專利名稱：用于檢測和/或定量人類dna的方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學、診斷學領域，更具體來說屬于分析和法醫學領域。本發明還屬于核酸擴增和定量領域，更具體來說屬于DNA定量領域。
背景技術：
在所有DNA分型方法中，以及各種其他科學領域的DNA檢測中，測定從法醫樣品以及其他樣品回收的DNA的量是一個關鍵步驟。例如對于多重DNA分型試劑盒來說，為了產生最優結果，通常需要輸入的DNA在0.5至2ng的狹窄范圍內。因此，為了確保陽性結果是陽性結果和/或陰性結果是由不存在DNA造成的陰性結果，DNA的定量是絕對重要的。此夕卜，法醫DNA測試實驗室的質量標準要求人類特異性的DNA定量。這是由于分離技術可能將人類DNA與細菌和其他外源DNA —起回收而造成的。已經開發了允許對人類特異性DNA進行定量的許多方法步驟，包括初始印跡(start-blot)技術、基于液體的雜交測定法和實時PCR (聚合酶鏈反應)。目前，由于實時PCR的動態范圍寬并且易于自動化，實時PCR是主導技術。現代的STR試劑盒已變得靈敏得多，并且即使使用少量DNA也能獲得良好結果。因此，對于允許精確和準確定量甚至低濃度樣品中的人類DNA的方法、試劑盒和核酸區域存在著需求。已經有某些定量和檢測試劑盒可用，然而它們具有嚴重的缺點。一種這樣的試劑盒是 Quantifiler Human 試劑盒(Applied Biosystems),另一種試劑盒是 QuantifilerDuo試劑盒(Applied Biosystems),另一種試劑盒是Plexor HY實時PCR定量試劑盒(Promega)0 Quantifiler Duo試劑盒和Plexor HY試劑盒兩者都祀向基因組上的常染色體和性染色體(Y染色體)靶標。所述試劑盒的缺點:根據LaSalle等，(Forensic ScienceInternational:Genetics, “通過實時聚合酶鏈反應進行DNA定量的單拷貝和多拷貝方法的分析，’ (Analysis of Single and Mult1-copy Methods for DNA Quantification byReal-Time Polymerase Chain Reaction)),與 Plexor HY 相t匕，Quantifiler 試齊[J盒在定量中更準確，但是具有較低的動態范圍。Plexor HY由于擴增多拷貝靶標而提供較高的動態范圍，但是準確性較低。這種較低的準確性可以歸因于多拷貝靶標。如果由于例如靶標拷貝數的不穩定性，擴增少于基因組上全套20個拷貝，那么常染色體與性染色體(Y)靶標之間的擴增比率可能發生變化。Plexor HY試劑盒的動態范圍略好于其他試劑盒(LaSalle等，Forensic Science International:Genetics, “通過實時聚合酶鏈反應進行DNA定量的單拷貝和多拷貝方法的分析”(Analysis of Single and Mult1-copy Methods for DNAQuantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction))。在統計學t匕較中，LaSalle等證實了這兩種試劑盒之間的顯著差異。法醫學中的另一個重要參數是必須進行分析的DNA的降解等級。由于Quantifiler Human和PlexoHY試劑盒的擴增子的大小從62至133個堿基對(bp)不等，因此當將試劑盒應用于降解的DNA時， 預期可能存在顯著差異。
發明概述本發明解決了上面指出的問題，并提供了如下所概述的以下解決方案。一方面，本發明涉及用于定量和/或檢測樣品中基因組的一個或多個核酸的方法，其中a.對所述核酸進行擴增，并且被擴增的基因座是基因組中的多拷貝基因座，b.所述多拷貝基因座在至少兩個不同的染色體上具有拷貝，c.并且對擴增產物進行檢測和/或定量。這種新方法與現有方法相比的一個顯著優點是更高的靈敏度和被檢測靶標的更高穩定性。其他以前已知的靶標在不同個體之間可能存在變化，這是由于重復元件傾向于在數目上變化(Pavelitz等，人類U2snRNA基因在分裂中期表現出永久性開放的轉錄狀態和啟動子角軍體(Human U2snRNA Genes Exhibit a Persistently Open TranscriptionalState and Promoter Disassembly at Metaphase), Molecular and CellularBiology, 20081, p.3573-3588 ;Liao等，編碼人類U2snRNA的串聯重復基因(RNU2基因座)的協同進化參與快速染色體內均勻化和稀有的染色體間基因轉變(Concerted evolution ofthe tandemly repeated genes encoding human U2snRNA(the RNU21ocus)involves rapidintrachromosomal homogenization and rare interchromosomal gene conversion),The EMBO Journal, Vol.16, N0.3, pp.588, 598, 1997 ； Jasinska 等，塑造人類轉錄組的重復序列(Repetitive sequences that shape the human transcriptome), FEBS Letters567(2004) 136-141)。理想情況下，所述基因座不是重復元件例如短的串聯重復序列，或本身不是具有下式的元件:(AwCxGyTz) 2-1_，其中W、X、y和z可以在O至10之間變化,并表示該單元中存在的核苷酸數目。所述單元可以被重復2至1000次。另一種重復元件是通常在端粒內的衛星DNA。其他也不適合的重復元件是短散在核元件(SINE)和長散在核元件(LINE)。此外，本發明涉及基因組中的多拷貝基因座用于檢測和/或定量所述基因組的核酸的用途，其中所述多拷貝基因座不是重復元件并在至少兩個不同的染色體上具有拷貝。此外，本發明涉及用于檢測和/或定量人類核酸的試劑盒，其中所述試劑盒包含引物，所述引物在嚴緊的條件下與在80個堿基對的區段上與SEQ ID N0.1或52的序列具有至少80%序列同一性的序列結合。在本文中使用下列縮寫:(1)HDA (解鏈酶依賴性擴增)，(2) PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)，(3)gDNA (基因組DNA)，(4)FAM (6-羧基熒光素)，(5) SNP (單核苷酸多態性)，(6)NTC (無模板對照)，(7) BHQ (黑洞淬滅劑)，(8) qPCR (定量PCR)，(9) HEX (6-羧基-4，7，2’，4’，5’，7’ -六氯熒光素)。發明詳述用于定量和/或檢測樣品中基因組的一個或多個核酸的方法，其中a.對所述核酸進行擴增，并且被擴增的基因座是基因組中的多拷貝基因座，b.所述多拷貝基因座在至少兩個不同的染色體上具有拷貝，c.并且對擴 增產物進行檢測和/或定量。令人驚訝的是，本發明人發現，當用于核酸的檢測和/或定量時，不是重復元件的多拷貝基因座優于其他基因座。眾所周知，在不同個體之間重復元件的拷貝數可能不同。因此，本發明優選涉及本文中引述的方法，其中所述多拷貝基因座不是重復元件。總的來說，這些核酸可以具有原核或真核等任何來源。優選情況下，它們是哺乳動物的，更優選為人類的。這是因為本發明的一個極大優點是其在法醫學領域中的應用。一個這樣的序列被顯示在SEQ ID N0.1中，另一個序列顯示在SEQ ID N0.52中。事實上，SEQ ID N0.1是SEQ ID N0.52的一部分。本發明人已令人吃驚地發現，該序列和/或與其具有序列相似性的序列可以在人類基因組中被多次找到。因此，理想情況下使用與這些序列結合的引物和/或探針。
權利要求
1.用于定量和/或檢測樣品中基因組的一個或多個核酸和/或用于分析人類DNA的可能的降解狀態和/或用于分析拷貝數變異(CNV)的方法，其中 a.對所述核酸進行擴增，并且被擴增的基因座是基因組中的多拷貝基因座， b.所述多拷貝基因座在至少兩個不同的染色體上具有拷貝， c.并且對擴增產物進行檢測和/或定量，并且 d.所述多拷貝基因座不是重復元件。
2.權利要求1的方法，其中所述基因座與SEQID N0.1或SEQ ID N0.52的序列在80個堿基對的區段上具有至少80%的序列同一性。
3.權利要求1或2的方法，其中所述多拷貝基因座的至少4個不同拷貝被擴增。
4.權利要求1至3的方法，其中擴增方法是非等溫法或等溫法。
5.權利要求4的方法，其中所述擴增方法選自定量實時PCR(rtPCR)、連接酶鏈反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)、多重置換擴增(MDA)、滾環擴增(RCA)、環介導的等溫擴增(LAMP)、轉錄介導的擴增(TMA)、解鏈酶依賴性擴增(HDA)、SMART擴增法(SMAP)、單引物等溫擴增(SPIA)、切口酶擴增反應(NEAR)、指數擴增反應(EXPAR)、重組酶聚合酶擴增(RPA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。
6.權利要求5的方法，其中所述擴增方法是解鏈酶依賴性擴增(HDA)或實時PCR(rtPCR)o
7.前述權利要求任一項的方法，其中所述擴增產物的長度在60個堿基對和200個堿基對之間。
8.前述權利要求任一項的方法，其中用于擴增的引物具有在18個核苷酸的區段上與SEQ ID N0.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12的差異不超過5個核苷酸的核苷酸序列。
9.基因組中的多拷貝基因座用于檢測和/或定量所述基因組的核酸、用于分析人類DNA的可能的降解狀態或作為參比基因用于拷貝數變異(CNV)分析的用途，其中所述多拷貝基因座在至少兩個不同的染色體上具有拷貝。
10.權利要求9的用途，其中所述基因座與SEQID N0.1或SEQ ID N0.52的序列在80個堿基對的區段上具有至少80%的序列同一性。
11.用于檢測和/或定量人類核酸的試劑盒，其中所述試劑盒包含引物，所述引物在嚴緊的條件下與在80個堿基對的區段上與SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.52的序列具有至少80%的序列同一性的序列結合。
12.權利要求11的試劑盒，其中所述試劑盒中至少一個引物具有在18個核苷酸的區段上與SEQ ID N0.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12的差異不超過5個核苷酸的核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及用于檢測和/或定量樣品中基因組的一個或多個核酸的方法、試劑盒和各種核酸序列的用途。其中對所述核酸進行擴增，并且被擴增的基因座是基因組中的多拷貝基因座，所述多拷貝基因座在至少兩個不同的染色體上具有拷貝，并對擴增產物進行檢測和/或定量。
文檔編號C12Q1/68GK103180460SQ201180045929
公開日2013年6月26日 申請日期2011年9月22日 優先權日2010年9月23日
發明者安迪·溫德, 弗蘭切斯卡·迪帕斯奎爾, 薩比恩·韋爾納, 薩沙·斯特勞布 申請人:凱杰有限公司