一種誘導3t3-l1前脂肪細胞分化的試劑組合及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學領域，具體地說是一種促進3T3-L1前脂肪細胞分化的組合物及其在前脂肪細胞誘導分化中的應用。
【背景技術】
[0002]前脂肪細胞是一類具有向脂肪細胞分化潛力的特異性的前體細胞，由多能干細胞或胚胎干細胞分化生成。脂肪細胞是白色脂肪組織(WAT)的主要成分，其本身不能增殖，主要通過前脂肪細胞在各種激素作用下誘導而成。在開始向脂肪細胞分化前，前脂肪細胞形態上類似成纖維細胞，呈長梭形。開始分化后，前脂肪細胞逐漸變圓，同時細胞內甘油三脂的含量逐漸上升，細胞骨架蛋白等的含量下降。細胞內開始出現脂滴，前脂肪細胞逐漸向成熟脂肪細胞轉化。
[0003]動物的前脂肪細胞作為肥胖疾病和糖尿病疾病研究的細胞模型，常用于體外篩選治療上述兩種疾病的藥物。3T3-L1前脂肪細胞是Green和Kehinde于1974年從Swiss 3T3小鼠19天的胚胎中分離出的一種具有分化潛力的細胞株，能在適當的誘導條件下分化為成熟的脂肪細胞。目前，該細胞株已作為體外研究脂肪代謝調控的最常用的細胞模型之一，廣泛地應用于脂肪代謝疾病和新藥開發等領域的科學研究中。
[0004]經典“激素雞尾酒法”被大量運用于前脂肪細胞誘導分化中，其主要成分僅含有IBMX、地塞米松和胰島素。在胰島素、地塞米松和IBMX的刺激下，可通過增加細胞內第二信使一cAMP的濃度，促進前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞。
[0005]三磷酸腺苷除了作為細胞內能量傳遞的重要能量物質。在細胞外還可以作為信號分子，與P 2 (腺嘌呤核苷酸)受體結合參與跨膜信號傳導，發揮其多種生理功能。其在癌癥治療、炎癥控制上有著廣闊的前景。
【發明內容】
[0006]
本發明的目的在于提供一種試劑組合可顯著促進脂肪細胞3T3 -LI分化，具體是是促進自體前脂肪細胞分化及脂滴形成的組合物及其應用。
[0007]為實現本發明的上述目的，本發明提供如下的技術方案:
配方成分:
A誘導分化液:
(I)三磷酸腺苷終濃度 0μΜ，50μΜ，ΙΟΟμΜ, 150μΜ 和 200μΜ。
[0008](2)地塞米松終濃度?μΜ。
[0009](3)胰島素終濃度850ηΜ。
[0010](4) IBMX終濃度 0.25 ηΜ。
[0011]B維持培養液:
(I)三磷酸腺苷終濃度 ΟμΜ，50μΜ，ΙΟΟμΜ, 150μΜ 和 200μΜ。
[0012](2)胰島素終濃度850nM。
[0013]三磷酸腺苷是各種活細胞內普遍存在的一種高能磷酸化合物。在體內組織細胞中作為一切生命活動所需能量的直接來源，儲存和傳遞化學能，當體內吸收、分泌、肌肉收縮及進行生化合成反應需要能量時，三磷酸腺苷即分解成二磷酸腺苷及磷酸基，同時釋放能量。三磷酸腺苷亦能作為一種輔酶，增強細胞的代謝活性，參與蛋白質、脂肪、糖和核苷酸的合成和代謝。在細胞外與P2受體特異性結合，調節細胞生理功能。
[0014]在體外實驗中，小鼠前脂肪細胞3T3-L1作為常用實驗材料，常通過經典的“激素雞尾酒法”將其誘導分化為成熟的脂肪細胞。成熟的脂肪細胞與前脂肪細胞相比，形態變大變圓，通過染色可以看見明顯的脂滴。在分化過程中加入本發明，發現在一定濃度情況下可以顯著促進3T3-L1細胞的分化。在已有關于三磷酸腺苷的報道中未見其對前脂肪細胞分化顯著影響的報道。本發明可以有效促進前脂肪細胞分化，對加快前脂肪細胞的誘導分化有很好的運用前景。
【附圖說明】
[0015]圖1為人工誘導3T3- LI前脂肪細胞分化過程示意圖。
[0016]圖2為不同濃度三磷酸腺苷對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響(油紅O染色)。
[0017]圖3為三磷酸腺苷對3T3 -LI脂肪細胞內甘油三酯含量的影響(尼羅紅染色)。
[0018]圖4為Image-pro Plus6.0圖像處理軟件對3T3- LI脂肪細胞內脂滴數、脂滴總面積、脂滴平均面積、脂滴直徑、數量等指標的統計結果。
[0019]圖5為3T3 -LI脂肪細胞內脂滴平均直徑統計結果。
[0020]圖6為3T3 -LI脂肪細胞內脂滴平均面積統計結果。
【具體實施方式】
[0021]本實施例用到的各種實驗儀器實驗儀器:
超凈工作臺(Thermo，美國)、酶標儀(Thermo，美國)、冷凍離心機(Eppendorf，德國)、高壓滅菌鍋:(Tomy，日本)、細胞CO2培養箱(Thermo，美國)、倒置顯微鏡(Olympus 1X71，日本)、移液槍(Eppendorf，德國)、電子天平(賽多利斯公司，美國)、去離子水系統(Mi I Ipore，美國)。
[0022]實驗試劑:
胎牛血清(Gibco，美國)、DMEM /High Glucose 培養基(Hyclone，美國)、IBMX(Sigma，美國)、地塞米松(Sigma，美國)、胰島素(Sigma，美國)、三磷酸腺苷(sigma，美國)、Na0H溶液、油紅O染料0、？83 0^10加，美國)、尼羅紅染料(Lonza，美國)、10%多聚甲醛、75%酒精、超純水、濾紙、48孔板(Coring，美國)、0.25%胰酶(Hyclone，美國)、無水異丙醇、細胞培養瓶(Coring，美國)、Hepes緩沖劑(Sigma，美國)。
[0023]實施例1:所需各種試劑的配制:
(I)胰島素溶液配制:
將1mg胰島素干粉溶解于0.02M HCl溶液，得到1.7mM胰島素溶液；取0.1ml 1.7mM溶液加入0.9ml基礎培養液中成170μΜ胰島素溶液。
[0024](2)地塞米松溶液配制: 取地塞米松干粉3.925mg溶解于Iml無水乙醇中，得到1mM地塞米松；取0.1ml1mM的地塞米松加入0.9ml PBS中成為ImM的地塞米松溶液。
[0025](3) IBMX 溶液配制:
將5.56mg IBMX干粉溶解于0.5ml的KOH (0.5M)溶液中，得到50mM IBMX溶液。
[0026](4)完全培養液配制:
取DMEM(High Glucose)培養液一瓶500ml，加入胎牛血清(FBS) 55ml以及1.38gHepes緩沖劑，用lmol/L NaOH溶液調pH=至7。用0.22 μ m的微孔過濾器除菌，裝入500ml培養液瓶。
[0027](5)誘導分化培養液: