四種果樹食心蟲分子鑒定引物及使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于四種果樹食心蟲分子鑒定的引物，并公開了分子鑒定引物的序列和分子鑒定引物的使用方法。本發明用于鑒別蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、沙果小食心蟲和李小食心蟲四種果樹食心蟲的引物能夠擴增四種食心蟲的線粒體COI和COII基因，與提供的一種食心蟲序列具有99％以上同源性的即為該食心蟲，為四種食心蟲的鑒別提供簡便穩定的分子標記，解決區分和鑒定四種食心蟲的難題；從分子水平探索了四種食心蟲線粒體COI和COII基因的不同，探索建立四種食心蟲的鑒別技術，為今后果樹食心蟲的生物學、種群動態監測以及綜合防治奠定了基礎。
【專利說明】四種果樹食心蟲分子鑒定引物及使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種果樹病蟲鑒別方法，尤其涉及一種四種果樹食心蟲分子鑒定引物及使用方法。
【背景技術】
[0002]蘋果蠹蛾Cydia pomonella屬鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae、小卷蛾屬Cydia，寄主包括仁果類的蘋果、蘋果梨、沙果、梨、山楂、海棠，核果類的桃、李、杏、棗、櫻桃，漿果類的石榴，胡桃等園藝植物，是重要的世界性果樹害蟲之一。該蟲主要以幼蟲蛀果危害并取食種子，有轉果為害習性，蛀果率普遍在50%以上，嚴重時可達100%，常造成大量落果，降低果品的產量和品質。該蟲起源于歐洲東南部，之后隨著蘋果的移植和人為因素擴散到整個歐洲大陸，迄今為止，其已廣泛分布于美洲、非洲、澳洲和亞洲除東亞以外的所有蘋果產區。蘋果蠹蛾是我國重要的入侵害蟲，1957年我國首次有文獻報道在新疆庫爾勒地區蘋果蠹蛾的分布，至50年代中后期已遍布新疆全境。20世紀80年代中期該蟲進入甘肅省，并持續向東擴張，目前在張掖、酒泉、武威等地嚴重發生。自2006年以來，該蟲在黑龍江省牡丹江市和雞西市的大部分地區普遍發生，并可能對我國東部蘋果優勢產區造成威脅。因此，對于蘋果蠹蛾的識別和鑒定對于確保我國非疫區果業的建設和出口以及防止蘋果蠹蛾在我國的進一步入侵具有重要意義，而蘋果蠹蛾的快速鑒定方法是防止其進一步擴展的重要手段。
[0003]梨小食心蟲Grapholita molesta Busck屬于鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae，簡稱梨小，義名東方果蛀蛾、桃折心蟲，是世界性的主要蛀果害蟲之一。梨小食心蟲分布于亞洲、歐洲 、北美洲、澳洲，幼蟲主要為害梨、杏、桃、李、山楂等的果實和新梢，在不同的寄主植物上為害部位不同，在我國分布很廣，從南到北均有發生。為害新梢時，多從新梢頂端的葉柄基部蛀入髓部，由上向下蛀食，蛀孔外有蟲糞和樹膠，被害嫩梢的葉片逐漸凋萎下垂，最后枯死。果實以梨、桃、杏受害最重。為害梨果時，早期為害的入果孔較大，有蟲糞排出，孔口周圍變黑腐爛、凹陷，故又稱“黑膏藥”。后期為害的入果孔很小，孔口周圍仍呈綠色，幼蟲直向果心蛀食果肉和種子，果面不凹陷變形。梨小食心蟲有轉移寄主的習性，在桃、梨混栽的果園為害比較嚴重，為害后不僅影響樹冠的擴大和成形，而且嚴重降低了果質和產量。蘋果蠹蛾和梨小食心蟲幼蟲非常相似，主要靠腹部末端有無臀櫛來區分，但是低齡幼蟲仍然很難鑒定，即使專業人員也不容易進行準確的鑒定。
[0004]沙果小食心蟲Grapholita dimorpha Komai 屬鱗翅目 Lepidoptera 卷蛾科Tortricidae，危害沙果、李子和山里紅的果實，于1996年在黑龍江報道，為我國新紀錄種。成蟲將卵產在果實表面，孵化后幼蟲鉆入果實危害，在果實的蛀孔處有淚珠狀果膠流出，幼蟲在果實內結繭化蛹，羽化前鉆出果實在蛀孔處有蛹殼。沙果小食心蟲和梨小食心蟲是近緣種，二者在外部形態和生物學特性上非常相似，田間難以正確區分。沙果小食心蟲和梨小食心蟲這兩種害蟲主要通過雄性后翅外緣下部凹入的有無、雌性囊突的大小以及果實上蛹殼的有無進行區分，但它們在外部形態及生物學特性上非常相似，極易混淆，對它們的快速準確鑒定十分困難。此外，研究表明梨小食心蟲性信息素可以誘到98.8%的梨小食心蟲和1.2%的沙果小食心蟲，而沙果小食心蟲性信息素可以誘到99.7%的沙果小食心蟲和
0.3%的梨小食心蟲，這更為兩種害蟲的區分增加了難度。
[0005]李小食心蟲Grapholitha funebrana Treitscheke又稱李小蠹蛾,隸屬于鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae,分布于我國的東北、華北、西北等各地。寄主有李、杏、樓桃、桃、郁李等多種植物，其中以李受害最重。以幼蟲駐果危害，蛀果前常在果面上吐絲結網，棲于網下開始啃食果皮蛀入果內，早期入果孔為黑色，數日后即有蟲糞排出。豆粒大的果實極易大量脫落，以后被害果在入果孔流出大量水珠狀果膠滴。入果后蛀食果仁或縱橫串食，并串到果柄附近咬壞輸導系統，小果變紫紅色，呈“紅糖餡”不堪食用。有的果園蟲果率競達80%~90%，造成增產不增收。本種與梨小食心蟲很近似，成蟲主要區別在于:本種前翅較狹長，前翅顏色淡，為煙灰色；前緣白色鉤狀紋不明顯，有18組，而梨小食心蟲則明顯，有10組；梨小食心蟲前翅中室端部附近有一明顯斑點，本種則無。幼蟲頭部黃褐色。前胸背板淺黃或黃褐色；臀板淡黃褐或玫瑰紅色，上有20多個深褐色小斑點；腹足趾鉤粗短，為不規則雙序，而梨小食心蟲細長且為單序，臀櫛5~7齒。
[0006]果樹食心蟲危害嚴重，蛀果危害時發生隱蔽，尤其是在發生初期很難及時發現，對食心蟲發生種類判斷不準確，對其發生規律認識不清，經常導致采用錯誤的防治方法。很多環境友好的防治方法(如昆蟲病毒制劑、信息素迷向)都有很強的專一性，這些方法只對某一種害蟲有防治效果，因此使用時必須準確地鑒定害蟲。蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、沙果小食心蟲和李小食心蟲這四種食心蟲幼蟲的外部形態非常相似，而且經常同時在同一果園發生，使傳統形態鑒定難度增大，準確性降低。使用信息素誘芯進行種群動態監測時，梨小食心蟲的性信息素可以誘集到部分的沙果食心蟲和李小食心蟲，沙果食心蟲的誘芯也可以兩集到梨小食心蟲和李小食心蟲，其成蟲也很難區分鑒定，這不僅給預測預報工作帶來困難，而且增加了它們有效區分的難度。因此，四種果樹食心蟲的快速準確鑒定對口岸檢疫、預測預報和防治都要重要意義。
【發明內容】
[0007]為了解決現有技術中的問題，本發明的目的是提供一種用于蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、沙果小食心蟲和李小食心蟲四種果樹食心蟲分子鑒定引物及使用方法。
[0008]為達到上述目的，本發明所采用的技術手段是:用于四種果樹食心蟲分子鑒定引物，分子鑒定引物的序列為:
[0009]COI 基因上游引物 ClF:5’ -TGGTCACCCAGAAGTTTA-3’
[0010]COI 基因下游引物 CIR:5’ -AAGAGTAACATCAATAGAAG-3’
[0011]COII 基因上游引物 C2F:5’ -ATTGCTTTACCATCTCTTCG-3’
[0012]COII 基因下游引物 C2R:5’ -AAACTATGATTTGCTCCACA-3’。
[0013]上述兩對分子鑒定引物的使用方法，包括如下步驟:
[0014]—、提取待鑒定樣品的基因組DNA ;
[0015]二、以步驟一所得基因組DNA為模板，利用上述本發明的兩對引物對基因組DNA中的線粒體COI和COII基因進行PCR擴增；
[0016]三、取適量步驟二的PCR擴增產物用瓊脂糖電泳檢測結果，經溴化乙錠染色后，使用1%瓊脂糖電泳，于紫外燈下觀察，兩對引物擴增的片段大小分別為316bp和350bp，將得到的特異性產物測序，利用Om)maS2.4軟件讀取測序結果，觀察峰圖并進行校對，通過軟件CLUSTALX1.83將所得序列進行多序列同源比對。同一種食心蟲中的COI序列相似度為99% -100%，不同食心蟲之間COI基因序列相似度是88% -94% ;同一種食心蟲中的COII序列相似度為99% -100%，不同食心蟲之間COI基因序列相似度是87% -93%。以上即可認為，COI和COII基因相似性都在99%以上的即為同一種食心蟲，即通過序列差異來區分四種果樹食心蟲。
[0017]進一步的，所述步驟二中PCR反應體系和條件為:PCR反應體系為25yL，含2XpCRMaster mixl2.5 μ L，正 / 反向引物各 3 μ L，DNA 模板 2 μ L，含 20 ~50ng DNA, ddH20 補足25 μ L ；PCR反應條件為:94°C下預變性2min ;而后35個循環，每個循環包括94°C變性30s，52°C退火 30s，72。。延伸 30s ;最后 72°C延伸 5min。
[0018]進一步的，所述步驟三中使用1%瓊脂糖電泳檢測。
[0019]進一步的，所述步驟一中，提取DNA的具體步驟如下:具體步驟如下:將樣本置于一無菌的1.5ml離心管中，充分研磨后加入180 μ I常用裂解液(含有IOOmmolpH8.0Tris-HCU25mmol ρΗ8.0EDTA、500mmol NaC1,1% SDS)和 20 μ I 蛋白酶 K，55°C孵育12-15小時至完全裂解；加入20 μ I RNase Α，室溫孵育2分鐘；12000rpm離心5分鐘，轉移上清于一無菌離心管中；加入10 μ 110% SDS于裂解液中，立即漩渦5秒；加入700μ I苯酹:氯仿:異戍醇(25:24:1),立即鏇潤5秒，12000rpm離心10分鐘;取上清,加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，12000rpm離心5min ;取上清，加入等體積無水乙醇于裂解物，漩渦混合5秒；將全部的溶液加入吸附柱中，12000rpm離心30秒，棄去流出液；吸附柱中加入500 μ 175%乙醇，12000rpm離心30秒,棄去流出液,重復一次；12000rpm離心2分鐘,徹底去除殘留的乙醇；將吸附柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入200μ I預熱60°C的TE溶液，室溫靜置1分鐘，12000rpm離心I分鐘，洗脫DNA ;重復洗脫DNA得到更多的DNA，洗脫出的DNA于-20°C保存。
[0020]本發明的有益效果在于:與現有技術相比具有:1、結果準確可靠:本發明方法已經對采自小國新疆、甘肅、陜西、河南、河北、山東、山西、湖北、遼寧的食心蟲進行鑒定驗證，結果的可靠性具有充分的保證；3、操作簡便:應用本發明方法，鑒定四種食心蟲，一般的普通實驗人員即可完成，不需要專業的形態學鑒定知識。2、實用性好:本發明所設計出的引物，可用于四種食心蟲幼蟲、蛹、成蟲的鑒定，只要獲得蟲體的任何一部分即可鑒定，對樣本質量無要求，可以用于田間害蟲的準確預測預報，還可以有關檢疫口岸對進出口水果的中果樹食心蟲的檢測。鑒別四種食心蟲的引物能夠擴增四種食心蟲的線粒體COI和COII基因，為四種食心蟲的鑒別提供簡便穩定的分子標記，解決區分四種食心蟲的難題；為今后果樹食心蟲的生物學、種群動態監測以及綜合防治奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的闡述。
[0022]圖1為本發明所鑒定的四種果樹食心蟲的COI和COII基因擴增結果；
[0023]其中，M:DL2000marker ;1、2、9、10 為蘋果蠹蛾；3、4、11、12 為梨小食心蟲；5、6、13、14為沙果小食心蟲；7、8、15、16為李小食心蟲；1_8為COI擴增結果，9_16為COII擴增結果。
[0024]圖2為本發明蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、沙果小食心蟲和李小食心蟲COl序列的比對圖；
[0025]圖3為本發明蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、沙果小食心蟲和李小食心蟲COII序列的比對圖。
[0026]其中，圖2和圖3中CP代表蘋果蠹蛾，GM代表梨小食心蟲，GF代表李小食心蟲，⑶代表沙果小食心蟲。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]1、昆蟲樣本采集
[0029]2010年和2011年7_9月份于新疆、甘肅、陜西、山東等地采集蘋果蠹蛾、梨小食心蟲、沙果小食心蟲和李小食心蟲的幼蟲，經專家準確的形態鑒定確認后，置于無水乙醇中-20°C保存。
[0030]表1本發明采集的四種食心蟲樣本信息
[0031]
【權利要求】
1.四種果樹食心蟲分子鑒定引物，分子鑒定引物的序列為: COI 基因上游引物 ClF:5’ -TGGTCACCCAGAAGTTTA-3’ COI 基因下游引物 ClR:5’ -AAGAGTAACATCAATAGAAG-3’ COII 基因上游引物 C2F:5’ -ATTGCTTTACCATCTCTTCG-3’ COII 基因下游引物 C2R:5’ -AAACTATGATTTGCTCCACA-3’。
2.根據權利要求1所述的四種果樹食心蟲分子鑒定引物，其使用方法，特征在于:包括如下步驟: 一、提取待鑒定樣品的基因組DNA； 二、以步驟一所得基因組DNA為模板，利用上述兩對引物對基因組DNA中的線粒體COI和COII基因進行PCR擴增； 三、取適量步驟二的PCR擴增產物用瓊脂糖電泳檢測結果，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，兩對引物擴增的片段大小分別為316bp和350bp，將得到的特異性產物測序，利用Chromas2.4軟件讀取測序結果，觀察峰圖并進行校對，通過軟件CLUSTALX1.83將所得序列進行多序列同源比對，并利用p-distance計算各食心蟲間的遺傳距離；結果表明與其中一種食心蟲中的序列相似度達到99%以上即可認為是該食心蟲，即通過序列差異來區分四種果樹食心蟲。
3.根據權利要求2所述的四種果樹食心蟲分子鑒定引物的使用方法，其特征在于:所述步驟二中PCR反應體 系和條件為:PCR反應體系為25μ L，含2XPCR Master mixl2.5μ L,正/反向引物各3 μ L，DNA模板2 μ L，含20~50ng DNA, ddH20補足25 μ L ；PCR反應條件為:94°C下預變性2min ;而后35個循環，每個循環包括94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s ;最后72°C延伸5min。
4.根據權利要求2所述的四種果樹食心蟲分子鑒定引物的使用方法，其特征在于:所述步驟三中使用1%瓊脂糖電泳檢測。
5.根據權利要求2所述的四種果樹食心蟲分子鑒定引物的使用方法，其特征在于:所述步驟一中，提取DNA的具體步驟如下:將樣本置于一無菌的1.5ml離心管中，充分研磨后加入 180 μ I 常用裂解液(含有 IOOmmol pH8.0Tris-HCU25mmol pH8.0EDTA,500mmolNaCl,l% SDS)和20 μ I蛋白酶K，55°C孵育12-15小時至完全裂解；加入20 μ I RNaseA,室溫孵育2分鐘；12000rpm離心5分鐘，轉移上清于一無菌離心管中；加入10μ 110%SDS于裂解液中，立即漩渦5秒；加入700 μ I苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，立即漩渦5秒，12000rpm離心10分鐘；取上清，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，12000rpm離心5min ;取上清，加入等體積無水乙醇于裂解物，漩渦混合5秒；將全部的溶液加入吸附柱中，12000rpm離心30秒,棄去流出液；吸附柱中加入500 μ 175%乙醇,12000rpm離心30秒,棄去流出液，重復一次；12000rpm離心2分鐘，徹底去除殘留的乙醇；將吸附柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入200 μ I預熱60°C的TE溶液，室溫靜置I分鐘，12000rpm離心I分鐘，洗脫DNA ;重復洗脫DNA得到更多的DNA，洗脫出的DNA于_20°C保存。
【文檔編號】C12N15/11GK103882116SQ201410033127
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】陳茂華, 李玉婷, 鄭燕, 王康, 錢路, 吳偉 申請人:西北農林科技大學, 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心, 新源縣農業技術推廣站