一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法

專利名稱：一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法
技術領域：
本發明涉及一種納豆芽孢桿菌，尤其涉及一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
納豆芽孢子桿菌是1905年東京大學的澤村教授(Sawamura)從納豆中首次發現并分離出來的，并將該菌株命名為Bacillus natto Sawamura0此后于1946年經美國Smith 等人的研究，認為納豆芽孢桿菌應屬于枯草桿菌的亞種，因此，此后，在分類上將納豆菌歸屬于枯草桿菌。但由于納豆菌的維生素要求性或以Y-聚谷氨酸為主要成分的粘質物生產特性，以及噬菌體的感染特異性顯然與枯草桿菌不同，故還是將納豆菌與枯草桿菌區別，使用納豆芽抱桿菌(Bacillus subtilis natto 或 Bacillus natto)的名稱。納豆芽孢桿菌能夠產生多種酶，能分解脂肪、碳水化合物、蛋白質等大分子物質， 從而使用于發酵時發酵產品中含有豐富的寡聚糖、有機酸、氨基酸等多種容易被人體吸收的成分。因此，具有較高的營養保健等功效。納豆芽孢桿菌還具有抗菌活性的作用，納豆芽孢桿菌抗菌代謝產物對人體或畜牧均無毒副作用，因此，可作為天然的防腐劑來開發應用。 如將它運用在食品添加劑方面，其作用可相當于防腐劑，由于其無毒無副作用，特別適合廣大消費者對天然食品防腐劑這一特點的要求。雖然納豆芽孢桿菌具有較多的優點，但是由于其抗菌性能存在效果不佳的缺陷，在應用上存在一定的限制性。

發明內容
本發明針對以上現有技術中存在的缺陷，提供一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，該方法具有提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的目的。本發明的目的之一是通過下列技術方案來實現的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，該方法包括以下步驟A、活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成菌懸液；B、復合誘變取上述菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop的菌懸液，振搖，放入無菌平皿內，進行長波紫外線輻照，然后將上述經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后，涂布于平板培養基上進行培養，生長成熟后，挑選正常型單菌落接種到斜面培養基進行培養，在培養溫度為25°C 35°C的條件下培養40 60小時，得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；C、種子培養將上述步驟B中誘變后的納豆芽孢桿菌菌體接種到液體種子培養基進行搖床培養，培養溫度為25°C 35°C，培養時間為24 48小時，培養結束后得到種子液；D、發酵培養將上述步驟C中得到的種子液接種到液體發酵培養基中進行搖床培養，培養溫度為28 35°C，培養時間為36 60小時，培養結束后得到發酵液；
E、提取、篩選將上述的發酵液進行離心分離，提取上清液，對上清液進行檢測分析，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。本發明的上述一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法中所述的納豆芽孢桿菌的保藏編號為=CGMCC 1. 1086。所述的斜面培養基及平板培養基都是采用本領域常規的培養基，所述的斜面培養基及平板培養基均為普通營養肉湯瓊脂培養基。所述的普通營養肉湯瓊脂培養基中含有以下組份的質量含量蛋白胨10. Og/L ；牛肉膏粉3. Og/L ；氯化鈉 5. Og/L ；瓊脂14. Og/L ；pH值為7. 2士0. 2 ；其余為蒸餾水。上述所述的液體種子培養基為 LB液體培養基。所述的LB液體培養基中含有以下組份的質量含量胰蛋白胨10g/L ；酵母提取物5g/L ；氯化鈉10g/L ；調節pH值為7. 0，其余為蒸餾水。利用本發明的方法對納豆芽孢桿菌進行誘變培養后，并通過對誘變后的納豆芽孢桿菌進行篩選，通過對其代謝產物的抗菌性能進行檢測分析，確定具有高抑菌性能的誘變后的納豆芽孢桿菌，上述步驟C至步驟E實質上是對誘變后的納豆芽孢桿菌的篩選，通過篩選后得到誘變后的納豆芽孢桿菌具有更高的抗菌性能，有利于提高其在產業上的應用。上述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法步驟A中所述的菌懸液的濃度為 IO7 IO8個細胞/mL。上述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法步驟B中所述的含8-Mop的菌懸液中8-Mop的質量濃度為1. 0% 7. 0%。采用上述濃度的含8-Mop的菌懸液能夠更好的實現誘變效果，并與長波紫外線輻照相結合，達到復合誘變的效果，從而提高納豆芽孢桿菌的抑菌活性，所述的8-Mop是8-甲氧基補骨脂素的簡寫。作為進一步的優選，所述的含8-Mop 的菌懸液中8-Mop的質量濃度為3. 0% 5. 0%。8-甲氧基補骨脂素具有光敏性，紫外輻照下突變效果更好。上述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法步驟B中所述的長波紫外線輻照的時間為^ 12 。長波紫外線輻照是為了對納豆芽孢桿菌進行誘變，提高納豆芽孢桿菌的抑菌性能，同時與8-Mop相結合使用，起到復合誘變的效果。作為進一步的優選，所述的長波紫外線輻照的時間為4 85s。上述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法步驟B中所述的挑選正常型單菌落接種到斜面培養基進行培養，所述的培養溫度為 30°C的條件下培養45 48小時。上述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法步驟C中所述的培養溫度為 30°C，培養時間為30 40小時。上述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法步驟D中所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨1 5g/L ；酵母膏1 20g/L ；玉米漿1 10g/L ； 葡萄糖5 15g/L ；甘油5 30g/L ；可溶性淀粉5 20g/L ；CaCO3 5 8g/L ；NaCl 2 5g/L ；pH值為7. 0 7. 4 ；其余為蒸餾水。作為進一步的優選，所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨3 4g/L ；酵母膏4 10g/L ；玉米漿3 6g/L ；葡萄糖8 12g/L ；甘油10 15g/ L ；可溶性淀粉10 15g/L ；CaCO3 6 7g/L ；NaCl 3 4g/L ；pH 值為 7. 0 7. 4 ；其余為蒸餾水。上述所述的以上清液進行檢測分析，是采用杯盤法對上清液的抗菌活性進行測定，即以大腸桿菌作為指示菌，在盛有普通營養肉湯瓊脂培養基的平皿上涂上濃度為IO6 IOVmL的指示菌懸液，放置牛灃杯，直接吸取上述提取得到的上清液200ul至牛灃杯中，在 37°C的條件下培養M小時，觀察抑菌圈狀況，測定透明抑菌圈直徑。從而確定其抗菌活性， 從而實現篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。綜上所述，與現有技術相比，本發明具有以下優點1.本發明的方法所用的原料易得，設備簡單，成本低廉，且工藝過程簡單，有利于工業化生產。2.本發明的方法所得到的納豆芽孢桿菌抑菌性能高，對其篩選過程中產生的代謝產物進行檢測分析，即對提取得到的上清液進行檢測分析，其抗菌活性能夠達到出發納豆芽孢桿菌菌株的抗菌性能的1. 2 1. 5倍左右。
具體實施例方式下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步具體的說明，但是本發明并不限于這些實施例。以下實施例中所述的斜面培養基及平板培養基均采用普通營養肉湯瓊脂培養基; 所述的普通營養肉湯瓊脂培養基中含有以下組份的質量含量蛋白胨10. Og/L ；牛肉膏粉3. Og/L ；氯化鈉5. Og/L ；瓊脂14. Og/L ；pH值為7. 2士0. 2 ；其余為蒸餾水。所述的普通營養肉湯瓊脂培養基的配制方法為本領域的常規方法。以下實施例中所述的液體種子培養基為LB液體培養基，所述的LB液體培養基中含有以下組份的質量含量胰蛋白胨10g/L ；酵母提取物5g/L ；氯化鈉10g/L ；調節pH值為7. 0，其余為蒸餾水。所述的LB液體培養基的配制方法為本領域的常規方法。以下實施例中所述的納豆芽孢桿菌菌種是購買自江蘇綠科生物技術有限公司，所述的納豆芽孢桿菌菌種的保藏編號為CGMCC1. 1086。實施例1活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，在室溫下，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成濃度為IO7 IO8個細胞/mL菌懸液；復合誘變取上述濃度的菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop濃度為2. 2mg/mL的菌懸液，振搖1.證后，吸取4mL放入至無菌平皿內，進行長波紫外線輻照65s，然后將經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后，涂布于平板培養基上進行培養，待生長成熟后挑選正常型單菌落接種到斜面培養基進行培養，在培養溫度為30°C的條件下培養4 后， 得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；種子培養挑取幾環上述的誘變后的納豆芽孢桿菌菌體接種到裝有30mL液體種子培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度30°C，搖床轉速為150rpm的條件下培養 36小時，培養結束后得到種子液；發酵培養取上述得到的種子液2mL接種到裝有30mL液體發酵培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度^°C，搖床轉速ISOrpm的條件下培養48小時，培養結束后得到發酵液；所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨:4g/L ；酵母膏:2g/L ；玉米漿:2g/L ；葡萄糖:10g/L ；甘油:5g/L ；可溶性淀粉:15g/L ；CaCO3 :8g/L ；NaC 1 :3g/L ；初始pH值為7. 4 ；其余為蒸餾水。提取將上述的發酵液在轉速為IOOOOrpm的條件下，離心分離25m i η,提取上清液，對上清液進行檢測分析，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。將上述上清液的抑菌性進行檢測分析，采用杯盤法進行測定，即以大腸桿菌作為指示菌，在盛有普通營養肉湯瓊脂培養基的平皿上涂上濃度為IO6 IO7AiL的指示菌懸液， 放置牛灃杯，直接吸取上述提取得到的上清液200u 1至牛灃杯中，在37°C的條件下培養 M小時，觀察抑菌圈狀況，測定透明抑菌圈直徑，抗菌活性同出發菌株的抗菌活性相比提高 1. 28 倍。實施例2活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，在室溫下，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成濃度為IO7 IO8個細胞/mL菌懸液；復合誘變取上述濃度的菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop濃度為4. 2mg/mL的菌懸液，振搖1. Oh后，吸取4mL放入至無菌平皿內，進行長波紫外線輻照45s，然后將經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后，涂布于平板培養基上進行培養，待生長成熟后挑選正常型單菌落接種到斜面培養基進行培養，在培養溫度為35°C培養40小時后，得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；種子培養挑取幾環上述的誘變后的納豆芽孢桿菌菌體接種到裝有30mL液體種子培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度^°C，搖床轉速為150rpm的條件下培養 40小時，培養結束后得到種子液；發酵培養取上述得到的種子液3ml接種到裝有30mL液體發酵培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度32°C，搖床轉速150rpm的條件下培養48小時，培養結束后得到發酵液；所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨:5g/L ；酵母膏:lg/L ；玉米漿:4g/L ；葡萄糖15g/L ；甘油15g/L ；可溶性淀粉:10g/L ；CaCO3 :6g/L ；NaCl :4g/L ；初始pH值為7. 2 ；其余為蒸餾水。提取取上述的發酵液在轉速為IOOOOrpm的條件下，離心分離25min，提取上清液，對上清液進行檢測分析，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。上述對上清液的抑菌性進行檢測分析，采用杯盤法進行測定，具體的測定方法同實施例1中的一致，不再贅述，其抗菌活性同出發菌株抗菌活性相比提高1. 32倍。實施例3活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，在室溫下，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成濃度為IO7 IO8個細胞/mL菌懸液；復合誘變取上述濃度的菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop濃度為1. 2mg/mL的菌懸液，振搖1.證后，吸取4mL放入至無菌平皿內，進行長波紫外線輻照85s，然后將經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后，涂布于平板培養基上進行培養，待生長成熟后挑選正常型單菌落接到斜面培養基上進行培養，在培養溫度為的條件下培養52小時后，得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；種子培養挑取幾環上述的誘變后的納豆芽孢桿菌菌體接種到裝有30mL液體種
6子培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度35°C，搖床轉速為150rpm的條件下培養 24小時，培養結束后得到種子液；發酵培養取上述得到的種子液ImL接種到裝有30mL液體發酵培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度30°C，搖床轉速為200rpm的條件下培養48小時，培養結束后得到發酵液；所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨:3g/L ；酵母膏:4g/L ；玉米漿5g/L ；葡萄糖5g/L ；甘油:10g/L ；可溶性淀粉:5g/L ；CaCO3 :7g/L ；NaCl :5g/L ；初始pH值為7. 0 ；其余為蒸餾水。提取取上述的發酵液在轉速為IOOOOrpm的條件下，離心分離25min，提取上清液，對上清液進行檢測分析，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。對上述上清液的抑菌性進行檢測分析，采用杯盤法進行測定，具體的測定方法同實施例1中的一致，不再贅述，其抗菌活性同出發菌株的抗菌活性相比提高1. 43倍。實施例4活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，在室溫下，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成濃度為IO7 IO8個細胞/mL菌懸液；復合誘變取上述濃度的菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop濃度為1. Omg/mL的菌懸液，振搖2. Oh后，吸取4mL放入至無菌平皿內，進行長波紫外線輻照12 ，然后將經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后，涂布于平板培養基上進行培養，待生長成熟后挑選正常型單菌落接到斜面培養基上進行培養，在培養溫度為25°C的條件下培養60小時后，得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；種子培養挑取幾環上述的誘變后的納豆芽孢桿菌菌體接種到裝有30mL液體種子培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度^°C，搖床轉速為150rpm的條件下培養 45小時，培養結束后得到種子液；發酵培養取上述得到的種子液ImL接種到裝有30mL液體發酵培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度35°C，搖床轉速為200rpm的條件下培養36小時，培養結束后得到發酵液；所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨:2g/L ；酵母膏:10g/L ；玉米漿:10g/L ；葡萄糖15g/L ；甘油5g/L ；可溶性淀粉:15g/L ；CaCO3 :5g/L ；NaCl :2g/L ；初始pH值為7. 2 ；其余為蒸餾水。提取取上述的發酵液在轉速為IOOOOrpm的條件下，離心分離25min，提取上清液，對上清液進行檢測分析，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。上述對上清液的抑菌性進行檢測分析，采用杯盤法進行測定，具體的測定方法同實施例1中的一致，不再贅述，其抗菌活性同出發菌株抗菌活性相比提高1. 5倍。實施例5活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，在室溫下，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成濃度為IO7 IO8個細胞/mL菌懸液； 復合誘變取上述濃度的菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop濃度為5. Omg/mL的菌懸液，振搖2. Oh后，吸取4mL放入至無菌平皿內，進行長波紫外線輻照100s，然后將經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后，涂布于平板培養基上進行培養，待生長成熟后挑選正常型單菌落接到斜面培養基上進行培養，在培養溫度為30°C的條件下培養40小時后，得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；種子培養挑取幾環上述的誘變后的納豆芽孢桿菌菌體接種到裝有30mL液體種子培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度^°C，搖床轉速為150rpm的條件下培養 40小時，培養結束后得到種子液；發酵培養取上述得到的種子液ImL接種到裝有30mL液體發酵培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度30°C，搖床轉速為200rpm的條件下培養50小時，培養結束后得到發酵液；所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨:lg/L ；酵母膏:20g/L ；玉米漿3g/L ；葡萄糖12g/L ；甘油:20g/L ；可溶性淀粉:5g/L ；CaCO3 :6g/L ；NaCl :2g/L ；初始pH值為7. 4 ；其余為蒸餾水。提取取上述的發酵液在轉速為IOOOOrpm的條件下，離心分離25m i η,提取上清液，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。將上述得到的高抗菌性能的納豆芽孢桿菌的抑菌性進行檢測，采用杯盤法進行測定，具體的測定方法同實施例1中的一致，不再贅述，其抗菌活性同出發菌株抗菌活性相比提高1.42倍。實施例6活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，在室溫下，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成濃度為IO7 IO8個細胞/mL菌懸液；復合誘變取上述濃度的菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop濃度為7. Omg/mL的菌懸液，振搖2. Oh后，吸取4mL放入至無菌平皿內，進行長波紫外線輻照k，然后將經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后，涂布于平板培養基上進行在30°C條件下培養， 待生長成熟后挑選正常型單菌落接到斜面培養基上進行培養，在培養溫度為30°C的條件下培養48小時后，得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；種子培養挑取幾環上述的誘變后的納豆芽孢桿菌菌體接種到裝有30mL液體種子培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度^°C，搖床轉速為150rpm的條件下培養 48小時，培養結束后得到種子液；發酵培養取上述得到的種子液ImL接種到裝有30mL液體發酵培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度^°C，搖床轉速為200rpm的條件下培養60小時，培養結束后得到發酵液；所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨:2g/L ；酵母膏:15g/L ；玉米漿6g/L ；葡萄糖:8g/L ；甘油:30g/L ；可溶性淀粉:20g/L ；CaCO3 :5g/L ；NaCl :3g/L ；初始pH值為7. 2 ；其余為蒸餾水。提取取上述的發酵液在轉速為IOOOOrpm的條件下，離心分離25min，提取上清液，對上清液進行檢測分析，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。將上述得到的高抗菌性能的納豆芽孢桿菌的抑菌性進行檢測，采用杯盤法進行測定，具體的測定方法同實施例1中的一致，不再贅述，其抗菌活性同出發菌株抗菌活性相比提高1.38倍。實施例7活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，在室溫下，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成濃度為IO7 IO8個細胞/mL菌懸液；復合誘變取上述濃度的菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop濃度為6. 2mg/mL的菌懸液，振搖2. Oh后，吸取4mL放入至無菌平皿內，進行長波紫外線輻照10 ，然后將經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后，涂布于平板培養基上進行在30°C條件下培養，待生長成熟后挑選正常型單菌落接到斜面培養基上進行培養，在培養溫度為的條件下培養48小時后，得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；種子培養挑取3環上述的誘變后的納豆芽孢桿菌菌體接種到裝有30mL液體種子培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度，搖床轉速為150rpm的條件下培養35 小時，培養結束后得到種子液；發酵培養取上述得到的種子液2mL接種到裝有30mL液體發酵培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度32°C，搖床轉速為200rpm的條件下培養45小時，培養結束后得到發酵液；所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨:3g/L ；酵母膏:5g/L ；玉米漿:lg/L ；葡萄糖:9g/L ；甘油12g/L ；可溶性淀粉:12g/L ；CaCO3 :5g/L ；NaCl :2g/L ；初始pH值為7. 2 ；其余為蒸餾水。提取取上述的發酵液在轉速為IOOOOrpm的條件下，離心分離25m i n，提取上清液，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。將上述得到的高抗菌性能的納豆芽孢桿菌的抑菌性進行檢測，采用杯盤法進行測定，具體的測定方法同實施例1中的一致，不再贅述，其抗菌活性同出發菌株抗菌活性相比提高1.45倍。實施例8活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，在室溫下，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成濃度為IO7 IO8個細胞/mL菌懸液；復合誘變取上述濃度的菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop濃度為5. 2mg/mL的菌懸液，振搖2. Oh后，吸取4mL放入至無菌平皿內，進行長波紫外線輻照65s，然后將經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后，涂布于平板培養基上進行在30°C條件下培養， 待生長成熟后挑選正常型單菌落接到斜面培養基上進行培養，在培養溫度為的條件下培養48小時后，得到一級種子菌體；種子培養挑取3環上述的一級種子菌體接種到裝有30mL液體種子培養基的 250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度30°C，搖床轉速為150rpm的條件下培養30小時，培養結束后得到種子液；發酵培養取上述得到的種子液2mL接種到裝有30mL液體發酵培養基的250mL搖瓶內進行搖床培養，培養溫度32°C，搖床轉速為200rpm的條件下培養45小時，培養結束后得到發酵液；所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨:4g/L ；酵母膏:3g/L ；玉米漿:4g/L ；葡萄糖:llg/L ；甘油:13g/L ；可溶性淀粉:llg/L ；CaCO3 :7g/L ；NaCl :4g/L ；初始pH值為7. 0 ；其余為蒸餾水。提取取上述的發酵液在轉速為IOOOOrpm的條件下，離心分離25m i η,提取上清液，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。
將上述得到的高抗菌性能的納豆芽孢桿菌的抑菌性進行檢測，采用杯盤法進行測定，具體的測定方法同實施例1中的一致，不再贅述，其抗菌活性同出發菌株的抗菌活性相比提高1.43倍。本發明中所描述的具體實施例僅是對本發明精神作舉例說明。本發明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發明的精神或者超越所附權利要求書所定義的范圍。盡管對本發明已作出了詳細的說明并引證了一些具體實施例，但是對本領域熟練技術人員來說，只要不離開本發明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。
權利要求
1.一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于該方法包括以下步驟A、活化將納豆芽孢桿菌菌種接種到斜面培養基上進行活化培養，從斜面上刮取活化后的納豆芽孢桿菌，用無菌生理鹽水配制成菌懸液；B、復合誘變取上述菌懸液與8-Mop混合制成含8-Mop的菌懸液，振搖，放入無菌平皿內，進行長波紫外線輻照，然后將上述經過長波紫外線輻照后的含8-Mop的菌懸液稀釋后， 涂布于平板培養基上進行培養，生長成熟后，挑選正常型單菌落接種到斜面培養基進行培養，在培養溫度為25V 35°C的條件下培養40 60小時，得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；C、種子培養將上述步驟B中的誘變后的納豆芽孢桿菌菌體接種到液體種子培養基進行搖床培養，培養溫度為25°C 35°C，培養時間為M 48小時，培養結束后得到種子液；D、發酵培養將上述步驟C中得到的種子液接種到液體發酵培養基中進行搖床培養， 培養溫度為觀 35°C，培養時間為36 60小時，培養結束后得到發酵液；E、提取、篩選將上述的發酵液進行離心分離，提取上清液，對上清液進行檢測分析，篩選得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。
2.根據權利要求1所述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于步驟A 中所述的菌懸液的濃度為IO7 IO8個細胞/mL。
3.根據權利要求1所述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于步驟B 中所述的含8-Mop的菌懸液中8-Mop的質量濃度為1. 0% 7. 0%。
4.根據權利要求3所述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于步驟B 中所述的含8-Mop的菌懸液中8-Mop的質量濃度為3. 0% 5. 0%。
5.根據權利要求1所述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于步驟B 中所述的長波紫外線輻照的時間為k 12k。
6.根據權利要求5所述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于所述的長波紫外線輻照的時間為4 85s。
7.根據權利要求1-6中任意一項所述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于步驟B中所述的挑選正常型單菌落接種到斜面培養基進行培養，所述的培養溫度為 30°C的條件下培養45 48小時。
8.根據權利要求1-6中任意一項所述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于步驟C中所述的培養溫度為 30°C，培養時間為30 40小時。
9.根據權利要求1-6中任意一項所述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于步驟D中所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨1 5g/ L ；酵母膏1 20g/L ；玉米漿1 10g/L ；葡萄糖5 15g/L ；甘油5 30g/L ；可溶性淀粉5 20g/L ；CaCO3 5 8g/L ；NaCl 2 5g/L ；pH 值為 7. 0 7. 4 ；其余為蒸餾水。
10.根據權利要求9所述的一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，其特征在于步驟 D中所述的液體發酵培養基中含有以下組成的質量含量胰蛋白胨3 4g/L ；酵母膏4 10g/L ；玉米漿3 6g/L ；葡萄糖8 12g/L ；甘油10 15g/L ；可溶性淀粉10 15g/L ； CaCO3 6 7g/L ；NaCl 3 4g/L ；pH值為7. 0 7. 4 ；其余為蒸餾水。全文摘要
本發明涉及一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，屬于生物技術領域。為了解決現有技術中的納豆芽孢桿菌的抗菌性能較差的技術問題，提供一種提高納豆芽孢桿菌抗菌性能的方法，該方法通過對出發納豆芽孢桿菌菌種進行A、活化；B、復合誘變接種到含8-Mop的菌懸液中，進行長波紫外線輻照，再進行培養得到誘變后的納豆芽孢桿菌菌體；然后進行C、種子培養；D、發酵培養；E、提取、篩選對發酵液進行離心分離，提取上清液，對上清液進行檢測分析，得到高抗菌性能的納豆芽孢桿菌。本發明的方法具有原料易得，設備簡單，成本低廉，且工藝過程簡單的優點；通過復合誘變、篩選后得到的納豆芽孢桿菌具有抗菌活性高的優點。
文檔編號C12N15/01GK102533719SQ201210012078
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月14日 優先權日2012年1月14日
發明者張巧央, 柴央央, 葛永達, 蔣王輝, 陳建軍, 黃純純 申請人:臺州職業技術學院