專利名稱：篩查16SrXII組植原體的芯片及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物信息學及生物檢疫鑒定技術領域，尤其涉及篩查16SrXII組植原體的芯片及其應用。
背景技術：
16Sr XII組植原體主要包括澳大利亞植原體候選種、Bois Noir植原體、頑固植原體(stolbur)等多種植原體。葡萄金黃化病是歐洲最具經濟影響的葡萄黃化病，在歐洲葡萄園導致巨大產量損失。由澳大利亞植原體候選種引起的葡萄黃化病(以下簡稱為AusGY) 在澳大利亞新南威爾士和維多利亞溫暖地區的葡萄園中頻繁發生。此外，澳大利亞植原體候選種還可以引起多種經濟作物的嚴重病害侵染葡萄時，引起葡萄黃化病，其癥狀和危害與葡萄金黃化病相似；侵染草莓時，引起草莓致死性黃化病，可導致草莓苗死亡；侵染番木瓜時，引起番木瓜頂枯病，是毀滅性病害；侵染澳洲朱蕉時，引起澳洲朱蕉猝衰病；侵染新西蘭亞麻時，引起新西蘭亞麻黃葉病，是致死性病害。因此，經濟影響十分重要。
有觀點認為澳大利亞植原體候選種起源于新西蘭并隨后傳播到澳大利亞。盡管許多方面尚不清楚，但在其它植物上已經掌握的證據表明，應將其列為檢疫性病害。EPPO也已經將此病列入警戒名單。澳大利亞植原體候選種專性寄生在寄主植物的韌皮部組織的篩管細胞中和介體昆蟲如Oliarus atkinsoni Myers體內。迄今無法在活體外人工培養。 用DAPI或Hoechst 33258熒光染色法可以在熒光顯微鏡下從韌皮部組織中觀察到植原體的特異熒光，只有在電子顯微鏡下才能看清其粒體形態。澳大利亞植原體候選種無細胞壁， 形態多樣，大小一般在80 lOOOnm。目前對AusGY的研究尚不夠深入，對其發生規律和侵染循環尚不清楚。葡萄上的傳播介體昆蟲尚不明確。有研究報道說澳大利亞和新西蘭野生的一種臭草屬植物Coprosma robusta可能是澳大利亞植原體候選種的庫源寄主。盡管在新西蘭亞麻上已經明確葉蝶Oliarus atkinsoni是葡萄金黃化植原體的傳播介體,但0.atkinsoni是單食性昆蟲,肯定不是其它植物上的傳播介體。由于澳大利亞植原體候選種的寄主范圍廣泛，因此，在不同植物上，其生活史會有所不同，侵染循環也復雜化。澳大利亞植原體候選種為種苗傳，而且寄主范圍廣，易通過多種植物繁殖材料的進口貿易運輸傳入。
在新西蘭很早就查明葉蝶Oliarus atkinsoni在新西蘭亞麻上是該植原體的傳播介體，但在葡萄等其它植物上的傳播介體尚不清楚。不過有一點可以肯定在不同的寄主上，澳大利亞植原體候選種存在不同的傳播介體。0. atkinsoni主要危害新西蘭亞麻,有可能隨引種的新西蘭亞麻傳入。
目前，針對16SrXII組植原體的檢測方法主要為①血清學檢測方法，靈敏度不高， 易產生假陽性基于核酸的分子生物學檢測技術，主要包括PCR、實時熒光PCR等技術，靈敏度和特異性相對較高，但存在交叉污染，在通用性和標準化方面存在不足。發明內容
本發明的一個目的是提供一種篩查16SrXII組植原體的探針。
本發明提供的篩查16SrXII組植原體的探針，由3條探針組成，所述3條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列I-序列3。
上述探針中，所述16SrXII組植原體為澳大利亞植原體候選種。
本發明的另一個目的是提供一種篩查16SrXII組植原體的基因芯片。
本發明提供的篩查16SrXII組植原體的基因芯片，為將上述的探針固定在片基表面得到的基因芯片。
在上述基因芯片中，所述片基為醛基化玻璃片基，在本發明的實施例中采用的是博奧生物有限公司晶芯 微陣列基片，產品目錄號420022。
在上述基因芯片中，所述16SrXII組植原體為澳大利亞植原體候選種。
本發明的第三個目的是提供一種篩查16SrXII組植原體的試劑盒。
本發明提供的試劑盒，包括上述的基因芯片。
在上述試劑盒中，還包括如下引物組
所述弓丨物組由引物對A和引物對B組成；
所述引物對A由引物I和引物2組成；
所述引物對B由引物3和引物4組成；
所述引物I的核苷酸序列為序列表中的序列4
所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列5
所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6
所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7
上述試劑盒由上述的基因芯片和上述引物組組成。
上述試劑盒中，所述16SrXII組植原體為澳大利亞植原體候選種。
本發明的第四個目的是提供一種用于篩查16SrXII組植原體的引物組。
本發明提供的引物組，由引物對A和引物對B組成；
所述引物對A由引物I和引物2組成；
所述弓丨物對B由引物3和引物4組成；
所述引物I的核苷酸序列為序列表中的序列4
所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列5
所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6
所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7
上述引物組中，所述16SrXII組植原體具體為澳大利亞植原體候選種。
本發明還提供一種用于篩查16SrXII組植原體的PCR試劑。
本發明提供的PCR試劑，由上述的引物組、dNTP、PCR緩沖液和聚合酶組成。
上述PCR試劑中，上述引物組中的各條引物在所述PCR試劑中的濃度均為0.2mmol/L。
上述PCR試劑中，所述16SrXII組植原體具體為澳大利亞植原體候選種。
上述探針、上述基因芯片、上述的試劑盒、上述的引物組或上述的PCR試劑在鑒定或輔助鑒定16SrXII組植原中的應用也是本發明保護的范圍。
上述探針、上述基因芯片、上述的試劑盒、上述的引物組或上述的PCR試劑在制備鑒定或輔助鑒定16SrXII組植原體產品中的應用也是本發明保護的范圍。CN 102534022 A
在上述應用中，所述16SrXII組植原體具體為澳大利亞植原體候選種。
本發明的第五個目的是提供一種篩查或輔助篩查待測樣品感染16SrXII組植原體的方法。
本發明提供的方法，包括如下步驟
I)將待測樣品的基因組DNA進行標記，得到標記后產物；
2)將步驟I)得到的標記后產物與上述的基因芯片進行雜交，得到雜交后芯片；
3)將步驟2)得到的雜交后芯片掃描，
若所述基因芯片上的至少一條所述探針的信號絕對值大于5000且信噪比大于3.0，則待測樣品感染或候選感染16SrXII組植原體。
所述至少一條所述探針為3條所述探針中的任意一條。
在上述方法中，步驟I)中，所述標記為以待測樣品的基因組DNA為模板，以上述引物組進行PCR擴增，得到標記后產物；
在上述方法中，步驟2)中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h。
在上述方法中，在所述步驟2)后和步驟3)前還包括將所述雜交后芯片進行洗滌的步驟；
在上述方法中，所述至少一條所述探針為3條所述探針中的任意一條；
在上述方法中，所述16SrXII組植原體為澳大利亞植原體候選種。
本發明的實驗證明，本發明提供的篩查16SrXII組植原體的芯片中的探針具有 16SrXII組植原體組水平上的高兼容性和植原體組內的特異性，數小時內完成對待檢樣品中可能存在的新發植原體的篩查，所需的樣品量極少，一般僅需0. lg。另外數據的分析與計算機圖像處理軟件相結合，達到分析結果能夠直觀化、可視化。本發明采用生物信息學方法對16SrXII組植原體的16Sr DNA和tuf核苷酸序列進行分析，設計了該組的兼容性探針， 標準植原體樣品驗證結果證明探針效果良好。本發明的篩查16SrXII組植原體的芯片可用于16SrXII組植原體的檢疫鑒定，利用DNA芯片技術具有高通量、快速、穩定性好、防交叉污染等優點，針對16SrXII組植原體設計通用型引物與探針并實施DNA芯片檢測技術可以大大提高我國檢驗檢疫口岸通關速率，并對于未知的、新發植原體進行有效的監測與鑒定。
圖I為16SrXII組植原體篩查芯片探針點陣示意圖(3X4)
圖2為應用澳大利亞植原體候選種標準樣品驗證16SrXII組植原體篩查芯片的結果
圖3為篩查芯片靈敏度檢測結果
圖4為PCR靈敏度檢測結果具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例I、篩查16SrXII組植原體的芯片的制備
I、組級高兼容性寡核苷酸探針的設計
I)從美國國立生物技術信息中心(NCBI)及核糖體數據庫項目官方網站(RDP)數據庫下載16SrXII組植原體全基因組及核酸序列數據用于設計探針。
2)整理植原體核酸序列，去除小于200bp長度的核酸序列并分組；同一組內所有植原體序列簡稱為組內序列，非本組的所有植原體序列簡稱為組外序列。
3)使用Cluster W聯配組內序列，尋找序列保守區域設計探針。探針設計時在序列保守區域內以2 3個堿基作為間隔，連續提取所有19bp的核酸序列，對選取的核酸序列進行篩選，標準為GC含量在40%及60%之間，沒有大于3bp的連續重復堿基，以及不會形成大于3bp的發卡結構。
4)使用自編程序將通過步驟3)篩選的探針序列與組外序列聯配，程序計算二級結構的自由能、MMPD(The distance of the mismatch in the middle position)、最長相同片段等條件進行綜合打分，棄用高于模擬雜交標準分的探針。
5)使用自編程序將通過步驟4)篩選的探針序列與組內序列進行比對，程序計算打分，棄用低于模擬雜交標準分的探針。
6)使用BLASTN將通過步驟5)篩選得到的探針序列與步驟2)得到的特異性數據庫進行特異性比對，Word size設為7,篩選標準為Max Score小于15分,并且無7bp以上的相同片段
7)對于剩余的每一條探針進行排序，排序標準依次為探針對組內序列模擬雜交總分、探針對組外序列模擬雜交總分及探針對特異性數據庫的BlastN Max Score總分,取排名前兩名的兩條探針為組特異性探針。
8)如果經過步驟7)無法達到每組至少I個探針對應的標準，則在步驟3)降低序列保守性標準，重新設計，依此循環直到所有16SrXII組序列都有I個探針對應。如果無法從保守區域設計探針，或16SrXII組內序列無保守區域，則使用所有16SrXII組全長序列設計探針。探針設計標準與步驟3)到步驟7)相同。
根據上述原則設計了 16Sr DNA區域的I條探針(探針24，序列I)和tuf區域的2 條探針(探針71，序列2和探針72，序列3)，其核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1-3 所示。
可以人工合成上述3條探針。
2、芯片的制備
上述I得到的3條探針用點樣緩沖液(博奧生物有限公司晶芯 芯片點樣液，產品目錄號440010)溶解，濃度為50 PM，每條探針橫向重復2點點在醛基化玻璃片基芯片 (博奧生物有限公司晶芯 微陣列基片，產品目錄號420022)上，每點約0. 25nL，點直徑約 180iim，點間距為300 iim，點樣均勻度的標準方差為15%。將芯片點有探針的一面在65°C 水浴鍋上水合10s，芯片距水面距離為3cm，在空氣中室溫自然干燥，在進行一次水合。將點有探針的一面向上，放在紫外交聯儀中250mJ交聯。將芯片放在42°C預熱，0. 5% SDS清洗lOmin。將芯片轉移到42°C預熱蒸懼水中清洗2min。把芯片放在50ml錐形離心管中， 2000rpm離心lmin，以去除芯片表面的液體，獲得篩查16SrXII組植原體的芯片。
篩查16SrXII組植原體的芯片如圖I所示，圖I中24、71和72為16SrXII組植原體篩查芯片探針24、71和72 (對應序列I-序列3)，Hex為芯片固定陽性質控，PC為雜交陽性質控，NC為雜交陰性質控。
實施例2、篩查16SrXII組植原體的芯片的應用
一、篩查16SrXII組植原體的芯片檢測樣品
I、用于檢測的樣品總DNA提取
I)取感染澳大利亞植原體候選種的葡萄葉片(葉片表現紅花、卷曲，植原體拉丁名candidatus phytoplasma australiense,記載在Candidatus Phytoplasma australiense is the phytoplasma associated with Australian grapevine yellows, papaya dieback and Phormium yellow leaf diseases, 1998,104 :619-623.公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。)0. lg，取適量液氮研磨，再加入研磨液(K2HPO4. 3H20 2. 17g， KH2PO4O. 41g,蔗糖 10g, BSA (Fraction V) 0. 15g, PVP_102g 定容至 IOOmL,調 DH 至 7. 6 后高溫滅菌)2mL充分研磨，4°C 20000rpm離心20min,棄上清。
2)加入 ImL DNA 提取液(Tris-HCl 100mM,EDTA 100mM,NaCl 250mM調 pH至 8. 0)， 40iiL蛋白酶K(5mg/mL)，輕輕混勻，加入160 u L 10%十二烷肌氨酸鈉，混勻，在55°C溫育 2小時,期間不斷的顛倒混勻，4°C 6000rpm, IOmin,取上清。
3)加入2/3體積異丙醇到上清液中，輕混勻，-20°C保持至少30min，4°C 12000rpm, 15分鐘，棄上清。
4)加入600 ii L帶有RNase的水液，加入30 iUSDS，12 ii L蛋白酶K，輕輕徹底混勻， 37°C溫育60分鐘。
5)加 100 U L 5M NaCl 混勻，再加入 84 U L CTAB/NaCl 溶液，65°C溫育 10 分鐘。
6)加入等體積苯酚氯仿異戊醇(25 24 I)混勻，4°C 12000rpm，10分鐘，重復直至無中間白色層。
7)上層水相加入等體積氯仿異戊醇(24 1)，混勻，4°C 12000rpm，10分鐘。
8)上清液加入2/3體積異丙醇，混勻，_20°C保持至少30分鐘，4°C 12000rpm, 10分鐘，棄上清液。
9)加入ImL 70%乙醇12000rpm離心I分鐘，洗滌兩次，加入30 u L TE混勻溶解， 得到澳大利亞植原體候選種的總DNA(基因組DNA)。
2、樣品標記與雜交
標記體系為20 U L,即在0. 2mL的反應管中加入2 ii L上述I得到的基因組DNA、 上游引物0. 2 ii L (終濃度為0. 2mmol/L)、下游引物0. 2 y L (終濃度為0. 20mmol/L，5’端 TAMARA 標記)、dNTP Mix (10mmol/L) I. 6u L, LA-Taq 酶 0. 5 y L、10 XBuffer (Mg2+) 2 y L 及 DEPC-H2O 13. 5 u L0
上下游引物由用于擴增16S rDNA的引物對和用于擴增tuf的引物對組成，
上述用于擴增16S rDNA的引物對由序列表中的序列4和序列表中的序列5組成
上游引物AGAGITTGATCMTGGCTCAG (序列 4)
下游引物GGTTACCTTGTTACGACTT (序列 5)
上述用于擴增tuf的引物對由序列表中的序列6和序列表中的序列7組成
上游引物:5，-CAAATTGATAAYGCTCCTGA A-3，(序列 6)；
下游引物5’-ACGGAAATAG AATTGMGGAC G-3’(序列 7)；
PCR 反應程序94°C 5min ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C lmin 30sec, 35cycles ； 72°C IOmin。
雜交雜交液包括2. 4uL 3XSSC.0. 32 u L 0. 2% SDS,4u L 25% 甲酰胺、0. 32 y L 外標、I. 6 u L 5XDenhard’s及標記樣品7. 36 u L ;95°C變性3min,冰浴5min,瞬時離心；將雜交液加到由實施例I得到的16SrXII組植原體篩查芯片上，蓋薄片蓋好，42°C水浴雜交過夜(12h)，得到雜交后的芯片(澳大利亞植原體候選種)。
3、洗滌、掃描
清洗體系及程序如下
洗液I洗液II洗液組分(最終濃度)2xSSC, 0.2%SDS 0.2XSSC清洗溫度42 V42 V清洗時間4min4min
先將洗液I、II放在微波爐中預熱到42°C，轉移到清洗盒中。雜交結束后，將雜交后的芯片轉移到盛放洗液的清洗盒中，雜交面向上，放在水平搖床上緩慢清洗。芯片清洗后，放在50mL錐形離心管中，2000rpm離心lmin，除去芯片表面的液體，分別得到待檢測芯片(澳大利亞植原體候選種)。
將上述待檢測芯片(澳大利亞植原體候選種)置于掃描儀中進行掃描分析；PMT 設為900，獲得各點熒光強度、背景強度等數據。
使用博奧生物開發的LuxScan 3. 0從掃描的芯片中提取數據，探針的信號值為探針前景值的中位值減去背景值的中位值，信噪比為圖像對應點內所有信號值中位值與背景值中位值的比值。
若至少一條所述探針的信號絕對值均大于5000且信噪比均大于3. 0，判為陽性 (為16SrXII組植原體感染);探針的信號絕對值均小于5000且信噪比均小于2. 0，判為陰性(不為16SrXII組植原體感染)；如果信號模糊且信噪比介于2.0和3.0之間，判為可疑，實驗需重復驗證。
圖2的探針排列與圖I相同，陽性探針均為24、71、72。
澳大利亞植原體候選種的結果如圖2所示，探針24、71、72有信號，探針24、71、72 所在位置的信號絕對值均大于7000 ;且信噪比均為4，說明本發明可以檢測16SrXII組植原體的澳大利亞植原體候選種；
上述芯片的固定陽性質控、雜交陽性質控及雜交陰性質控表現良好，標準樣品雜交信號強而無背景噪音，說明設計的探針及建立的芯片篩查程序具有良好的工作效果。
二、篩查16SrXII組植原體芯片與PCR檢測靈敏度比較
準確稱取0. Ig澳大利亞植原體候選種感染的葡萄葉片，提取基因組DNA，分別用于16SrXII組植原體篩查芯片檢測和PCR檢測，兩者所用的DNA (初始濃度為300ng/ u L) 均進行5°、5_\5_2、5_3和5_4倍梯度稀釋。
芯片檢測的方法同上述的一；
芯片檢測實驗結果如圖3所示，圖3的探針排列與圖I相同，其中A :5_2稀釋；B 5_3稀釋；C :5_4稀釋；可以看出，16SrXII組植原體篩查芯片可檢測到待檢對象的最高稀釋倍數為54。
PCR檢測的引物為
上游引物5’-CAAAITGATAAyGCTCCTGAA-3’(序列 6)；
下游引物5’-ACGGAAATAGAAITGMGGACG-3’(序列 7)；
PCR檢測的結果如圖4所示，I 5°稀釋；2 :5^1稀釋；3 :5_2稀釋；4 :5_3稀釋；5 :5_4 稀釋；M =Marker DL2000，可以看出，均得到858bp的產物(Genbank號AJ271317的第86-943 位核苷酸)，待檢對象的最高稀釋倍數為54。
因此，16SrXII組植原體篩查芯片檢測靈敏度與PCR方法靈敏度相當。
權利要求
1.一種篩查16SrXII組植原體的探針，由3條探針組成,所述3條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列I-序列3。
2.—種篩查16SrXII組植原體的基因芯片，為將權利要求I所述的探針固定在片基表面得到的基因芯片。
3.根據權利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述片基為醛基化玻璃片基；所述 16SrXII組植原體為澳大利亞植原體候選種。
4.一種篩查16SrXII組植原體的試劑盒，包括權利要求2或3所述的基因芯片。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括如下引物組 所述引物組由引物對A和引物對B組成；所述引物對A由引物I和引物2組成；所述引物對B由引物3和引物4組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述試劑盒由權利要求2或3所述的基因芯片和所述引物組組成；所述16SrXII組植原體為澳大利亞植原體候選種。
6.一種用于篩查16SrXII組植原體的引物組，由引物對A和引物對B組成；所述引物對A由引物I和引物2組成；所述引物對B由引物3和引物4組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述16SrXII組植原體具體為澳大利亞植原體候選種。
7.權利要求I所述探針、權利要求2或3所述的基因芯片、權利要求4或5所述的試劑盒或權利要求6所述的引物組在鑒定或輔助鑒定16SrXII組植原體中的應用；所述 16SrXII組植原體具體為澳大利亞植原體候選種。
8.權利要求I所述探針、權利要求2或3所述的基因芯片、權利要求4或5所述的試劑盒或權利要求6所述的引物組在制備鑒定或輔助鑒定16SrXII組植原體產品中的應用；所述16SrXII組植原體具體為澳大利亞植原體候選種。
9.一種篩查或輔助篩查待測樣品感染16SrXII組植原體的方法，包括如下步驟1)將待測樣品的基因組DNA進行標記，得到標記后產物；2)將步驟I)得到的標記后產物與權利要求2或3所述的基因芯片進行雜交，得到雜交后芯片；3)將步驟2)得到的雜交后芯片掃描，若所述基因芯片上的至少一條所述探針的信號絕對值大于5000且信噪比大于3. 0，則待測樣品感染或候選感染16SrXII組植原體。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于步驟I)中，所述標記為以待測樣品的基因組DNA為模板，以權利要求4或5所述的試劑盒或權利要求6所述的引物組進行PCR擴增，得到標記后產物；步驟2)中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h;在所述步驟2)后和步驟3)前還包括將所述雜交后芯片進行洗滌的步驟；所述至少一條所述探針為3條所述探針任意一條；所述16SrXII組植原體為澳大利亞植原體候選種。
全文摘要
本發明公開了一種篩查16SrXII組植原體的芯片及其應用。本發明的篩查16SrXII組植原體的探針由3條探針組成，所述3條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-3。還提供了篩查16SrXII組植原體的基因芯片，為將上述的探針固定在片基表面得到的基因芯片。本發明的實驗證明，本發明提供的篩查16SrXII組植原體的芯片中的探針具有16SrXII組植原體組水平上的高兼容性和植原體組內的特異性，數小時內完成對待檢樣品中可能存在的新發植原體的篩查，所需的樣品量極少，一般僅需0.1g。另外數據的分析與計算機圖像處理軟件相結合，達到分析結果能夠直觀化、可視化。
文檔編號C12Q1/68GK102534022SQ20121002496
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月6日 優先權日2012年2月6日
發明者張永江, 朱水芳, 牟海清, 趙文軍 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院