的試劑”是指能夠誘導表皮標記物如角蛋白8和角蛋白18表達的試劑。刺激表皮誘導的試劑一般抑制滋養層和中胚層誘導。在ー個特定的實施方案中，所述刺激表皮誘導的試劑選自骨形態發生蛋白(如BMP-2、BMP-4 和 BMP-7)、受體調控的 Smad 蛋白(如 Smad I、Smad 5 和 Smad 9)和 TGF-β家族配體(如生長和分化因子6 GFD-6) (Moreau等，2004)。在一個優選的實施方案中，所述刺激表皮誘導的試劑選自BMP-2、BMP-4、BMP-7、SmadU Smad5、Smad7和GFD-6。在ー個優選的實施方案中，所述刺激表皮誘導的試劑是BMP-4。所述術語“BMP-4”是指骨形態發生蛋白4。BMP-4是屬于TGF-β超家族蛋白質的多肽。示例性的天然ΒΜΡ-4氨基酸序列在GenPept數據庫中以登錄號AAC72278提供。在一個實施方案中，所述刺激表皮誘導的試劑選自BMP-2、BMP-4、BMP_7、SmadUSmad5、Smad7 和 GFD-6。在一個優選的實施方案中，所述刺激表皮誘導的試劑是BMP-4。BMP-4的濃度可介于O. 02nM至77nM或介于O. 3ng/mL至1000ng/mL。在ー個特定的實施方案中，BMP-4的濃度是O. 5nM。本文所使用的表述“刺激角質形成細胞的終末分化的試劑”是指刺激角蛋白5和角蛋白14表達的試劑。實際上，角蛋白5和角蛋白14是能夠在3D培養物中終末分化的基底角質形成細胞的標記物。在ー個特定的實施方案中，所述刺激角質形成細胞的終末分化的試劑選自抗壞血酸和視黃酸。在一個優選的實施方案中，所述刺激角質形成細胞的終末分化的試劑是抗壞血酸。所述術語“抗壞血酸”是指(R) _3,4_ ニ輕基_5_ ((S) -1, 2_ ニ輕こ基)咲喃_2 (5H)-酮，其具有以下結構式
權利要求
1.一種用于獲得源自人多潛能干細胞的人黑色素細胞群的離體方法，其包括步驟a)在刺激表皮誘導的試劑和刺激角質形成細胞的終末分化的試劑存在下共培養人多潛能干細胞與支持外胚層分化的細胞。
2.根據權利要求I所述的離體方法，其中所述支持外胚層分化的細胞是滋養成纖維細胞。
3.根據權利要求I或2所述的離體方法，其中所述刺激表皮誘導的試劑選自BMP-2、BMP-4、BMP-7、Smadl、Smad5、Smad7 和 GFD-6。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的離體方法，其中所述刺激角質形成細胞的終末分化的試劑選自抗壞血酸和視黃酸。
5.根據前述權利要求中任一項所述的離體方法，其中所述人多潛能干細胞是人胚胎干細胞(hES細胞)或人誘導多潛能干細胞(hiPS細胞)。
6.根據前述權利要求中任一項所述的離體方法，其中所述步驟a)進行至少35天，優選地至少40天，甚至更為優選地至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天或至少75天。
7.根據前述權利要求中任一項所述的離體方法，其在步驟a)后進一步包括下列步驟 b)從步驟a)獲得的細胞群中分離色素細胞； c)在適當的培養基中培養所述分離的細胞。
8.一種源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群，其可通過根據權利要求I至7中任一項所述的方法獲得。
9.一種藥物組合物，其包含根據權利要求8所述的源自人多潛能干細胞的基本上純同質黑色素細胞群以及任選的藥學上可接受的載體或賦形劑。
10.用于治療方法中的根據權利要求8所述的源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群或根據權利要求9所述的藥物組合物。
11.一種制備人皮膚替代品的方法，其包括提供根據權利要求8所述的源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群的步驟以及提供人角質形成細胞群的步驟。
12.一種人皮膚替代品，其可通過根據權利要求11所述的方法獲得。
13.用于治療方法中的根據權利要求12所述的人皮膚替代品。
14.一種用于篩選對人黑色素細胞具有給定生物效應的化合物的方法，包括以下步驟 i)在測試化合物存在或不存在的情況下培養根據權利要求8所述的源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群； )比較在所述測試化合物存在或不存在的情況下黑色素細胞群中的所述生物效應。
15.根據權利要求8所述的源自人多潛能干細胞的分離的基本上純的同質人黑色素細胞群或根據權利要求12所述的人皮膚替代品用于篩選化合物的用途。
全文摘要
本發明涉及用于獲得源自人多潛能干細胞的人黑色素細胞群的離體方法，所述方法包括在刺激表皮誘導的試劑和刺激角質形成細胞的終末分化的試劑存在下共培養人多潛能干細胞與支持外胚層分化的細胞的步驟。本發明還涉及可通過所述方法獲得的人黑色素細胞以及其在細胞治療和篩選試驗中的用途。
文檔編號C12N5/0735GK102858955SQ201180008443
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月21日 優先權日2010年2月23日
發明者X·尼桑, C·巴爾德希, G·勒邁特, M·佩尚斯基 申請人:國家醫療保健研究所