專利名稱：低溫處理法提高表皮干細胞牙向分化效率的方法
技術領域：
本發明涉及一種誘導表皮干細胞牙向分化的方法，具體涉及采用低溫處理法提高動物上皮組織來源的表皮干細胞向成牙釉質細胞分化效率的方法。
背景技術：
牙齒不僅能夠咀嚼食物、幫助發音，而且對面容有很大影響。然而人類遺傳性的牙齒缺陷卻是一種比較普遍的現象，同時，隨著年齡的增長，幾乎所有人都有不同程度的牙齒缺陷甚至缺失。牙齒特別是釉質部分，一旦缺失自身將無法完成修復和再生。因此，人類牙齒的再生是一項極具應用前景、社會效益和市場價值的研究工作。根據牙齒發育的特性，利用成體干細胞進行牙齒器官再生同樣需要上皮源性的干細胞和間充質源性的干細胞的同時參與。已有研究工作表明，具有誘導成牙潛能的小鼠 Ell. 5 (E12之前)的牙胚上皮與間充質來源的成體干細胞，如骨髓干細胞、牙髓干細胞和牙周膜干細胞等重組構建嵌合體，嵌合體能夠發育為具有類似牙齒的結構，證明利用間充質來源的成體干細胞誘導成牙已經在理論上得到解決。但是，由于上皮來源的牙釉質細胞在牙齒萌發過程中已經凋亡，已經不可能從成體牙齒獲得相應的上皮源性干細胞，所以必須從其它器官中尋找成體上皮源性干細胞。然而迄今為止，仍未找到一種合適的成體干細胞作為種子細胞，誘導其向牙上皮分化并且形成牙釉質細胞。因此，獲得上皮源性的成體干細胞并誘導其向成牙釉質細胞分化是目前人類牙齒再生工程的瓶頸工作之一。表皮干細胞(keratinocyte stem cells, KSC)來源于皮膚表皮的基底層，屬于上皮源性的干細胞。目前已經證實表皮干細胞具有多向分化的潛能，而且已經在嚴重皮膚灼傷、慢性皮膚創傷和基因治療等臨床治療上得到有效地應用。因此可以嘗試利用其成熟的培養和再生技術，為牙齒再生研究提供一種替代牙上皮的成體干細胞。本發明人前期以人表皮干細胞為材料，在培養溫度為37°C情況下，與具有誘導成牙潛能的小鼠E13. 5牙胚間充質(E12之后)重組，在嵌合體中添加FGF8生長因子能夠誘導人表皮干細胞向成牙釉質細胞分化，相關數據發表在Developmental Biology期刊 (SCI 收錄，影口向因子4. 7 ； Induction of human keratinocytes into enamel- secreting ameloblasts. Developmental Biology. 2010, 344:795-799.)，但是嵌合體形成牙齒結構的效率(成牙率)約為觀％，其中表皮干細胞分化形成成釉質細胞的效率(成釉率)約為 31%，效率不高。
發明內容
本發明目的是提供一種采用低溫處理法將表皮干細胞于M 27°C培養箱低溫處理以提高誘導表皮干細胞牙向分化的成牙效率的方法。為實現本發明的目的，采用的技術方案是 1、表皮干細胞的分離、培養
①將皮膚組織放入含4%青霉素/鏈霉素的PBS中清洗兩次，然后在解剖鏡下剪去皮下脂肪結締組織；
②將剪去皮下脂肪結締組織的其余皮膚組織放入PBS清洗三次；
③清洗后將皮膚組織放入培養皿中，用棉球沾取碘酒進行上下涂拭消毒處理，然后立即放入70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④將步驟③中經消毒處理的皮膚組織剪成2cmX0.5 cm條狀，表皮面朝上于4°C 2 U/ mL Dispase II進行第一次消化，消化時間12 14 hr ；
⑤在解剖鏡下用尖鑷分離經消化的皮膚組織中的表皮和真皮，取表皮并放入PBS清
洗；
⑥將清洗的表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用彎剪將表皮剪碎，37°C下進行二次消化10 15 min ；
⑦用含20%FBS 37°C的DMEM中止消化，輕緩吹散表皮碎片；100目細胞篩過濾表皮碎片，余下細胞懸液放置于15 mL離心管；
⑧常溫下IOOg離心5min ；
⑨棄上清液，用KSFM輕緩重新懸浮沉淀的細胞，接種于6cm培養皿中，置于37°C 5%C02培養箱培養，培養時間為18 Mhr ；
⑩吸棄上清液，加入新鮮KFSM；之后隔天半量更換新鮮的KFSM，當表皮干細胞密度為 50%以上時每天更換新鮮的KFSM，至80%時傳代。2、低溫處理
表皮干細胞傳代后，于37°C 3% 8%C02培養箱培養1. 5 3天，待表皮干細胞貼壁穩定后，放入24 27°C 3% 8% C02培養箱低溫處理2 4天。3、牙胚間充質的分離
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖鏡下利用尖鑷取下胚胎頭部并分離下頌；
②將下頌放入2U/mL的Dispase液體中，37 °C消化8 min ；
③解剖鏡下，利用尖鑷分離磨牙區的牙胚上皮和間充質組織；
④將6 8個牙間充質組織放入裝有含10%FBS的DMEM的離心管中，2000rpm離心 5 min，放置于37 V 5% C02培養箱孵育1 hr，形成牙胚間充質團粒。4、嵌合體重組
①將Trowell器官培養皿外層裝PBS，里層裝含10%FBS的DMEM液體；同時在里層依次放入支架網和0. 45 μ m的濾膜，里層的液體剛好沒過濾膜；
②利用耳勺將上述步驟3分離的牙胚間充質團挑出，放在準備好的Trowell器官培養皿的濾膜上；
③將步驟1培養得到的表皮干細胞刮下，覆蓋在濾膜上的牙胚間充質團上，于37V 5%C02培養箱孵育過夜得到嵌合體。5、移植裸鼠腎囊膜
①將裸鼠麻醉后，剪開腎部位上方的皮膚和肌肉；
②將腎用彎鑷移出裸鼠體外，在解剖鏡下用尖鑷將腎囊膜剪開一個小口；
③將步驟4培養得到的嵌合體移植入腎囊膜內；
④將移植后的腎放回腹腔，縫合肌肉和皮膚；
⑤裸鼠繼續喂養20天。
4
6、嵌合體的鑒定
(1)固定與切片
①固定將嵌合體從喂養20天的裸鼠體內取出，放置于4°C的4%多聚甲醛固定12 24 hr ；
②脫鈣采用10%EDTA脫鈣使嵌合體組織軟化；
③脫水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇逐道進行脫水，每道1hr，最后再用 100%乙醇重復一道；
④透明按無水乙醇二甲苯為1:1的比例配制透明液，透明處理30 min，然后放入二甲苯至組織透明為止；
⑤透蠟按二甲苯石蠟為1:1的比例配制透蠟液，透蠟處理30 min，然后依次放入3 道的石蠟中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖鏡下將組織放入裝滿石蠟的紙盒中，注意組織的前后左右方向；
⑦切片在切片機進行連續切片，貼在載玻片上，在展片機上展片15 20min，6(TC烘干后放置_20°C備用。(2) HE染色將上述組織切片依次進行脫蠟、復水、染色、脫水和透明步驟。①脫蠟將上述組織切片依次放入2道二甲苯，每道15 min ；
②復水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和雙蒸水中，每道5min ；
③放入蘇木精染液進行染色8 15min,自來水沖洗2 min ；
④放入伊紅染液進行染色30s ；
⑤脫水依次放入70%、90%和100%乙醇中，每道5min，然后100%乙醇重復一次；
⑥二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察嵌合體是否具有牙本質、成牙本質細胞、牙釉質或成牙釉質細胞的結構。僅有牙本質和成牙本質細胞兩種結構計為成牙；具有牙本質、成牙本質細胞、牙釉質和成牙釉質細胞四種結構計為成釉。最后統計成牙率與成釉率。本發明所述的器械均為滅菌過的器械，滅菌條件為121°C滅菌20min。本發明所述的細胞培養皿和器官培養皿均購自Corning公司。本發明所述的TE溶液成分為0. 25%胰蛋白酶和0. 05%EDTA。本發明所述的Dispase酶購于R & D公司。本發明所述的DMEM 和 KSFM ( Keratinocyte serum-free medium)培養基均購自 GIBCO公司。本發明所述的皮膚組織為小鼠或大鼠出生1天后的背部皮膚，或幼兒包皮環切后遺棄的包皮，幼兒年齡在5 12歲，無其它疾病感染，標本得到患者家屬知情同意。所有標本按照福建師范大學動物倫理委員會的相關規定執行。本發明所述的小鼠、大鼠和裸鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限公司，按照SPF 級條件飼養。采用本發明所述的低溫誘導表皮干細胞的方法，成牙率和成釉率分別至少提高至 48%和75%。這與未經低溫誘導的對照組的成牙率和成釉率分別至少提高了 13%和35%。同時，24 27°C低溫誘導操作簡便，簡易普及。
圖1是本發明所述的低溫處理法提高表皮干細胞牙向分化效率的方法流程示意圖。圖2是本發明所述的表皮干細胞不同培養階段生長形態圖。圖3是本發明所述的低溫處理法誘導表皮干細胞向成牙釉質細胞分化嵌合體結構圖。
具體實施例方式為了對本發明有進一步的理解，現結合附圖以實施例的方式對本發明進行闡述。圖2中，㈧為培養1天的細胞形態；⑶為培養3天的細胞形態；(C)為培養6 天的細胞形態；(D)為培養8天的細胞形態；(E)為培養11天的細胞形態；(F)培養13天的細胞形態。圖中標尺均為100 μπι。圖3中，(A)為嵌合體的橫切面HE染色觀察，嵌合體具有完整的牙齒結構，包括牙本質、成牙本質細胞、釉質和成牙釉質細胞；(B)為圖A的局部放大圖，示成牙釉質細胞呈柱狀拉長；(C)為嵌合體的縱切面AZAN染色觀察，成牙且成牙釉質細胞拉長；(D)為圖C的局部放大圖，示成牙釉質細胞拉長。成牙釉質細胞(ameloblast，AM)、釉質(enamel, EN)、 牙本質(dentin，DE)、成牙本質細胞(odontoblasts, 0d)、牙乳頭(dental pulp, DP)。圖中標尺均為100 μ m。實施例1
1、表皮干細胞的分離、培養
①將出生1天的小鼠處死后，取背部皮膚組織放入含4%青霉素/鏈霉素的PBS中清洗兩次，然后在解剖鏡下剪去皮下脂肪組織；
②將其余皮膚組織放入PBS清洗三次；
③將清洗好的皮膚組織放入培養皿中，用棉球沾取碘酒進行上下涂拭，然后立即放入 70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④將消毒的皮膚組織剪成2cmXO. 5 cm條狀，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化12 hr ；
⑤在解剖鏡下用尖鑷分離經消化的皮膚組織的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥將表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用彎剪將表皮剪碎，放置于37°C消化 IOmin ；
⑦用37°C預熱的含20%FBS的DMEM中止消化，輕緩吹散表皮碎片；100目細胞篩過濾表皮碎片，余下細胞懸液放置于15 mL離心管；
⑧常溫下IOOg離心5min ；
⑨棄上清，用KSFM輕緩重新懸浮沉淀的細胞，接種于6cm培養皿中，置于37°C 5%C02 培養箱培養，培養時間為18hr ；
⑩吸棄上清，加入新鮮KFSM；之后隔天半量換液，當表皮干細胞密度為50%以上時每天換液，至80%時傳代。如圖2所示。2、低溫處理表皮干細胞消化傳代后，于37°C 5%C02培養箱培養3天，待表皮干細胞貼壁穩定后，放入25 °C 5%C02培養箱低溫處理2天。3、牙胚間充質的分離
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖鏡下利用尖鑷取下胚胎頭部并分離下頌；
②將下頌放入2U/mL的Dispase液體中，37 °C消化8 min ；
③解剖鏡下，利用尖鑷分離磨牙區的牙胚上皮和間充質；
④將8個牙間充質放入裝有含10%FBS的DMEM的離心管中，2000rpm離心5 min，放置于37 V 5% C02培養箱孵育1 hr，形成牙胚間充質團。4、嵌合體重組
①將Trowell器官培養皿外層裝PBS，里層裝含10%FBS的DMEM；同時在里層依次放入支架網和0. 45 μ m的濾膜，里層的液體剛好沒過濾膜；
②利用耳勺將上述步驟3分離的牙胚間充質團挑出，放在準備好的Trowell器官培養皿的濾膜上；
③將密度為80% 90%的表皮干細胞刮下，覆蓋在濾膜上的牙胚間充質團上，即嵌合體構建好，于37 0C 5%C02培養箱孵育過夜。5、移植裸鼠腎囊膜
①將裸鼠麻醉后，剪開腎部位上方的皮膚和肌肉；
②用彎鑷取出腎，在解剖鏡下用尖鑷將腎囊膜剪開一個小口；
③將上述構建好的嵌合體移植入腎囊膜內；
④將移植后的腎放回腹腔，縫合肌肉和皮膚；
⑤裸鼠繼續喂養20天。6、嵌合體的鑒定 (1)固定與切片
①固定將移植20天的嵌合體組織取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定12hr ；
②脫鈣采用10%EDTA脫鈣到嵌合體組織軟化；
③脫水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇進行逐道進行脫水，每道1hr，然后 100%乙醇再重復一次；
④透明按無水乙醇二甲苯為1:1的比例配制透明液，透明處理30 min，然后放入二甲苯至組織透明為止；
⑤透蠟按二甲苯石蠟為1:1的比例配制透蠟液，透蠟處理30 min，然后放入3道石蠟中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖鏡下將組織放入裝滿石蠟的紙盒中，注意組織的前后左右方向；
⑦切片在切片機進行連續切片，貼在載玻片上，在展片機上展片15 20min，6(TC烘干后放置-20°C備用。(2) HE 染色
①脫蠟將上述組織切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②復水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和雙蒸水，每道5min ；
③放入蘇木精染液進行染色8min,自來水沖洗2 min ；
④放入伊紅染液進行染色30s ；⑤脫水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重復一次；
⑥二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察嵌合體是否具有牙本質、成牙本質細胞、牙釉質或成牙釉質細胞的結構僅有牙本質和成牙本質細胞兩種結構計為成牙；具有牙本質、成牙本質細胞、牙釉質和成牙釉質細胞四種結構計為成釉。如圖3所示。最后統計成牙率為58%，成釉率為71%。 與采用37°C、FGF8生長因子能夠誘導人表皮干細胞向成牙釉質細胞分化的方法所得數據 (成牙率約為觀％，成釉率約為31%)相比，分別提高了 30%和40%。實施例2
1、表皮干細胞的分離、培養
①將出生1天的大鼠處死后，取背部皮膚組織放入含4%青霉素/鏈霉素的PBS中清洗兩次，然后在解剖鏡下剪去皮下脂肪組織；
②將其余皮膚組織放入PBS清洗三次；
③將清洗好的皮膚組織放入培養皿中，用棉球沾取碘酒進行上下涂拭，然后立即放入 70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④將消的皮膚組織剪成2cmXO. 5 cm條狀，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II消化 12 hr ；
⑤在解剖鏡下用尖鑷分離經消化的皮膚組織的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥將表皮放入0.25%Trypsin/0. 05% EDTA中，用彎剪將表皮剪碎，放置于37°C消化 12min ；
⑦用37°C預熱的含20%FBS的DMEM中止消化，輕緩吹散表皮碎片；100目細胞篩過濾表皮碎片，余下細胞懸液放置于15 mL離心管；
⑧常溫下IOOg離心5min ；
⑨棄上清，用KSFM輕緩重新懸浮沉淀的細胞，接種于6cm培養皿中，置于37°C 5%C02 培養箱培養，培養時間為20hr ；
⑩吸棄上清，加入新鮮KFSM；之后隔天半量換液，當表皮干細胞密度為50%以上時每天換液，至80%時傳代。2、低溫處理
表皮干細胞消化傳代后，于37°C 5%C02培養箱培養3天，待表皮干細胞貼壁穩定后，放入27 °C 5%C02培養箱低溫處理3天。3、牙胚間充質的分離
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖鏡下利用尖鑷取下胚胎頭部并分離下頌；
②將下頌放入2U/mL的Dispase液體中，37 °C消化8 min ；
③解剖鏡下，利用尖鑷分離磨牙區的牙胚上皮和間充質；
④將8個牙間充質放入裝有含10%FBS的DMEM的離心管中，2000rpm離心5 min，放置于37 V 5% C02培養箱孵育1 hr，形成牙胚間充質團。4、嵌合體重組
①將Trowell器官培養皿外層裝PBS，里層裝含10%FBS的DMEM ；同時在里層依次放入支架網和0. 45 μ m的濾膜，里層的液體剛好沒過濾膜；
8②利用耳勺將上述步驟3分離的牙胚間充質團挑出，放在準備好的Trowell器官培養皿的濾膜上；
③將密度為80% 90%的表皮干細胞刮下，覆蓋在濾膜上的牙胚間充質團上，即嵌合體構建好，于37 0C 5%C02培養箱孵育過夜。5、移植裸鼠腎囊膜
①將裸鼠麻醉后，剪開腎部位上方的皮膚和肌肉；
②用彎鑷取出腎，在解剖鏡下用尖鑷將腎囊膜剪開一個小口；
③將上述構建好的嵌合體移植入腎囊膜內；
④將移植后的腎放回腹腔，縫合肌肉和皮膚；
⑤裸鼠繼續喂養20天。6、嵌合體的鑒定 (1)固定與切片
①固定將移植20天的嵌合體組織取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定12hr ；
②脫鈣采用10%EDTA脫鈣到嵌合體組織軟化；
③脫水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇進行逐道進行脫水，每道1hr，然后 100%乙醇再重復一次；
④透明按無水乙醇二甲苯為1:1的比例配制透明液，透明處理30 min，然后放入二甲苯至組織透明為止；
⑤透蠟按二甲苯石蠟為1:1的比例配制透蠟液，透蠟處理30 min，然后放入3道石蠟中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖鏡下將組織放入裝滿石蠟的紙盒中，注意組織的前后左右方向；
⑦切片在切片機進行連續切片，貼在載玻片上，在展片機上展片15 20min，6(TC烘干后放置_20°C備用。(2) HE 染色
①脫蠟將上述組織切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②復水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和雙蒸水，每道5min ；
③放入蘇木精染液進行染色8min,自來水沖洗2 min ；
④放入伊紅染液進行染色30s ；
⑤脫水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重復一次；
⑥二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察嵌合體是否具有牙本質、成牙本質細胞、牙釉質或成牙釉質細胞的結構僅有牙本質和成牙本質細胞兩種結構計為成牙；具有牙本質、成牙本質細胞、牙釉質和成牙釉質細胞四種結構計為成釉。最后統計成牙率為56%，成釉率為70%。與采用37°C、 FGF8生長因子能夠誘導人表皮干細胞向成牙釉質細胞分化的方法所得數據(成牙率約為 28%，成釉率約為31%)相比，分別提高了 28%和39%。實施例3
1、表皮干細胞的分離、培養
①將取自福州兒童醫院年齡8歲的幼兒包皮環切手術后遺棄的離體^ir內的包皮組織，放入含4%青霉素/鏈霉素的PBS中清洗兩次，然后在解剖鏡下剪去皮下脂肪組織；②將其余皮膚組織放入PBS清洗三次；
③將清洗好的皮膚組織放入培養皿中，用棉球沾取碘酒進行上下涂拭，然后立即放入 70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④將消毒的皮膚組織剪成2cmXO. 5 cm條狀，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化14 hr ；
⑤在解剖鏡下用尖鑷分離經消化的皮膚組織的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥將表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用彎剪將表皮剪碎，放置于37°C消化15
min ；
⑦用37°C預熱的含20%FBS的DMEM中止消化，輕緩吹散表皮碎片；100目細胞篩過濾表皮碎片，余下細胞懸液放置于15 mL離心管；
⑧常溫下IOOg離心5min ；
⑨棄上清，用KSFM輕緩重新懸浮沉淀的細胞，接種于6cm培養皿中，置于37°C 5%C02 培養箱培養，培養時間為20hr ；
⑩吸棄上清，加入新鮮KFSM；之后隔天半量換液，當表皮干細胞密度為50%以上時每天換液，至80%時傳代。2、低溫處理
表皮干細胞消化傳代后，于37。C 5%C02培養箱培養3天，待表皮干細胞貼壁穩定后，放入25 °C 5%C02培養箱低溫處理2天。3、牙胚間充質的分離
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖鏡下利用尖鑷取下胚胎頭部并分離下頌；
②將下頌放入2U/mL的Dispase液體中，37 °C消化9 min ；
③解剖鏡下，利用尖鑷分離磨牙區的牙胚上皮和間充質；
④將8個牙間充質放入裝有含10%FBS的DMEM的離心管中，2000rpm離心5 min，放置于37 V 5% C02培養箱孵育1 hr，形成牙胚間充質團。4、嵌合體重組
①將Trowell器官培養皿外層裝PBS，里層裝含10%FBS的DMEM；同時在里層依次放入支架網和0. 45 μ m的濾膜，里層的液體剛好沒過濾膜；
②利用耳勺將上述步驟3分離的牙胚間充質團挑出，放在準備好的Trowell器官培養皿的濾膜上；
③將密度為80% 90%的表皮干細胞刮下，覆蓋在濾膜上的牙胚間充質團上，即嵌合體構建好，于37 0C 5%C02培養箱孵育過夜。5、移植裸鼠腎囊膜
①將裸鼠麻醉后，剪開腎部位上方的皮膚和肌肉；
②用彎鑷取出腎，在解剖鏡下用尖鑷將腎囊膜剪開一個小口；
③將上述構建好的嵌合體移植入腎囊膜內；
④將移植后的腎放回腹腔，縫合肌肉和皮膚；
⑤裸鼠繼續喂養20天。6、嵌合體的鑒定(1)固定與切片
①固定將移植20天的嵌合體組織取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定12hr ；
②脫鈣采用10%EDTA脫鈣到嵌合體組織軟化；
③脫水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇進行逐道進行脫水，每道1hr，然后 100%乙醇再重復一次；
④透明按無水乙醇二甲苯為1:1的比例配制透明液，透明處理30 min，然后放入二甲苯至組織透明為止；
⑤透蠟按二甲苯石蠟為1:1的比例配制透蠟液，透蠟處理30 min，然后放入3道石蠟中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖鏡下將組織放入裝滿石蠟的紙盒中，注意組織的前后左右方向；
⑦切片在切片機進行連續切片，貼在載玻片上，在展片機上展片15 20min，6(TC烘干后放置_20°C備用。(2) HE 染色
①脫蠟將上述組織切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②復水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和雙蒸水，每道5min ；
③放入蘇木精染液進行染色8min,自來水沖洗2 min ；
④放入伊紅染液進行染色30s ；
⑤脫水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重復一次；
⑥二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察嵌合體是否具有牙本質、成牙本質細胞、牙釉質或成牙釉質細胞的結構僅有牙本質和成牙本質細胞兩種結構計為成牙；具有牙本質、成牙本質細胞、牙釉質和成牙釉質細胞四種結構計為成釉。最后統計成牙率為41%，成釉率為67%。與采用37°C、 FGF8生長因子能夠誘導人表皮干細胞向成牙釉質細胞分化的方法所得數據(成牙率約為觀％，成釉率約為31%，具體見附件的已發表論文)相比，分別提高了 13%和36%。
權利要求
1.一種低溫處理法提高表皮干細胞牙向分化效率的方法，首先將表皮干細胞進行分離和培養，得到傳代的表皮干細胞，而后利用低溫進行處理，同時將分離得到的小鼠胚胎磨牙區的牙胚間充質組織團粒與低溫進行處理后的表皮干細胞進行重組成嵌合體，最后將嵌合體移植裸鼠腎囊膜中進行誘導培養，其特征在于在得到表皮干細胞傳代后，首先于(X)2培養箱進行第一階段培養，待表皮干細胞貼壁穩定后，調低(X)2培養箱的溫度進行第二階段的低溫處理，而后再與小鼠胚胎磨牙區的牙胚間充質組織團粒與低溫進行處理后的表皮干細胞進行重組成嵌合體，最后將嵌合體移植裸鼠腎囊膜中進行誘導培養。
2.根據權利要求1所述的一種低溫處理法提高表皮干細胞牙向分化效率的方法，其特征在于所述的第一階段培養，CO2培養箱溫度為37°C，CO2氣體濃度為3% 8%，培養時間為1. 5 3天。
3.根據權利要求1所述的一種低溫處理法提高表皮干細胞牙向分化效率的方法，其特征在于所述的第二階段培養，CO2培養箱溫度為M 27°C，CO2氣體濃度為3% 8%，培養時間為2 4天。
全文摘要
本發明涉及一種采用低溫處理法提高動物上皮組織來源的表皮干細胞向成牙釉質細胞分化效率的方法。首先將表皮干細胞進行分離培養，得到傳代的表皮干細胞，而后利用低溫進行處理，處理后再與小鼠胚胎磨牙區牙胚上皮和間充質組織團粒進行重組成嵌合體，最后將嵌合體移植裸鼠腎囊膜中進行誘導培養。第一階段培養時，CO2培養箱溫度為37℃，CO2氣體濃度為3%～8%，培養時間為1.5～3天。第二階段培養時，CO2培養箱溫度為24～27℃，CO2氣體濃度為3%～8%，培養時間為2～4天。采用本發明所述的方法，成牙率和成釉率分別至少提高至48%和75%。同時，24～27℃低溫誘導操作簡便，簡易普及。
文檔編號C12N5/074GK102559583SQ20121002473
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月6日 優先權日2012年2月6日
發明者張彥定, 王冰梅, 胡雪峰, 陳一平 申請人:福建師范大學