專利名稱：一種蘭花膠孢炭疽菌分子檢測引物及快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種蘭花膠孢炭疽菌分子檢測引物及其用法，專用于蘭花膠孢炭疽菌的快速分子檢測，同時可用于田間蘭花膠孢炭疽菌的早期診斷和病菌的監測與鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術的領域。
背景技術：
蘭花是福建省出口創匯的主要花卉產品之一，給種植戶帶來了巨大收益。福建的建蘭(JJymbidium ensifolium)是國蘭之袓，與墨蘭{Cymbidium sinense),寒蘭(Cymbidium kanran),春生(Mymbidium goeringiiiCymbidium /a^ari)屬蘭禾斗(Orchidaceae)
^■Cymbidiim)多年生單子葉草本植物，是珍貴的園林觀賞植物。在我國民間有著悠久的栽培歷史，因其品種多，價格高，且花期較長可多次開花，近年來，種植面積逐步擴大。據報道，蘭花炭疽病是由膠孢炭疽菌(CbBetoiricAws gloeosporioides)引起的，是生產中的最主要病害。一旦受炭疽病菌侵染后，在葉片或花瓣上出現大小不等的斑點，甚至造成植株不開花，大大降低或失去觀賞或商品價值，嚴重時植株枯死，給生產造成極大的威脅。目前，國內學者對蘭花膠孢炭疽菌研究涉及的較少，特別是病菌的分子檢測方蘭花炭疽病可危害葉片、花瓣、根，不但造成當年生產減產和品質降低，同時也是次年的初侵染來源，其中潛存于植株和土壤中的炭疽病菌是來年炭疽病發生的最主要的初侵染源。病菌主要以菌絲體在病葉、病殘體和枯萎的葉基苞片上越冬，分生孢子經越冬，其萌發率大為降低。次年春末、夏初天氣潮濕多雨，病菌開始侵染，有傷口和急風暴雨更易感染。病菌可借助昆蟲傳播和風雨傳播而侵染附近植株的葉片，進而使地上部表現癥狀，形成發病中心，致該病由點到面，迅速蔓延擴大。該病的發生和流行受品種和氣象條件的影響較大，其中又以氣象條件為主。在適宜的溫、濕度條件下，炭疽病菌產生的孢子能迅速繁殖，多次再侵染，很快引致流行。老葉一般于4月份開始發病，新葉則從7-8月份開始發病，高溫多雨季節發病嚴重。如果整株受害嚴重，幼芽剛萌發時亦受侵染發病。若蘭圃中花盆放置過密，雜草多，葉片相互交錯，相對濕度過高，病菌易再次侵染。當年不換盆、分盆，盆土粘重板結，透氣性差，排水不良，會使病害加重。因此建立蘭花膠孢炭疽病原菌分子檢測方法，對早期發病植株進行膠孢炭疽菌快速檢測，進而監測炭疽病菌的發生情況，對防止該病從發病區向未發病區擴散蔓延以及蘭花膠孢炭疽菌早期預測預報和有效防治策略的制定都具有重要的理論和實際意義。蘭花膠孢炭疽菌具有很強的傳染性，一旦擴散蔓延則難以控制。目前對蘭花膠孢炭疽菌的檢測大多仍沿用傳統的培養及鑒定方法，但該病在按常規方法分離的過程中，由于膠孢炭疽菌生長速度稍慢，經常被包括腐霉在內的其它雜菌所掩蓋，給該菌的成功分離和病害的準確診斷造成很大困難。因此，以形態特征為基礎的常規病害診斷技術，由于其耗時長，效率和靈敏度均較低，難以滿足對蘭花炭疽病診斷的實際需要，很容易錯過病害防治的最佳時期。因此，建立一套結果可靠、易于操作、靈敏度高的蘭花膠孢炭疽菌快速檢測診斷技術不僅非常必要，而且十分迫切。
隨著科學技術的發展，許多新的技術方法不斷引入該領域，其中PCR技術以其快速、靈敏和準確等優點已廣泛應用于植物病害的研究。核糖體轉錄間隔區是20世紀90年代發展起來的全新的分子標記。利用核糖體rDNA序列在物種進化過程中的保守性和異變性設計引物進行PCR擴增已在棉花、番茄、西瓜等作物的病害檢測中得到了廣泛的應用。隨著炭疽病菌不同種ITS序列數據的積累，以該區域為靶標序列設計特異引物用于炭疽病菌的檢測已有成功報道，隨著PCR技術的不斷改進，后來發展起來的巢式PCR在植物病原菌的檢測方面已得到了廣泛應用。巢式PCR的靈敏度比常規PCR提高100-10000倍，在植物病害的癥狀還未顯現出來之前，就能對植物體內病原菌進行準確快速的檢測，這對制訂病害防治最佳時期至關重要。
發明內容
針對現有技術中蘭花膠孢炭疽菌的生物學檢測方法所需周期長、蘭花膠孢炭疽菌還沒有系統的分子檢測方法的現狀，本發明提供了一種蘭花膠孢炭疽菌分子檢測引物以及蘭花膠孢炭疽菌的快速檢測方法。為了實現上述目的，本發明采取了以下技術方案
本發明首先提供了一種蘭花膠孢炭疽菌分子檢測引物，引物序列為 上游引物 Pl: 5 ‘-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTC-3’ 下游引物 P2: 5 ‘-TGAGGGCCTACATCAGCT -3，。所述引物Pl和P2對蘭花膠孢炭疽菌特異性擴增出304bp的產物。本發明還提供了一種蘭花膠孢炭疽菌的快速檢測方法，包括以下步驟
(1)提取植株或栽培基質DNA;
(2)PCR 擴增；PCR 反應體系 25 μ 1，包括 Taq PCR Master Mix 12. 5 μ L，2X 1(Γ5 200ng模板DNA, 10 umol/ L所述的上游引物Pl和下游引物P2各1 μ L，加ddH20至總體積達25yL; PCR反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性60sec，70°C退火60 sec，72°C延伸60 sec，共；35個循環；72 °C延伸7 min ；
(3)PCR擴增產物用瓊脂糖電泳分離，根據擴增產物的大小判定結果，如果能特異性地擴增出304 bp的產物，即判斷所述的植株或栽培基質中存在蘭花膠孢炭疽菌。為了獲得蘭花膠孢炭疽菌的特異引物序列，本發明以福建省福州，漳州等地的25 個蘭花膠孢炭疽菌，10種不同真菌，3個蘭花枯萎病菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入 900 μ 1 CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取液(2% CTAB ； 100 m mol/L Tris-HCl, PH 8. 0 ； 20mmol/L EDTA, pH8. 0 ； 1. 4 mol/L NaCl)和 90 μ 1 10% SDS (十二燒基苯磺酸鈉)后混勻， 于65°C水浴1. 0-1. 5 h,每10 min振蕩混勻一次，水浴后離心(12，000rpm)10min，取上清液加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(2524:1)，離心(12, OOOrpm) 10 min，取上清液(水相)， 加入等體積氯仿抽提一次(12，OOOrpm離心lOmin)，吸上清，加0. 1倍體積的3 mol/L NaAC 溶液和2倍體積的冰無水乙醇，_20°C下沉淀濁后12，OOOrpm離心10 min,輕輕地倒去上清液，加入700 μ 1冰的70%乙醇進行洗滌(稍離心，傾掉上清)，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用 IXTE (l(toimol/LTris-HCL，0· bnmol/LEDTA，ρΗ8· 0)溶液進行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至100 ng/μ 1待用。在蘭花膠孢炭疽菌特異DNA片段序列的基礎上應用ClustalX軟件比對設計特異引物Pl/ P2，經對供試菌株和25個蘭花膠孢炭疽菌的特異性進行PCR驗證(PCR反應體系25 μ 1，Taq PCR Master Mix 12. 5yL, 200ng 模板 DNA，引物 Pl/ P2 各 lyL(10 umol/ L)，加 ddH20 至總體積達 25 μ L。PCR 反應條件為94°C 預變性 5min ;94°C變性 60sec，70°C退火 60 sec，72°C延伸 60sec，共；35 個循環；72 °C延伸7 min0此特異引物在蘭花膠孢炭疽菌中特異性地擴增出304bp的產物。 這說明該引物可被用于生產實踐中發病植株中蘭花膠孢炭疽菌快速可靠的檢測和鑒定。本發明有益效果本發明方法適用于植株中蘭花膠孢炭疽菌的快速可靠的檢測和鑒定，對于農業生產中蘭花膠孢炭疽菌引起的病害防治具有重要的實用價值。該方法結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高，對于蘭花膠孢炭疽菌引起病害顯癥之前的早期監測， 確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果
1、特異性強本發明檢測方法是利用核糖體內轉錄間隔區(rDNA-ITS)序列在真菌種間高度變異和種內穩定性設計蘭花膠孢炭疽菌特異引物進行檢測。已經對來自福建福州和漳州等地的蘭花膠孢炭疽菌，蘭花枯萎病菌和其它不同真菌進行驗證，結果具有很強的特異性。2、實用性好本發明所設計出的一對特異性引物，可用于帶蘭花膠孢炭疽菌的植株或栽培基質的高靈敏度快速分子檢測，因此本方法的實用性強，可滿足對帶菌植株中存在的蘭花膠孢炭疽菌進行快速可靠的檢測和鑒定的需要。3、操作簡便快速應用本發明方法，對植株進行DNA提取、PCR擴增和常規的瓊脂糖電泳后即可判定結果，無需對擴增產物進行限制性內切酶酶切。一般整個檢測過程可在數小時內完成。
圖1為本發明所要檢測的蘭花膠孢炭疽菌的特異PCR擴增圖；其中圖A中M:DL 2000bp DNA Marker，泳道 1-15 為蘭花膠孢炭疽菌；圖 B 中M :DL 2000bp DNA Marker，泳道16-25為蘭花膠孢炭疽菌，泳道沈為陰性對照，27- 為蘭花枯萎病菌，泳道30為黃瓜炭疽病菌，泳道31為菜豆炭疽病菌，泳道32為辣椒炭疽病菌，泳道33為山茶花炭疽病菌，泳道34為大豆炭疽病菌，泳道35為文心蘭炭疽病菌，泳道36香蕉枯萎病菌，泳道37為辣椒疫霉菌，泳道38為草莓疫霉菌，泳道39為茄子疫霉菌。圖2為本發明蘭花膠孢炭疽菌的靈敏性檢測擴增結果圖(巢式PCR)；圖A 巢式 PCR第一輪反應，引物為ITSl和ITS4，其中M，DL 2000 DNA Marker，泳道1為200ng，泳道 2為20ng，泳道3為2ng，泳道4為200pg，泳道5為20pg，泳道6為2pg，泳道7為200fg，泳道8為20fg，泳道9為陰性對照；圖B:巢式第二輪反應，引物Pl和P2，其中M，DL 2000 DNA Marker,泳道10為陰性對照，泳道11為200ng，泳道12為20ng，泳道13為2ng，泳道14為 200pg，泳道15為20pg，泳道16為2pg，泳道17為200fg，泳道18為20fg。圖3為本發明發病植株的檢測結果圖；圖中M =DL 2000 DNA Marker，泳道1為陰性對照，泳道2為陽性對照，泳道3-8為發病的蘭花炭疽病植株。圖4為本發明栽培基質的檢測結果圖；圖中M =DL 2000 DNA Marker，泳道1為陰性對照，泳道2為陽性對照，泳道3-6為采集的栽培基質。
具體實施例方式本發明的技術內容包括蘭花膠孢炭疽菌的特異檢測引物，根據蘭花膠孢炭疽菌核糖體內轉錄間隔區(rDNA-ITS)序列在真菌種間高度變異和種內穩定性，設計了對蘭花膠孢炭疽菌具有特異擴增作用的一對PCR引物，即特異分子檢測引物的序列為
上游引物 Pl: 5 ‘-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTC-3’ 下游引物 P2: 5 ‘-TGAGGGCCTACATCAGCT -3， 2.蘭花膠孢炭疽菌特異分子檢測方法的建立
(1)從植株或栽培基質中提取DNA；
(2)PCR 擴增PCR 反應體系 25 μ 1，包括 Taq PCR Master Mix 12. 5 μ L，200ng 模板 DNA，引物Pl/ P2各IyL (10 umol/ L)，加ddH20至總體積達25 μ L。PCR反應條件為 94°C 預變性 5min ；94°C變性 60sec，70°C退火 60 sec，72°C延伸 60 sec，共；35 個循環；72 °C 延伸 7 min。①當在用于植株中可能存在蘭花膠孢炭疽菌時，采用NaOH快速裂解法提取蘭花膠孢炭疽菌的DNA，按如下的PCR反應體系和反應條件用所設計的引物進行PCR擴增PCR 反應體系 25 μ 1，包括 iTaq PCR Master Mix 12. 5 μ L，200ng 模板 DNA，引物 Pl/ P2 各 1 μ L (10 umol/ L)，加ddH20至總體積達25yL。PCR反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性 60sec，70°C退火 60 sec，72°C延伸 60 sec，共 35 個循環；72 °C延伸 7 min。②當在用于栽培基質中可能存在蘭花膠孢炭疽菌時，采用CTAB法提取栽培基質中蘭花膠孢炭疽菌的DNA，按按如下的PCR反應體系和反應條件用所設計的引物進行PCR擴增PCR 反應體系 25 μ 1，包括 iTaq PCR Master Mix 12. 5 μ L，200ng 模板DNA，引物 Pl/ P2 各1 μ L (10 umol/ L)，力口 ddH20至總體積達25 μ L。PCR反應條件為94°C預變性5min ； 94°C變性 60sec，70°C退火 60 sec，72°C延伸 60 sec，共；35 個循環；72 °C延伸 7 min。③然后將上述10 μ 1 PCR產物于含0. 5 μ g/mL EB的1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統上檢測并拍照，根據擴增產物的大小判定結果。④如果能特異性地擴增出304bp產物時，即可判斷所述的植株樣品或栽培基質中存在蘭花膠孢炭疽菌；否則所述的植株樣品或栽培基質中未存在蘭花膠孢炭疽菌。實施例1 引物對蘭花膠孢炭疽菌的特異性擴增 1.蘭花膠孢炭疽菌的特異檢測
PCR反應體系 25 μ 1，包括 Taq PCR Master Mix 12. 5 μ L，200ng模板DNA，引物Pl/ P2 各1 μ L (10 umol/ L)，力口 ddH20至總體積達25 μ L，在PE 2400 PCR儀上擴增。PCR反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性60sec，70°C退火60 sec，72°C延伸60 sec，共35個循環；72 °C延伸7 min。電泳檢測擴增產物。2.檢測結果
檢測的特異性如圖1所示，除了 25個來自我省福州和漳州等地的蘭花膠孢炭疽菌 DNA可特異地擴增出304 bp的產物外，檢測了 3個蘭花枯萎病菌和10種不同真菌DNA均未能擴增出任何產物，具有很強的特異性。實施例2 引物對蘭花膠孢炭疽菌的靈敏性檢測
1. DNA濃度稀釋提取的蘭花膠孢炭疽菌基因組DNA，經分光光度計測定濃度后，采用系列濃度稀釋。
2.蘭花膠孢炭疽菌的靈敏性檢測
PCR反應體系25 μ 1，包括Taq PCR Master Mix 12. 5 μ L，系列濃度模板DNA，引物Pl/ P2各1 μ L (10 umol/ L)，加ddH20至總體積達25 μ L，在PE 2400 PCR儀上擴增。PCR反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性60sec，70°C退火60 sec，72°C延伸60 sec，共35個循環；72 °C延伸7 min。電泳檢測擴增產物。3.檢測結果如圖2所示，在25μ 1反應體系中，20fg蘭花膠孢炭疽菌基因組DNA 可獲得明顯擴增條帶，檢測靈敏度可達20fg。實施例3 發病植株中蘭花膠孢炭疽菌的檢測。1.樣品采集植物組織樣品采自福建省福州和漳州蘭花種植基地。2. DNA提取及檢測
發病植物組織采用CTAB法提取DNA，按上述實施的方法進行PCR擴增，PCR反應體系 25 μ 1，包括 Taq PCR Master Mix 12. 5 μ L，200ng模板DNA，引物Pl/ P2 各 lyL(10 umol/ L)，加ddH20至總體積達25 μ L在PE 2400 PCR儀上擴增。PCR反應條件為94°C預變性 5min ;94°C變性 60sec，70°C退火 60 sec，72°C延伸 60 sec，共 35 個循環；72 °C延伸 7 min。 電泳檢測擴增產物。3.檢測結果
結果見圖3，泳道2，5，6，7，8見到一條清晰的分子量為30仙？的特異條帶，而泳道 1，3，4均沒有條帶，因而判斷5，6，7，8號樣品感染蘭花膠孢炭疽菌。實施例4 蘭花栽培基質中蘭花膠孢炭疽菌的檢測。1.樣品采集蘭花栽培基質采自福建省福州蘭花生產基地。2. DNA提取及檢測
(1)從可能發病土壤樣品中提取DNA
(2)蘭花膠孢炭疽菌的PCR檢測
PCR擴增，PCR反應體系 25 μ 1，包括 Taq PCR Master Mix 12. 5 μ L，200ng模板DNA，引物Pl/ P2各lyL(10 umol/ L)，加ddH20至總體積達25 μ L，在PE 2400 PCR儀上擴增。 PCR 反應條件為94°C 預變性 5min ；94°C變性 60sec，70°C退火 60 sec, 72°C延伸 60 sec, 共35個循環；72 °C延伸7 min。電泳檢測擴增產物。3.檢測結果
結果見圖4，泳道2-5均見到一條清晰的分子量為304bp的特異條帶，而泳道1和6均沒有條帶，判斷采集的3，4，5號栽培基質感染蘭花膠孢炭疽菌。
權利要求
1.一種蘭花膠孢炭疽菌分子檢測引物，其特征在于，引物序列為上游引物 Pl: 5 ‘-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTC-3’下游引物 P2: 5 ‘-TGAGGGCCTACATCAGCT -3，。
2.根據權利要求1所述的蘭花膠孢炭疽菌分子檢測引物，其特征在于，所述引物Pl和 P2對蘭花膠孢炭疽菌特異性擴增出304bp的產物。
3.—種蘭花膠孢炭疽菌的快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)提取植株或栽培基質DNA;(2)PCR 擴增；PCR 反應體系 25 μ 1，包括 Taq PCR Master Mix 12. 5 μ L，2X 1(Γ5 200ng模板DNA，10 umol/ L權利要求1所述的上游引物Pl和下游引物P2各1 μ L，加 ddH20至總體積達25 μ L ； PCR反應條件為94°C預變性5min ；94°C變性60sec，70°C退火 60 sec，72°C延伸 60 sec，共 35 個循環；72 °C延伸 7 min ；(3)PCR擴增產物用瓊脂糖電泳分離，根據擴增產物的大小判定結果，如果能特異性地擴增出304 bp的產物，即判斷所述的植株或栽培基質中存在蘭花膠孢炭疽菌。
全文摘要
本發明涉及一種蘭花膠孢炭疽菌分子檢測引物及其用法，專用于蘭花膠孢炭疽菌特異分子檢測，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術的領域。主要采用設計了一對蘭花膠孢炭疽菌的特異引物(上游引物P1:5‘-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTC-3’和下游引物P2:5‘-TGAGGGCCTACATCAGCT-3’)，經過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，可在蘭花膠孢炭疽菌純DNA、帶菌的植株和栽培基質中特異性地擴增出片段長度為304bp的特異擴增產物。所發明的特異分子檢測引物及其用法可被用于生產實踐中蘭花膠孢炭疽菌感染的植株和栽培基質中蘭花膠孢炭疽菌的快速、靈敏、特異的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測和鑒定，為蘭花膠孢炭疽菌引起的病害的防治提供可靠的技術和理論依據。
文檔編號C12N15/11GK102534017SQ20121001846
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者余德億, 姚錦愛, 陳 峰, 鹿連明, 黃鵬 申請人:福建省農業科學院植物保護研究所