高產量分離包括小靶核酸在內的靶核酸的方法

專利名稱：高產量分離包括小靶核酸在內的靶核酸的方法
高產量分離包括小靶核酸在內的靶核酸的方法本發明涉及從樣品分離包括小靶核酸在內的靶核酸的方法，且特定提供從樣品中以高產量有效分離小靶核酸的方式。研究來自各種組織、體液和生物體的1000或500核苷酸或更小范圍的小核酸是引起極大興趣的領域且將來仍會保持。小核酸特定包括但不限于小RNA如微RNA (miRNA)和小干擾RNA分子等，二者都對基因表達有顯著效果。此外，對參與mRNA和rRNA加工的其他小核RNA和小核仁RNA(如snRNA和snoRNA)以及小DNA分子也感興趣。此外，長度為1000或500核苷酸或更小的核酸通常還作為降解產物包含在特定樣品中，所述樣品如福爾馬林固定和石蠟包埋的樣品(FFPE樣品)，因為各保存措施可能破壞DNA和/或RNA完整性。隨著對各小核酸的興趣不斷增大，已改良標準分離過程以促進分離小核酸并特定提高小核酸產量。所述用作分離DNA或RNA標準的已知操作通常對于分離小核酸不理想，因為小核酸通常不能在分離過程中用標準方法有效捕獲和洗脫。因此，用標準過程從樣品中分離靶核酸一般不包括足夠量的小靶核酸并從而提供可接受的產量，這是因為小核酸在核酸分離過程中不結合或喪失。因此，需要改善的技術用于有效分離小靶核酸，單獨或作為已分離總靶核酸如總RNA或總DNA的一部分。就分離小核酸優化的方法通常依賴于苯酚和氯仿提取以及逐步醇分級分離。根據一個實施方式，RNA在水相中濃縮并隨后從中分離，例如通過加入至少一種醇和使RNA結合膜。在此，有效捕獲已分離總RNA中的小RNA也很重要。此外，開發了分離小核酸如小RNA的方法，所述方法包括使用離液劑、高濃度醇和核酸結合柱，所述柱包含例如核酸結合膜如二氧化硅膜。如果各小RNA包含在樣品中，用這些操作分離的總RNA包括小RNA。各基于膜的分離操作特別適于從各種樣品中分離小核酸，單獨或作為總靶核酸的一部分。

然而，使用基于固相的柱以結合核酸(例如柱包括核酸結合膜)的許多核酸分離方法在靶核酸結合核酸結合相(也稱為如“膜上”或“柱上”處理步驟)時涉及一種或多種水溶液的一個或多個處理步驟。所述核酸結合核酸結合固相時進行的各處理步驟示例包括但不限于蛋白消化步驟和核酸酶消化步驟如DNA酶或RNA酶處理。發現運行各處理步驟減少靶核酸產量且特定減少小靶核酸產量，因為所述處理具有以下效果:至少一部分已結合靶核酸且特定是小靶核酸在所述處理步驟中從所述核酸結合固相中釋放。因此，為防止釋放的核酸在隨后洗滌或加工步驟中喪失，現有技術已知應用例如在進行處理后恢復合適結合條件的離液溶液(例如離液洗滌液)以恢復可能釋放的靶核酸與核酸結合相的結合。各恢復步驟例如描述于W098/59076且還用于許多市售可得的核酸分離試劑盒。然而，發現盡管進行各恢復步驟以恢復可能釋放的靶核酸與核酸結合固相的結合，小靶核酸在分離工藝中最終仍喪失。用基于柱的固相以結合所述核酸來分離核酸時，例如用含核酸結合膜的柱時，尤其如此。因此，仍需要改善以增加已分離靶核酸中的小核酸產量。因此，本發明目的是提供分離至少一種靶核酸的方法，所述靶核酸包括小靶核酸或可由其組成，其中所述小靶核酸產量增加。

發明內容
本發明是基于以下發現:如果使用基于柱的核酸結合固相，核酸結合核酸結合固相時在進行例如酶處理后應用恢復緩沖液或促結合洗滌緩沖液不足以用于重捕獲并因而以可接受產量分離所述處理中釋放的小靶核酸。隨后，會根據優選實施方式解釋，其中核酸結合膜用作固相。不受理論約束，推斷膜上處理中釋放的至少一部分小靶核酸位于膜下方和/或膜孔下深處。各“逃逸”小靶核酸不能通過應用恢復緩沖液(或促結合洗滌緩沖液)而有效重結合，因為其不接觸所述膜的核酸結合區域，并因此在隨后加工步驟中喪失。用其他基于柱的核酸結合固相時，特別是如果核酸結合固相僅形成例如柱中的薄層，發生類似問題。本發明教授收集這些“逃逸”小靶核酸并使其結合核酸結合固相。因此，這些“逃逸”小靶核酸(進行現有技術方法時喪失)還能在靶核酸分離工藝中有效捕獲，從而增加已分離靶核酸中小靶核酸的產量。因此，根據本發明的方法能以提高的產量分離小靶核酸并從而提供相對現有技術已知方法顯著的優勢。因此，根據第一方面，提供從樣品分離至少一種包括小靶核酸在內的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步驟a)通過將樣品經過柱來使至少一部分包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述柱中所含核酸結合固相，b)在靶核酸結合所述固相時對核酸結合固相進行酶和/或化學處理，c)收集所述步驟b)處理中從固相釋放的至少一部分小靶核酸作為流出物，d)將含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物接觸所述核酸結合固相，用以將所含小靶核酸結合核酸結合固相，e)可選進行洗脫。根據一方面，提供從樣品分離至少一種包括小靶核酸在內的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步驟 a)通過將樣品經過核酸結合膜來使至少一部分包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述膜，b)在靶核酸結合所述膜時對膜進行涉及水溶液的處理，c)使回收溶液通過所述膜并收集含小靶核酸的流出物，d)使所述流出物通過步驟a)的膜以將所含小靶核酸重結合所述膜，e)可選從所述膜洗脫包括小核酸在內的靶核酸。此外，本發明涉及應用能使小核酸結合柱中所含核酸結合固相的回收溶液，用于在核酸結合所述固相時重結合在先前進行的處理中從所述核酸結合固相釋放并優選收集為流出物的小核酸。此外，本發明涉及運行本發明所述方法的試劑盒，包括:a)柱中所含的核酸結合固相，優選膜；b)含有離液劑和醇的結合緩沖液，用于使包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述核酸結合固相；c)回收溶液，包含濃度為0，5M-多至飽和極限的離液劑和濃度為至少50%的醇；和
d)運行本發明所述方法的說明書。遵循下列描述和所附權利要求，本應用的其他目的、特征、優勢和方面對本領域技術人員顯而易見。然而，應理解闡述所述應用的優選實施方式時，下列描述、所附權利要求、和特定實施例僅通過說明方式給出。在所公開發明精神和范圍內的各種變化和修改通過閱讀下列內容會對本領域技術人員顯而易見。附圖簡要說明

圖1-3顯示用安捷倫(Agilent)生物分析儀從腎組織分離的RNA大小分布。“ + ”鑒定用本發明所述方法分離的RNA且鑒定用參考方法分離的RNA。小RNA部分用箭頭標記。圖4顯示RNA分離后的miR16檢測試驗結果，用不同回收溶液或參考方法進行本發明所述方法，其中不使用各回收溶液。可見用本發明所述回收溶液，Ct值顯著下降，從而證明小RNA分離改善。圖5顯示用5個不同試劑盒純化的RNA加樣的瓊脂糖凝膠照片(參見實施例7)。右側箭頭標記小RNA。圖6的圖表顯示用Cjun mRNA的實時PCR結果(參見實施例7)。從獲自3種不同大鼠組織的FFPE樣品純化RNA:1.肝(包埋2個月)，2.腎(包埋19個月)和3.肺(包埋8個月)。圖7的圖表顯示用miR29a的微RNA分析結果(參見實施例7)。圖8a和8b描述用不同供應商試劑盒純化的DNA的實時PCR分析結果(參見實施例7)。從獲自3種不同大鼠組織的FFPE樣品純化DNA:1.肝(包埋2個月)，2.腎(包埋19個月)和3.肺(包埋8個月)。圖8a中，就所有樣品而言模板體積相同，圖Sb中，使用相同模板濃度。圖9a和9b的圖表顯示實時PCR實驗結果以分析Madh7RNA (參見實施例7)。從獲自3種不同大鼠組織的FFPE樣品純化RNA:1.肝(包埋2個月)，2.腎(包埋19個月)和
3.肺(包埋8個月)。圖9a中，就所有樣品而言模板體積相同，圖9b中，使用相同模板濃度。發明詳述意外發現進行至少下列步驟時，小靶核酸產量能在從樣品分離至少一種包括小靶核酸在內的靶核酸的方法中顯著增加:a)通過將樣品經過柱來使至少一部分包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述柱中所含核酸結合固相，b)在靶核酸結合所述固相時對核酸結合固相進行酶和/或化學處理，c)收集所述步驟b)處理中從固相釋放的至少一部分小靶核酸作為流出物，d)將含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物接觸所述核酸結合固相，用以將所含小靶核酸結合核酸結合固相，e)可選進行洗脫。根據本發明的單獨步驟會在下面進一步詳細解釋。步驟a)中，當樣品通過所述柱時，樣品所含包括小靶核酸在內的靶核酸結合柱中所含核酸結合固相。核酸結合膜優選用作固相。使包括小靶核酸在內的靶核酸結合核酸結合固相如膜的合適結合條件為現有技術已知并進一步詳細描述于下。所述結合條件還取決于待分離的靶核酸(如RNA或DNA或兩者)。優選采用能使包括小靶核酸在內的靶核酸較強并因而有效結合核酸結合固相的結合條件，從而能以高產量分離包括小靶核酸在內的靶核酸。為實現步驟a)的合適結合條件，所述樣品能混合適當結合溶液，如建立所需結合條件的結合緩沖液。通常，步驟a)會在加工需要裂解的樣品情況中于樣品初始裂解后進行。此夕卜，其他預處理步驟也能在步驟a)前進行，如用于使裂解物澄清、移除非靶核酸或其他污染物、濃縮靶核酸和/或預純化靶核酸。這些情況中，各預處理或加工樣品作為樣品通過步驟a)中的柱且至少包括小靶核酸在內的靶核酸結合核酸結合固相。在化學裂解液用于裂解的情況中，所述裂解液也能作用于建立合適結合條件。步驟b)中，包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述固相時，對固相進行酶和/或化學處理，如在膜用作核酸結合固相情況中的膜上處理。各處理通常在核酸分離過程中進行且包括但不限于選自下組的處理:核酸酶消化步驟，如DNA酶或RNA酶處理、蛋白消化步驟，如用蛋白裂解酶處理以降解結合步驟a)中結合例如膜的蛋白污染物(參見例如W02009/016110，通過引用納入本文)、脂酶處理和靶核酸修飾步驟。各處理通常涉及使用一種或多種具有允許或促進所需處理性能的組合物的水溶液。然而，所述水溶液通常不具有允許或促進靶核酸且特定是小靶核酸結合所述核酸結合固相的組合物。其在進行例如膜上或柱上酶處理時特定應用，因為必須確立能使酶活化的條件。因此，步驟b)中進行的酶和/或化學處理常涉及引起至少部分小靶核酸從核酸結合固相釋放的條件。因此，在步驟b)進行的處理期間加入水溶液引起步驟a)中結合核酸結合固相的靶核酸部分釋放。靶核酸越小，所述靶核酸在步驟b)進行的處理期間完全從核酸結合固相解離的風險越高。如上所討論，各釋放靶核酸(通常是小尺寸)能定位于膜(分別為柱中所含核酸結合固相)之上方、之中或之下方。所釋放靶核酸位于例如膜下方或膜孔下深處的情況中，其不能通過應用恢復溶液或使用促結合洗 滌緩沖液來有效重捕獲。因此，其在樣品進一步加工中喪失，如同根據現有技術的方法中的情況。為捕獲并因而分離不能通過恢復合適結合條件而重結合的各“逃逸”小靶核酸，本發明教授了在步驟c)中從核酸結合固相移出“逃逸”小靶核酸。因此，步驟c)中，在所述步驟b)處理中從核酸結合固相釋放的至少一部分小靶核酸收集為流出物。優選分別收集大部分或所有“逃逸”小靶核酸。進行所述步驟C)收集是重要的，因為其顯著增加所分離靶核酸中小靶核酸的產量，這也由示例所證明。當然，因而還能有效收集步驟b)中可能釋放的較大靶核酸。然而，如上所討論，用較大靶核酸不太發生此問題，因為較大靶核酸通常與核酸結合固相的結合強于較小靶核酸。然而，如果釋放，其也可由本發明所述方法有效重捕獲。步驟d)中，含小靶核酸的混合有回收溶液(且可選其他溶液/化學物)的所述流出物接觸核酸結合固相，以使所含小靶核酸結合所述固相。通過根據本發明混合小靶核酸與回收溶液，確立能使所收集小靶核酸結合固相的結合條件。步驟d)中用于結合小靶核酸的核酸結合固相優選是與步驟a)所用相同的核酸結合固相。此實施方式中，含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物再應用于步驟a)所用核酸結合固相，從而使小靶核酸重結合所述固相并連接小靶核酸與步驟b)未釋放的靶核酸。如上所討論，優選膜作為核酸結合固相用于步驟a)。然而，在步驟d)中使用與步驟a)所用不同的核酸結合固相如磁性硅粒子、基于柱的不同核酸結合固相或相同膜類型也在本發明范圍內。步驟d)中進行的所述“逃逸”小靶核酸回收能顯著降低小靶核酸損失并因而增加所分離靶核酸中小靶核酸的產量。可選步驟e)中，進行一個或多個洗脫步驟。替代地或另外，根據預期下游應用、各靶核酸預期用途，靶核酸結合固相時還可進行加工。需要進行洗脫步驟的情況中，能進行洗脫例如通過使用經典洗脫液如水、洗脫緩沖液、低鹽緩沖液且特定是生物緩沖液。優選使用不干擾預期下游應用的洗脫液。然而，如果需要通過其他洗脫方式如加熱來釋放并因此的洗脫靶核酸也在本發明范圍內。用于步驟d)的固相不同于步驟a)所用核酸結合固相的情況中，從步驟a)所用固相洗脫靶核酸和分開洗脫結合步驟d)所用固相的小靶核酸且合并各洗脫物在本發明范圍內。進行洗脫步驟前組合所述固相也在本發明范圍內。此外，重復洗脫步驟以確保所有靶核酸從核酸結合固相有效釋放也在本發明范圍內。如示例所示，使用基于柱的核酸分離過程顯著增加所分離靶核酸中小靶核酸的產量時，與現有技術相反的本發明所述方法額外進行步驟c)和d)。有數種進行步驟c)和d)用于捕獲并因而分離“逃逸”小靶核酸的選擇。一些非限制性實施方式進一步描述于下。根據一個實施方式，步驟c)中，確立適于使小核酸結合步驟a)所用核酸結合固相的條件的回收溶液通過柱且收集含“逃逸”小靶核酸的流出物。已混合回收溶液(且可選混合其他成分)的所述流出物在步驟d)應用于步驟a)所用相同核酸結合固相。因此，流出物所含“逃逸”小靶核酸結合步驟a)所用固相(步驟b)進行膜上處理中未釋放的靶核酸仍結合其上)。優選此實施方式，因為其具有數個優勢。首先，使回收溶液通過所述柱并因而通過所含核酸結合固相建立、分別重新建立適于使小核酸結合核酸結合固相的條件。因而，能確保靶核酸且特定是步驟b)處理中至少部分釋放但仍重結合固相的小靶核酸有效重結合所述固相，這是因為回收溶液重新建立合適結合條件。第二，不能通過重新建立合適結合條件而重結合固相的“逃逸”小靶核酸被有效移出并因而收集為回收溶液中的流出物。第三，步驟c)中直接使用回收溶液以收集“逃逸”小靶核酸具有以下優勢:小靶核酸直接在某一溶液中提供，所述溶液提供使“逃逸”小靶核酸重結合步驟a)所用固相的合適結合條件以結合包括小靶核酸在內的靶核酸。因此，“逃逸”小靶核酸能與仍結合所述固相的靶核酸重連接，因而所有靶核酸能在隨 后制備步驟中一起加工。根據收集逃逸靶核酸的另一實施方式，步驟b)進行的酶和/或化學處理包括使用水溶液且“逃逸”小靶核酸通過收集流出物來保存，所述流出物含小靶核酸和用于步驟b)處理的水溶液。在此實施方式中，回收溶液能在步驟c)收集后加入流出物，且可選混合有其他添加物的所得混合物在步驟d)中接觸核酸結合固相，所述固相優選是上述步驟a)所用核酸結合固相。根據一個實施方式，應用水溶液如反應緩沖液、水或洗脫緩沖液并通過含核酸結合固相的柱，所述固相優選是膜。然后，所釋放小靶核酸在所述水溶液中收集。如需要，能對分別收集的小靶核酸進行酶和/或化學處理且添加其他組合物/物質到所收集小靶核酸也在本發明范圍內。此外，能對仍結合步驟a)所用固相的靶核酸進行酶和/或化學處理。此實施方式具有以下優勢:能處理已結合(通常較大)靶核酸，不同于預洗脫和收集的小靶核酸。根據一方面，提供從樣品分離包括小靶核酸在內的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步驟:
a)通過將樣品經過核酸結合膜來使至少一部分包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述膜， b)在靶核酸結合所述膜時對膜進行涉及水溶液的處理，c)使回收溶液通過所述膜并收集含小靶核酸的流出物，d)使所述流出物通過步驟a)的膜以將所含小靶核酸重結合所述膜，e)可選從所述膜洗脫包括小核酸在內的靶核酸。包括小核酸在內的靶核酸優選從膜中洗脫。任何合適的方法能用于步驟c)以收集至少一部分小靶核酸作為流出物。進行基于柱的核酸分離過程時，采用的合適收集方法包括但不限于進行離心步驟，應用正或負壓以擠壓和/或吸取小靶核酸，所述核酸優選包含在上述回收溶液或水溶液中，以任一方向通過柱所含的核酸結合固相，其中所述固相優選是膜。用于重結合“逃逸”小靶核酸的回收溶液應分別建立適于使小核酸結合步驟d)所用核酸結合固相的條件。回收溶液還可通過混合一種或多種溶液和/或成分來獲得。回收溶液可提供適于使包括小核酸在內的總核酸結合步驟d)所用核酸結合固相的條件。在分離特定靶核酸的情況中，回收溶液可提供適于使所需靶核酸類型(如包括小RNA在內的總RNA)優選結合步驟d)所用核酸結合固相的條件。在DNA是所需靶核酸的情況中，其還可提供使包括小DNA在內的DNA(如總DNA、基因組DNA、片段化DNA和/或低分子量DNA如質粒DNA)結合步驟d)所用核酸結合固相的條件。由回收溶液和/或回收溶液與步驟c)所收集流出物的混合物提供的結合條件可與步驟a)所用條件相同或類似，以使包括小靶核酸在內的靶核酸結合柱所含核酸結合固相。然而，優選回收溶液分別提供的步驟d)所用結合條件強于步驟a)所用條件。還可通過混合一種或多種溶液或化學劑所獲得的回收溶液優選包括至少一種離液劑和/或至少一種醇。能使用任何離液劑以用于通過例如但不限于改變蛋白或核酸二級、三級、或四級結構而同時保持一級結構完整來引起蛋白或核酸紊亂。優選所述離液劑選自鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉、碘化鈉、高氯酸鈉、三氯乙酸鈉、三氟乙酸鈉和尿素。優選使用離液鹽。特定地，鹽酸胍和/或硫氰酸胍能用作離液劑。步驟d)所用回收溶液和/或結合混合物中至少一種離液劑濃度可在0，05M多至飽和極限范圍。優選濃度范圍根據所用離液劑為約0，1M-6M、約0，2M-4M、約0，5-3M，且優選范圍為約0，8-2M。此外，用于使所收集小靶核酸結合核酸結合固相的步驟d)所用回收溶液和/或結合混合物可包括至少一種醇。作為醇，優選使用短支鏈或直鏈醇，優選1-5個碳原子。示例是甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇。還能使用醇混合物。所述醇優選選自異丙醇和乙醇，當分離RNA為靶核酸時特別適合的是異丙醇。根據一個實施方式，本發明所述方法不涉及使用苯酚和/或氯仿以結合核酸。然而，苯酚和氯仿能例如用于樣品制備和/或樣品裂解，如用于獲得含靶核酸的水相，所述核酸特定是RNA。例如，所述水相還能用作步驟a)的樣品，優選混合有醇，以使靶核酸結合膜，這也由示例所證明。醇可以濃度10%v/v_90%v/v包含在步驟d)所用回收溶液和/或結合混合物中。對于分離包括小祀核酸在內的祀核酸，使用> 30%v/v> ^ 40%v/v> ^ 50%v/v,優選> 60%v/v、彡70%的醇濃度有益。優選醇濃度范圍為約30%v/v-90%v/v/或約40%v/v-85%，更優選范圍為約 60%v/v-80%v/v。步驟a)中，能在與上述步驟d)相同或相似條件下進行結合。因此，步驟a)所用結合條件可具有一種或多種下列特征:a)適于使包括小核酸在內的總核酸結合柱所含核酸結合固相的條件；b)適于使包括小RNA在內的總RNA結合柱所含核酸結合固相的條件；c)適于使包括小DNA在內的DNA結合柱所含核酸結合固相的條件；d)在至少一種離液劑和至少一種醇存在下發生結合；e)在至少一種離液劑存在下發生結合，所述離液劑選自鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉、碘化鈉、高氯酸鈉、三氯乙酸鈉、三氟乙酸鈉和尿素；f)在包含于結合混合物的至少一種離液劑存在下發生結合，濃度選自0，IM多至飽和極限濃度，優選0，5-6M，更優選0，5-4M ;和/或g)在至少一種醇存在下發生結合，所述醇選自上述用于結合步驟d)的醇。其他添加劑還能用于步驟a)和/或步驟d)的結合混合物。例如，能使用支持樣品裂解、蛋白降解和/或保護結合混合物中靶核酸的添加劑。示例包括但不限于螯合劑、抑制劑、去污劑、緩沖劑、穩定劑、堿劑、核酸酶抑制劑和β -巰基乙醇，特定是EDTA、EGTA,鹽如氯化鈉、硫酸銨、氯化銨、LiCl或其他促進核酸結合和/或沉淀的物質。各添加劑能包括例如在回收溶液和/或結合溶液中，但還可分開添加。此外，生物緩沖液能在步驟a)和/或步驟d)中使用，并因此還可包括在回收溶液中。各緩沖液示例包括但不限于HEPES、MES、MOPS、TRIS、檸檬酸鈉、乙 酸鈉和BIS-TRIS丙烷。步驟a)和/或d)的結合中使用的pH值優選位于范圍4-11,就RNA而言優選范圍為約5-8，更優選6-7，5。就DNA而言，pH值優選位于約5_11范圍內，更優選約6_10范圍。分離2種核酸類型為靶核酸時，pH優選位于約6-8范圍內。回收溶液優選包括使pH在上述范圍緩沖的緩沖液。根據一個實施方式，回收溶液的PH位于約pH5-ll范圍，優選約5，5-8范圍；最優選回收溶液具有約5-7，5或約7的pH。各pH值特別適于分離RNA為靶核酸。根據一個實施方式，在步驟a)與b)之間和/或步驟d)之后進行一個或多個洗滌步驟，同時靶核酸結合所述固相。為此，可使用普通洗滌液。推薦使用不引起包括小靶核酸在內的靶核酸從核酸結合固相釋放的洗滌液。根據一個實施方式，用于洗滌的溶液包括至少一種離液劑、至少一種醇和/或至少一種緩沖組分。其還可包括去污劑。能用于洗滌液的離液劑包括但不限于鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍和碘化鈉。此外，能使用離液鹽，所述離液鹽包含選自三氯乙酸鹽、高氯酸鹽和三氟乙酸鹽的離液序列高的陰離子。各離液鹽示例是堿鹽如高氯酸鈉、三氯乙酸鈉和三氟乙酸鈉。作為醇，能使用優選有1-5個碳原子的短支鏈或直鏈醇以分別在洗滌液中清洗。示例是甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇。優選使用異丙醇和/或乙醇。根據一個實施方式，所述洗滌液包含至少30%醇和至少0，5M離液鹽，優選至少2M離液鹽。此外，所述洗滌液可包含去污劑。離子和/或非離子型去污劑優選用作去污劑。非離子型去污劑優選以至少0，1%濃度使用。例如，各洗滌液適于清洗RNA。能替代或補充(優選隨后)上述洗滌液使用的其他合適洗滌液包含醇和生物緩沖液。合適醇和生物緩沖液如上描述。就第二洗滌步驟優選使用異丙醇或乙醇，最優選乙醇。乙醇優選以至少30%v/v濃度使用，優選至少50%v/v。生物緩沖液優選是pH約7-8的Tris。然而，根據所分離靶核酸和加工樣品，還能使用其他緩沖液如檸檬酸鈉以及其他PH值。能替代或補充(優選隨后)上述洗滌液使用的其他合適洗滌液還包含一種或多種醇和可選的緩沖液。合適醇和生物緩沖液如上描述。就替代洗滌步驟優選使用異丙醇或乙醇，最優選乙醇。乙醇優選以至少50%v/v濃度使用，優選至少70%v/v或更高。術語“樣品”在本文中以廣義使用并意在包括多種含核酸的來源和組合物。所述樣品可以是生物樣品，但所述術語還包括其他，例如包含核酸如PCR產物或組合物的人工樣品，所述組合物含有例如假定進一步濃縮和/或進一步純化的已純化核酸。示例性樣品包括但不限于全血；血液制品；紅血球；白血球；血沉棕黃色層；拭子，包括但不限于口腔拭子、咽喉拭子、陰道拭子、尿道拭子、子宮頸拭子、咽喉拭子、直腸拭子、病損拭子、膿腫拭子、鼻咽拭子等；尿；痰；唾液；精液；淋巴液；羊水；腦脊液；腹膜滲出；胸膜積液；囊腫液；滑液；玻璃體液；房水；囊液；洗眼液；眼抽出物；血漿；血清；肺灌洗液；肺抽吸；動物，包括人或植物組織，包括但不限于肝、脾、腎、肺、腸、腦、心、肌肉、胰臟、細胞培養物以及裂解物、提取物或獲自上述樣品的材料和部分或者可存在于樣品之上或之中的任何細胞和微生物和病毒等。獲自臨床或法醫環境、包含核酸的材料也在術語“樣品”的預期意義內。樣品優選是從人、動物、植物、細菌或真菌獲得的生物樣品。樣品優選選自細胞、組織、細菌、病毒和體液如血液、血液制品如血沉棕黃色層、血漿和血清、尿、液劑、痰、糞便，CSF和精子、上皮拭子、活檢、骨髓樣品和組織樣品，優選器官組織樣品如肺、腎或肝。此外，技術人員應理解獲自任何上面示例性樣品的裂解物、提取物或加工材料或部分也在術語“樣品”范圍內。這特定包括但不限于樣品裂解物、澄清裂解物、預提取樣品部分、假定進一步純化和/或濃縮的已純化核酸等，所述預提取樣品部分例如就某一靶核酸類型富集，這是例如苯酚/氯仿提取中的情況，其中核酸如RNA在水相中濃縮。術語“樣品”還包括加工樣品如保存、固定和/或穩定的樣品。作為固定劑，能使用交聯以及非交聯固定劑(非限制性市售示例包括PAXgene組織固定劑或卡諾伊溶液)。能用于穩定樣品的市售可得穩定劑示例包括但不限于RNAlater、Allprotect Tissue (組織)、RNAprotect Cell (細胞)、RNAprotect Saliva (唾液)、RNAprotect Bacteria (細菌)、PAXgene Blood RNA (血液 RNA)、PAXgene Blood DNA(血液 DNA)、PAXgene Bone Marrow RNA (骨髓 RNA)和 QIAsafe。特定地，根據本發明的方法用于從含已降解和破壞核酸如降解RNA或降解DNA的樣品分離靶核酸。這類樣品的非限制性示例包括細胞，所述細胞含有已保存樣品例如福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE樣品)或用交聯固定劑如戊二醛處理的其他樣品。例如，來自腫瘤的活檢樣品在FFPE的手術過程后進行常規保存，其可能破壞DNA和/或RNA完整性。各經降解的核酸通常具有小尺寸并因而是小核酸。所公開方法宜用于分離由小靶核酸組成或包括其的祀核酸。例如，所述樣品可以是包括小核酸如非編碼RNA (例如snoRNA或miRNA)或小DNA的樣品。此外，靶核酸可由經修飾或降解的核酸組成或可包括它們。所述修飾或降解能是例如由于用防腐劑處理。本文所用的術語“核酸”特定指含通常由亞基間磷酸二酯鍵共價結合的核糖核苷和/或脫氧核糖核苷的聚合物，但一些情況中由硫 代磷酸、甲基膦酸酯等共價結合。核酸包括但不限于gDNA ;環狀DNA ;低分子量DNA、質粒DNA ;循環DNA ；hnRNA ；mRNA ;非編碼RNA (ncRNA)，包括但不限于 rRNA、tRNA、miRNA (微 RNA)、siRNA(小干擾 RNA)、snoRNA (小核仁RNA)、snRNA (小核RNA)和stRNA(小時序RNA);片段化或經降解的核酸；PNA ;獲自亞細胞器如線粒體或葉綠體的核酸；和獲自微生物、寄生蟲的核酸，或可存在于生物樣品中的DNA或RNA病毒。可包括或不包括加入或“摻入”生物樣品的核苷酸類似物的合成核酸序列也在本發明范圍內。術語“小核酸”和“多種小核酸”特定指長度小于lOOOnt、小于750nt、小于500nt、小于400nt、小于300nt、小于250nt、小于200nt、小于IOOnt或小于70nt的核酸且包括但不限于 miRNA、siRNA 和其他短干擾核酸、snoRNA、snRNA、tRNA, pi RNA, tnRNA、小 rRNA、hnRNA、循環核酸、基因組DNA或RNA片段、經降解的核酸、核酶、病毒RNA或DNA、感染源核酸、擴增產物、修飾核酸、質粒或細胞器核酸和人工核酸如寡核苷酸。根據本發明的方法涉及分離至少一種靶核酸的方法。術語“靶核酸”和“多種靶核酸”在本文中同義使用。從能根據本發明方法加工的所述樣品示例顯而易見的是，樣品可包含多于一種類型的核酸。根據預期用途，需要從樣品分離所有核酸類型(如隨后都由術語靶核酸或多種靶核酸涵蓋的DNA和RNA)或僅某些或某一核酸類型(如僅RNA而非DNA，或反之亦然)或平行的RNA和DNA，即來自一個樣品，但彼此分開。所有這些變體在本發明范圍內。術語“小靶核酸·”或“多種小靶核酸”(這些術語也同義使用)特定指具有所需靶標類型的小核酸，例如小RNA或小DNA、或小RNA和小DNA。此外，表述“包括小靶核酸在內的靶核酸”不僅指含小靶核酸部分的靶核酸(如總RNA或總DNA)，還指并涵蓋由小靶核酸組成的靶核酸，且因而其不包括較大核酸。樣品可在進行結合步驟a)前加工。例如，樣品能被破壞和/或裂解以釋放該樣品所含核酸。所用過程取決于樣品，靶核酸假定從中分離且包括但不限于機械破壞、化學破壞、添加蛋白裂解酶、去污劑等以實現破壞、分別裂解樣品。裂解物還可在進行結合步驟a)前澄清或另外加工。合適裂解/破壞方法和裂解緩沖液為現有技術已知，因而在此不需要描述。此外，能進行額外加工步驟，例如一種或多種耗盡以移出非靶核酸或其他不需要組分和/或核酸或其他樣品所含生物分子可在步驟a)使靶核酸結合基于柱的核酸結合固相前進行修飾。此外，如果特定樣品如包埋樣品根據本發明方法加工，優選包括步驟以從包埋基質(如從石蠟)釋放核酸和/或樣品。另外，在特定樣品如固定和交聯樣品根據本發明方法加工的情況中，優選還包括步驟以從固定樣品釋放核酸并因而例如逆轉固定步驟引起的修飾，特定用于移出交聯。例如，在樣品所含核酸是例如交聯的如FFPE樣品情況中，能進行額外步驟如加熱步驟。實現所述結果和獲得能分離靶核酸的樣品的合適方法和加工步驟為現有技術已知且還例如描述于EP10001995.9,PCT/EP2011/000920和W02007/068764，所述專利通過引用納入本文。根據一個實施方式，樣品包含至少一種非祀核酸和至少一種祀核酸。根據一個實施方式，本發明所述方法包含移出至少一部分非靶核酸的步驟。例如，移出非靶核酸能通過使至少一部分非靶核酸在合適條件下結合固相和隨后分開結合固相的非靶核酸與含靶核酸的剩余樣品。這能通過例如在合適條件下添加適當固相來實現，其中非靶核酸主要結合固相。從靶核酸中選擇性移出非靶核酸的合適方法例如描述于EP0880537和W095/21849，所述專利通過引用納入本文。其他方法包括例如苯酚和/或氯仿提取，如用于濃縮隨后使用的水相中的RNA，優選混合有醇，用于使RNA結合步驟a)的膜。從固定樣品如FFPE樣品分離靶核酸(或平行的RNA和DNA)時，適于分開靶核酸與非靶核酸(特定用于分開DNA與RNA)的其他方法描述于EP10001995.9和PCT/EP2011/000920，所述專利通過引用納入本文。意在分離(僅)RNA為靶核酸時，非靶核酸通常是DNA。在此實施方式中，DNA酶消化優選在步驟b)中進行以移除、分別減少DNA污染。此外，意在分離DNA為靶核酸時，RNA酶消化能如步驟b)所進行以移除、分別減少RNA污染。膜用作核酸結合固相時，各膜上處理引起顯著量的靶核酸且特定是小靶核酸釋放。如上面和示例所述，其他非靶核酸還能平行分離。根據一個實施方式，樣品包含至少一種靶核酸和至少一種非靶標生物分子，如蛋白、脂質、碳水化合物或代謝物。根據一個實施方式，本發明所述方法包含移出至少一部分非靶標生物分子的步驟。例如，移出非靶標生物分子能通過使至少一部分非靶標生物分子在合適條件下結合固相和隨后分開結合固相的非靶標生物分子與含靶核酸的剩余樣品。這能通過例如在合適條件下添加適當固相來實現，其中非靶標生物分子主要結合固相。適于分開祀核酸與非祀標生物分子的其他方法包括通過化學或酶反應移出非祀標生物分子，其也能在例如步驟b)中于膜上完成(參見例如DE 10 2007 035 250)。影響例如非靶標生物分子的合適DNA酶和RNA酶以及能用于進行步驟b)中各酶反應的緩沖液和溶液為現有技術已知并因而不需要詳細描述。本發明涉及步驟a)中應用柱所含核酸結合固相。本文所用的術語“柱”特定描述具有至少2個開口的容器。因此，溶液和/或樣品能通過所述柱。術語“柱”具體不指示涉及容器形狀的任何限制，所述容器能為例如圓形或角形，優選圓柱形。然而，還能使用其他形狀，特別是在使用多柱時。柱包含核酸結合固相。所述柱包含的所述固相應允許溶液在應用于柱時分別通過樣品。這意味著如果例如將離心力應用于柱，溶液和/或樣品能以離心力方向通過柱。如上所討論，用各基于柱的核酸分離過程時，所述樣品常例如由離心或真空輔助通過柱，核酸在所述通過中結合所含核酸固相。柱能采用單一模式或多模式。所述具有與多孔板類似形式且包含核酸結合固相如膜的多柱為現有技術熟知。柱優選是離心柱。

作為核酸結合固相，能使用通常用于基于柱的核酸分離過程的任何固相。優選地，步驟a)使用核酸結合膜和因而能結合核酸的膜。合適膜包括但不限于親水膜、疏水膜和經離子交換結合核酸的膜。示例包括但不限于二氧化硅膜、玻璃纖維膜、尼龍膜、纖維素膜如硝酸纖維素膜、改性纖維素膜(如乙酰-或羥基)、紙膜，特定是改性紙。所述膜優選為多孔。此外，優選使用包含硅石或由其組成的膜。柱所含其他普通核酸結合固相填充有核酸結合顆粒如硅粒子或核酸結合材料層(如硅膠)。例如，硅粒子能排列成惰性濾器或膜上的層，從而形成核酸結合固相。核酸結合固相越薄，關于靶核酸損失且特定是小靶核酸損失的上述問題越突出。這是因為柱所含薄層核酸結合固相(類似核酸結合膜)增加所釋放小靶核酸能迅速逃逸并因而在核酸分離過程中喪失的風險。如上所述，本發明提供該問題的解決方案并從而能以高產量分離包括小靶核酸在內的靶核酸。因此,根據一個實施方式,柱所含核酸結合固相具有等于或小于其寬度的總高度。例如，核酸結合固相可由核酸結合材料層和/或各核酸結合顆粒優選硅粒子填充層構成，其作為小層應用于膜或濾器上。合適核酸結合材料和顆粒詳述于下。為緩和樣品通過柱所含核酸結合固相，能使用合適方式如離心或應用壓差產生裝置，所述裝置例如擠壓樣品通過柱、各核酸結合固相或通過應用真空吸取樣品通過核酸結合固相。各方式為現有技術熟知并因而不需要在此進一步描述。作為可用于步驟的d)的核酸結合固相，可使用能結合核酸且特定是小靶核酸的任何材料，包括多種能在合適條件下結合核酸的材料。所述用于步驟的d)固相不需基于柱，盡管這就便于操作而言優選。能與本發明聯用的示例性固相包括但不限于:含硅石的化合物，包括但不限于硅粒子、二氧化硅、硅藻土、玻璃、烷基硅、硅酸鋁、和硼硅酸鹽；硝酸纖維素；重氮化紙；羥磷灰石(也稱為羥基磷灰石)；尼龍；金屬氧化物；氧化鋯；氧化鋁；聚合物支持體、二乙氨乙基-和三乙氨乙基-衍生支持物、疏水色譜樹脂(如苯基-或辛基-瓊脂糖凝膠)等。術語固相不意在指涉及其形式或設計的任何限制。因此，術語固相涵蓋的合適材料為多孔或無孔；透性或不透性；包括但不限于膜、濾器、片、顆粒、磁性顆粒、珠、凝膠、粉末、纖維等。根據一個實施方式，固相如用于步驟d)的硅固相或用于步驟a)的核酸結合固相的表面不修飾且例如不用官能團修飾。如上所述，優選核酸結合膜用于步驟d)。所述膜可具有與上述步驟a)所用核酸結合膜相同的特性。特別優選與步驟a)所用相同的核酸結合膜用于使“逃逸”小靶核酸重結合步驟d)的所述膜。進行本文所述以外的額外中間步驟也在本發明范圍內。然而，根據某些實施方式，沒有進行本文所述以外的額外步驟。此外，本發明涉及應用能使小核酸結合膜的回收溶液，以重結合膜上處理中從所述核酸結合膜釋放的所收集小核酸。如上所討論，核酸優選收集為流出物以確保例如膜下滑動的小核酸也被有效收集并因而回收。引起小靶核酸釋放的回收溶液和條件細節如上描述，參考上面的公開內容。此外，本發明涉及運行本發明所述方法的試劑盒，包括:a)柱中所含的核酸結合固相，優選膜；b)含有離液劑和醇的結合緩沖液，用于使包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述核酸結合固相； c)回收溶液，包含濃度為0，IM多至飽和極限，優選0，5M多至飽和極限的離液劑和濃度為至少50%的醇；和d)運行本發明所述方法的說明書。回收溶液、核酸結合固相(優選膜)和結合緩沖液以及相關優勢的詳細說明如上描述，參考上面的公開內容。
實施例實施例1:根據本發明或參考方法分離小核酸使用來自大鼠腎的FFPE樣品(樣品在固定后保存并室溫包埋2個月)和獲自大鼠肺的FFPE樣品(樣品在固定后保存并室溫包埋27個月)。用切片機(Microtom)獲得大小為ΙΟμπι厚的切片。每個樣品使用一個切片。所有樣品加工2次。對于所得FFPE切片的后續RNA分離，使用RNeasy FFPE試劑盒(恰根(QIAGEN))和QIAamp FFPE試劑盒(恰根)組分。為從樣品中移除石蠟，樣品在Iml庚烷中孵育I小時。加入50 μ I甲醇，混合，離心樣品，收集上清，樣品在室溫干燥5分鐘。分別獲得的去石蠟樣品團與150μ I蛋白酶K消化緩沖液(緩沖液PKD，恰根公司)混合，此外混合10 μ I蛋白酶K溶液(>600mAU/ml)。混合物在1400rpm振蕩下56°C孵育15分鐘。樣品在冰上冷卻3分鐘并離心30分鐘以移除未溶解組分。棄去含團塊的DNA(如需要，含團塊的所述DNA能可選用于分離DNA)且收集上清以分離所含RNA為靶核酸。為排除歸因于所用樣品材料的變異，合并所收集上清、混合并分成150μ I等分樣品。隨后，這些等分樣品在80°C孵育15分鐘以移除RNA中的交聯(由FFPE保存產生)。之后，加入300 μ I離液裂解緩沖液(緩沖液RLT，恰根公司)，得到的混合物與1050 μ I乙醇混合。得到的混合物應用于二氧化娃膜(RNeasy MinElute柱,恰根)并以10.0OOrpm離心15秒來通過膜。通過使含離液劑和乙醇的洗滌緩沖液(RWT，恰根)通過膜，洗滌結合靶核酸的膜。之后，將含10 μ I DNA酶I和70 μ I DNA酶反應緩沖液(緩沖液RDD，恰根)的80 μ I混合物應用于膜并室溫孵育15分鐘以移除剩余基因組DNA。對于根據現有技術已知參考方法分離RNA，在進行膜上DNA酶消化以移除DNA酶反應溶液后再次加入含離液劑和乙醇的洗滌緩沖液(緩沖液RWT，恰根)。由于所含離液劑和醇，洗滌緩沖液RWT增強RNA與膜的結合。之后，通過2次加入500 μ I含醇的洗滌緩沖液(RPE，恰根)并通過膜，洗滌所述膜。膜通過14.0OOrpm離心5分鐘來干燥。應用30 μ I水并進行孵育步驟I分鐘后，由離心洗脫RNA。對于根據本發明方法分離RNA，進行膜上DNA酶消化后，應用含1_1，5MGTC、75%異丙醇、檸檬酸鈉，PH7的回收溶液并由離心通過膜。收集流出物且重應用并由離心通過膜。因此，膜上DNA酶消化中從膜釋放的特定小靶核酸再次結合所述膜并因而回收。之后，通過2次加入500 μ I含醇的洗滌緩沖液(RPE，恰根)并通過膜，洗滌所述膜。膜通過在14.0OOrpm持續5分鐘的離心步驟來干燥。應用30 μ I水并進行孵育步驟I分鐘后，由離心洗脫RNA。用安捷倫生物分析儀分析從腎組織分離的RNA大小分布以證明用本發明所述方法實現的改進。應用相同 量的RNA (以ng計)(由OD測量測定)。結果示于圖1，其中“ + ”鑒定用本發明所述方法分離的RNA且其中鑒定用參考方法分離的RNA。可見根據本發明方法進行必要收集和重應用步驟c)及d)引起所分離RNA中小靶標RNA顯著增加。這可從根據本發明方法分離的RNA中能檢測的小RNA范圍內的顯著較深條帶得到(這些條帶由圖1的箭頭標記)。因此，用本發明所述方法分離的RNA中的小RNA量相較參考方法顯著增力口。用參考方法分離的RNA僅包含少量小RNA，因此更多大RNA分子能以應用RNA量檢測。因此，此示例顯示根據本發明的方法顯著增加所分離RNA中的小RNA產量。為避免產生疑問，強調進行本發明所述方法或參考方法時，較大RNA分子總量基本相同，由檢測較大mRNA擴增子的RT-PCR所證實。還用定量實時RT-PCR分析經分離RNA以分析本發明所述方法對特定小RNA產量的有利影響。為此，采用經分離RNA測定微RNA miR29a和miR30b的擴增子，根據廠商說明書用ABI TaqMan 微RNA試驗(應用生物系統公司(Applied Biosystems))。逆轉錄反應使用20ng RNA,根據廠商說明書用TaqMan 微RNA逆轉錄試劑盒和相應引物has_miR30a及has-miR29b (應用生物系統公司)。用上述系統進行miRNA擴增子的擴增，在實時擴增系統(ABI PRISM7900HT序列檢測系統，ABI公司(ABI))中使用2μ I cDNA (1:20稀釋)。測定所測ct值的平均值(由一式兩份得到)并概括于表I。表1:根據本發明或參考方法進行RNA分離的miRNA檢測
權利要求
1.一種從樣品分離包括小靶核酸在內的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步驟: a)通過將所述樣品經過柱來使至少一部分包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述柱中含有的核酸結合固相， b)在所述靶核酸結合所述固相時對核酸結合固相進行酶和/或化學處理， c)收集所述步驟b)處理中從所述固相釋放的至少一部分小靶核酸作為流出物， d)將含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物接觸核酸結合固相，用以將所含小靶核酸結合所述核酸結合固相， e)可選進行洗脫。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，用于步驟a)的所述核酸結合固相是膜。
3.按權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟c)中回收溶液通過所述柱且收集含小靶核酸和所述回收溶液的流出物并用于步驟d)，優選用于使流出物所含的小靶核酸重結合步驟a)所用的核酸結合固相。
4.一種從樣品分離包括小靶核酸在內的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步驟: a)通過將所述樣品經過核酸結合膜來使至少一部分包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述膜， b)在所述靶核酸 結合所述膜時對膜進行涉及水溶液的處理， c)使回收溶液通過所述膜并收集含小靶核酸的流出物， d)使所述流出物通過步驟a)的膜以將所含小靶核酸重結合所述膜， e)可選從所述膜洗脫包括小核酸在內的靶核酸。
5.按權利要求1-4中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述酶和/或化學處理在步驟b)中進行，包含使用水溶液且選自核酸酶消化步驟、蛋白消化步驟、脂酶消化步驟和靶核酸修飾步驟。
6.按權利要求1-5中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述步驟b)中進行的處理涉及引起至少部分靶核酸，尤其是小靶核酸從所述核酸結合固相釋放的條件。
7.按權利要求1-6中一項或多項所述的方法,其特征在于,所述回收溶液具有一種或多種下列特征: a)提供適于使小核酸結合步驟d)所用的核酸結合固相的條件； b)就結合小核酸而言，提供比步驟a)所用的結合條件更強的結合條件； c)提供適于使小RNA結合步驟d)所用的核酸結合固相的條件； d)提供適于使小DNA結合步驟d)所用的核酸結合固相的條件； e)包含至少一種離液劑和/或至少一種醇；和/或 f)包含至少一種濃度為O，1-6M，優選O，5-6M的離液劑和/或至少一種濃度為至少50%v/V的選自乙醇和異丙醇的醇。
和/或 其中用于步驟d)的結合條件具有一種或多種下列特征: a)適于使小核酸結合步驟d)所用的核酸結合固相； b)就結合小核酸而言，提供比步驟a)所用的結合條件更強的結合條件； c)適于使小RNA結合步驟d)所用的核酸結合固相； d)適于使小DNA結合步驟d)所用的核酸結合固相；g)包含至少一種離液劑和/或至少一種醇；和/或 h)包含至少一種濃度為O，1-6M，優選O，5-6M的離液劑和/或至少一種濃度為至少50%v/V的選自乙醇和異丙醇的醇。
8.按權利要求1-7中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述步驟b)中，若所述靶核酸是RNA則進行DNA酶消化，若所述靶核酸是DNA則進行RNA酶消化。
9.按權利要求1-8中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述步驟a)中的結合在具有一種或多種下列特征的條件下進行: a)所述條件適于使總核酸結合所述核酸結合固相； b)所述條件適于使包括小RNA在內的總RNA結合所述核酸結合固相； c)所述條件適于使包括小DNA在內的總DNA結合所述核酸結合固相；和/或 d)在至少一種離液劑和/或至少一種醇存在下發生結合。
10.根據前述權利要求1-9中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述樣品在步驟a)之前或之中裂解或加工。
11.根據前述權利要求1-10中一項或多項所述的方法，其特征在于，所述樣品包含小核酸和/或經降解的核酸。
12.根據前述權利要求1-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述樣品選自和/或衍生自選自下組的樣品:細胞、臨床樣品、體液、組織、血液、血液制品、植物、細菌、病毒、真菌、人和動物樣品材料、環境樣品、分 離核酸、裂解物、洗脫物、固定樣品、交聯樣品和FFPE樣品。
13.一種能使小核酸結合膜的回收溶液的應用，其用于重結合在膜上處理中從所述核酸結合膜釋放所收集的小核酸。
14.按權利要求13所述的應用，其特征在于，所述至少一部分小核酸在從所述膜釋放后定位于該膜下方。
15.按權利要求13或14所述的應用，其特征在于，所述回收溶液具有權利要求7所定義的一種或多種特征。
全文摘要
本發明涉及從樣品分離包括小靶核酸在內的靶核酸的方法，所述方法包括至少下列步驟a)通過將所述樣品經過柱來使至少一部分包括小靶核酸在內的靶核酸結合所述柱中含有的核酸結合固相，b)在靶核酸結合所述固相時對核酸結合固相進行酶和/或化學處理，c)收集所述步驟b)處理中從所述固相釋放的至少一部分小靶核酸作為流出物，d)將含小靶核酸的混合有回收溶液的所述流出物接觸核酸結合固相，用以將所含小靶核酸結合所述核酸結合固相，e)可選進行洗脫。本發明引起分離靶核酸中的小靶核酸產量顯著增加，因為其能有效捕獲和回收小靶核酸。
文檔編號C12N15/10GK103097532SQ201180042364
公開日2013年5月8日 申請日期2011年9月2日 優先權日2010年9月2日
發明者V·霍蘭德, G·克里斯托夫, M·施盧姆貝格爾 申請人:恰根有限公司