專利名稱：一株產果聚糖蔗糖酶的菌株及用該酶生產果聚糖的方法
技術領域：
本發明涉及能夠生產果聚糖蔗糖酶的一種新微生物菌株及其培養發酵生產果聚糖蔗糖酶，并將該酶用于生物制備果聚糖的方法，屬于食品生物技術領域。更具體的說本發明涉及來源于土壤的甲基營養芽孢桿菌(也<^77心methylotrophicus) SK 21. 002,它能夠產生果聚糖蔗糖酶，并利用該酶催化蔗糖合成果聚糖(levan)。
背景技術：
近年來，功能食品成為廣大消費者關注的熱點，更是廣大食品從業者研發的焦點。 糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低齡化，使得低熱量、具有更多功能營養特性的功能食品配料成為關注的熱點。
果聚糖，是由D-果糖經P (2 — 6)鍵連接而成的線性直鏈多糖，聚合度(DP)為 2 90，平均在14 20，聚合度較低時(DP=2 9)則稱為低果聚糖。果聚糖可用作水溶性的膳食纖維，膠體穩定劑等，它能減少膽固醇和豬油、脂肪等動植物脂肪在人體中的吸收，加快人體對金屬離子的吸收，并能調理腸道，比如腸道雙歧桿菌的增生和限制食品工業中有毒微生物的生長，也能用作清潔劑的軟化劑，血漿添加物和化妝品的保濕劑。2001年3月， 使用果聚糖作為食品的國家有美國(FDA )、歐洲(SCF )、日本、澳大利亞和新西蘭(ANZFA )。 大多數發達國家批準果聚糖為食品原料。在日本，果聚糖被用作乳酸菌食品的原料。
因此，果聚糖作為一種功能性食品添加劑廣泛應用于低脂食品、糖果、糕點等食品。
酶法合成是工業化生產果聚糖的主要途徑。酶法合成果聚糖的產率受多種因素影響，酶的來源直接影響酶法合成的果聚糖的結構和產率。迄今為止，已發現多種微生物可以產生此酶，其中主要集中在解淀粉芽孢桿菌{Bacillus amyIoIiquefaciens、、'運_另]發_ 酵單胞菌QZytnotnonas mobi/is )、枯草芽抱桿菌iBaciIlus sub )、多粘類芽抱桿菌 {PaenibadIlus polymyxa^{Actinomyces iscosus、。
本發明人深入調查和研究了現有技術并對各種高收率生產果聚糖的方法進行了研究，最終我們篩選到一株能產生果聚糖蔗糖酶的新微生物，證明了通過此酶與高濃度的蔗糖反應能得到高轉化率的果聚糖，并通過濃縮干燥等手段得到果聚糖的糖漿或粉末。基于上述發現提出了本發明。發明內容
本發明的目的是提供一種新的微生物，它能夠生產高酶活的果聚糖蔗糖酶。
本發明的另一個目的是提供一種該果聚糖蔗糖酶與高濃度蔗糖溶液反應的方法， 以得到高轉化率的果聚糖。
本發明的再一個目的是提供一種果聚糖提純與精制的方法，以得到高濃度果聚糖糖漿或粉末。
為了實現上述目的，本發明提供一株來源于土壤的甲基營養芽孢桿菌me thyIo trophi cus ) SK21. 002,其為能夠產生果聚糖鹿糖酶的菌株,并利用該果聚糖鹿糖酶轉化蔗糖生成果聚糖。
本發明的技術方案一株產果聚糖蔗糖酶的菌株，其分類命名為甲基營養芽孢桿菌{Bacillus me thyIo trophi cus ) SK21. 002,已保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏編號為 CCTCC NO M 2011476。
用所述的微生物甲基營養芽孢桿菌CCTCC NO M 2011476，發酵生產果聚糖蔗糖酶的方法，步驟為(1)種子培養種子培養基酵母膏l-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-40g/L，pH6. 0-8. 0，去離子水配制；種子培養條件菌株于30-37 °C、150-250rpm的振蕩速度下在種子培養基中培養 10-20h活化該菌株；(2)發酵培養發酵培養基酵母膏l_20g/L，蛋白胨l-20g/L，蔗糖l-30g/L，pH6. 0-8. 0，去離子水配制；發酵條件接種量1%_10%，30-37°C、攪拌速度100-700rpm、空氣流量0. 1-1. Ovvm的條件下在發酵培養基中發酵10-48h生產果聚糖蔗糖酶；(3)發酵后處理發酵液經冷凍離心后收集上清液即為粗酶液，經檢測酶活達到l_50U/mL ；所得粗酶液進一步超濾濃縮，或用硫酸銨沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶的粗酶粉。
用制備的果聚糖蔗糖酶轉化蔗糖生產果聚糖的方法，向底物蔗糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶進行催化轉化生產果聚糖，轉化條件為蔗糖溶液的蔗糖質量濃度為10%-50%，果聚糖蔗糖酶添加量0. 5-50U/g蔗糖，pH4. 0-8.0，轉化反應溫度為40_60°C，轉化反應時間 24-72h，轉化率可達10%以上，得到含有果聚糖的酶反應液，進一步加工處理用來制備果聚糖糖漿或果聚糖粉末。
果聚糖糖漿的制備方法，步驟為(1)脫色在含有果聚糖的酶反應液中添加酶反應液固形物質量含量0. 2%-2. 0%的活性炭,在 50-80°C下溫育10-60min，然后進行硅藻土過濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發濃縮至固形物質量含量為10%-70%，即得果聚糖糖漿。
果聚糖粉末的制備方法，步驟為(1)脫色同果聚糖糖漿制備所述的脫色步驟；(2)濃縮將脫色液真空蒸發濃縮至固形物質量含量為10%-70%的濃縮液；(3)噴霧干燥控制進風溫度150-200°C、出風溫度50-100°C，將果聚糖濃縮液噴霧干燥，得到果聚糖粉末。
本發明的有益效果本發明涉及一株從土壤中篩選而來的甲基營養芽孢桿菌 {Bad Ilus me thy I o trophi cus) SK 21. 002,以此甲基營養芽孢桿菌為發酵菌株，以鹿糖為碳源、酵母浸出物和蛋白胨為氮源等組成發酵培養基，發酵生產果聚糖蔗糖酶，發酵后經檢測，在發酵液中酶活達到l_50U/mL。將該果聚糖蔗糖酶添加到質量濃度10%-50%蔗糖溶液中催化合成果聚糖，轉化24-72h，轉化率達10%以上。本發明方法生產的果聚糖產品安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性食品配料。
生物材料樣品保藏一株產果聚糖蔗糖酶的菌株，其分類命名為甲基營養芽孢桿儀{Bacillus me thy I o trophi cus) SK 21. 002,已保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱 CCTCC，地址中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO M 2011476，保藏日期2011年12月 23日。
具體實施方式
以下是甲基營養芽孢桿菌SK21. 002進行發酵生產果聚糖蔗糖酶及酶法轉化生產果聚糖的實施實例，但本發明并不限于所列出的幾個實例。
實施例I微生物發酵產酶用SK21. 002進行培養發酵，按說明書所述的發酵條件，通過對不同發酵時間產酶的檢測，發現發酵20h后酶活已經趨于平穩，故確定發酵時間為20h左右。發酵時間對產果聚糖蔗糖酶的影響如表I所示。酶活力定義為每分鐘轉移I U mol果糖所需的酶量為一個果聚糖蔗糖酶活力單位。
酶活的測定方法HPLC法測定果聚糖的生成量。
表I發酵時間對產果聚糖蔗糖酶的影響時間(h)691215182022果聚糖蔗糖酶酶活(U/mL)0. 56I. 26I. 49I. 62I. 902. 892. 62實施例2酶法轉化蔗糖生成果聚糖向質量濃度20%蔗糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶催化轉化，轉化條件為底物蔗糖質量濃度為20%，pH7. 0，果聚糖蔗糖酶添加量0. 5-50U/g蔗糖，轉化反應溫度為50°C，轉化反應時間48h。
實施例3果聚糖糖漿的制備(1)脫色在含有果聚糖的酶反應液中添加酶反應液固形物質量含量0. 2%-2. 0%的活性炭,在 50-80°C下溫育10-60min，然后進行硅藻土過濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發濃縮至固形物質量含量為20%-70%，即得果聚糖糖漿。
實施例4果聚糖粉末的制備(I)脫色同實施例3的脫色條件。
(2)濃縮將脫色液真空蒸發濃縮至固形物質量含量為10%-70%的濃縮液；(3)噴霧干燥控制進風溫度150-200°C、出風溫度50-100°C，將果聚糖濃縮液噴霧干燥，得到果聚糖粉末。
權利要求
1.一株產果聚糖蔗糖酶的菌株，其分類命名為甲基營養芽孢桿菌 methylotrophicus)^ 21. 002，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 2011476。
2.用權利要求I所述的CCTCCNO M 2011476菌株發酵生產果聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于步驟為(1)種子培養種子培養基酵母膏l-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-40g/L，pH6. 0-8. 0，去離子水配制；種子培養條件CCTCC NO M 2011476菌株于30-37°C、150-250rpm的振蕩速度下在種子培養基中培養10-20h活化該菌株；(2)發酵培養發酵培養基酵母膏l_20g/L，蛋白胨l-20g/L，蔗糖l-30g/L，pH6. 0-8. 0，去離子水配制；發酵條件接種量1%_10%，30-37°C、攪拌速度100-700rpm、空氣流量0. 1-1. Ovvm的條件下在發酵培養基中發酵10-48h生產果聚糖蔗糖酶；(3)發酵后處理發酵液經冷凍離心后收集上清液即為粗酶液，經檢測酶活達到1-50 U/mL ；所得粗酶液進一步超濾濃縮，或用硫酸銨沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到果聚糖蔗糖酶的粗酶粉。
3.用權利要求2所述方法制備的果聚糖蔗糖酶轉化蔗糖生產果聚糖的方法，其特征在于向底物蔗糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶進行催化轉化生產果聚糖，轉化條件為蔗糖溶液的蔗糖質量濃度為10%-50%，果聚糖蔗糖酶添加量0. 5-50U/g蔗糖，pH4. 0-8. 0，轉化反應溫度為40-60°C，轉化反應時間24-72h，轉化率達10%以上，得到含有果聚糖的酶反應液，進一步加工處理用來制備果聚糖糖漿或果聚糖粉末。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于果聚糖糖漿的制備方法，步驟為(1)脫色在含有果聚糖的酶反應液中添加酶反應液固形物質量含量0. 2%-2. 0%的活性炭,在 50-80°C下溫育10-60min，然后進行硅藻土過濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發濃縮至固形物質量含量為10%-70%，即得果聚糖糖漿。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于果聚糖粉末的制備方法，步驟為(1)脫色同果聚糖糖漿制備所述的脫色步驟；(2)濃縮將脫色液真空蒸發濃縮至固形物質量含量為10%-70%的濃縮液；(3)噴霧干燥控制進風溫度150-200°C、出風溫度50-100°C，將果聚糖濃縮液噴霧干燥，得到果聚糖粉末。
全文摘要
一株產果聚糖蔗糖酶的菌株及用該酶生產果聚糖的方法，屬于食品生物技術領域。本發明涉及一株從土壤中篩選而來的甲基營養芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)SK21.002，以此甲基營養芽孢桿菌為發酵菌株，以蔗糖為碳源、酵母浸出物和蛋白胨為氮源等組成發酵培養基，發酵生產果聚糖蔗糖酶，發酵后經檢測，在發酵液中酶活達到1-50U/mL。將該果聚糖蔗糖酶添加到質量濃度10%-50%蔗糖溶液中催化合成果聚糖，轉化24-72h，轉化率達10%以上。本發明方法生產的果聚糖產品安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性食品配料。
文檔編號C12N1/20GK102533605SQ20121001200
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者張濤, 李潤靜, 江波, 沐萬孟, 繆銘 申請人:江南大學