專利名稱：MDRPA中merA基因的檢測引物及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種多藥耐藥銅綠假單胞菌(MDRPA)中耐消毒劑merA基因攜帶情況的檢測方法，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
消毒防腐劑在生活中的應用和發展已有幾個世紀。從經驗性地用銅和銀打造的容器來儲存飲用水，用醋和蜂蜜清洗傷口，用香料保存魚和肉，到用碘酒作為傷口消毒劑，在產科中應用含氯水溶液，將苯酚作為傷口敷料以及在外科中作為抗菌劑，和將二價汞離子用作殺芽孢劑，整個消毒防腐劑都處在不斷的發展之中。20世紀初人類又進一步開發了雙胍類(CRAs)和季胺類消毒劑(quateraryammon ium compounds，QACs)。到了 20 世紀 40 年代，常用的消毒防腐劑已有酚類化合物、有機汞、雙胍類消毒劑、季胺類消毒劑、碘及其復合物、乙醇、甲醛、過氧化氫、銀化合物、染料(如吖啶、三苯甲烷)和兩性表面活性劑。直到目前，這些消毒劑中的大多數仍在廣泛地使用。盡管消毒防腐劑一直在更新換代之中，但是在其廣泛的選擇壓力下，細菌仍然漸漸產生了耐藥性。現已發現，細菌對季胺類、雙胍類以及重金屬等消毒防腐劑的耐藥與細菌本身的耐藥基因有關。merA基因編碼二價汞離子還原酶，攜帶該基因的細菌專一性地對汞離子耐藥。該基因廣泛分布于革蘭陽性和陰性細菌體內，可以在革蘭陽性和陰性菌體之間相互轉導，并且經常與抗生素耐藥基因連鎖于同一質粒如PSN 2M上。Timg等將從健康兒童口腔中分離得到的革蘭陰性細菌用100-200mmol的汞離子溶液反復誘導，然后通過DNA-DNA雜交和PCR 技術檢測merA基因的存在，結果表明，在8個革蘭陰性菌菌屬中檢測到merA基因，它們分別是檸檬酸桿菌屬、奈瑟菌屬、不動桿菌屬、埃希桿菌屬、腸道細菌屬、克雷伯菌屬、假單胞菌屬和粘質沙雷菌。經過對不動桿菌和大腸埃希菌中分離到的IOOObp基因進行測序，發現它們與金葡菌的merA基因的同源性高達95% -96% ；與枯草芽胞桿菌的merA基因的同源性也高達89% -97% ο目前檢測merA基因攜帶情況的方法主要有PCR后瓊脂糖凝膠電泳、測序。凝膠電泳法成本低、易操作，但靈敏度低，容易出現假陰性；測序是檢測基因突變的金標準，但測序技術步驟繁瑣、耗時長、容易污染。
發明內容
本發明的目的是提供多藥耐藥銅綠假單胞菌(MDRPA)中耐消毒劑merA基因攜帶情況的PCR檢測引物及其檢測方法。為了達到上述目的，本發明提供了一組MDRPA中merA基因的檢測引物，其特征在于，包括(八).11^八基因正向弓|物5，-0區8區088(；(^88081徹(；-3，；(B) .merA 基因反向弓 I物5，_acttgcggatcggtgaac_3，。本發明還提供了一種MDRPA中merA基因的檢測方法，其特征在于，采用上述MDRPA中merA基因的檢測引物，具體步驟為第一步取經培養后鑒定為MDRPA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本 DNA,作為檢測樣品；取不攜帶merA基因的銅綠假單胞菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成merA序列，構建攜帶merA基因的重組質粒為陽性對照品；第二步用無菌水配制濃度為5-15umol/L的merA基因正向引物溶液，濃度為5-15umol/L的merA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的merA基因檢測探針溶液；merA基因正向引物的序列為5，-cgagcaacccgaacatctac-3，，merA基因反向引物的序列為5’ -acttgcggatcggtgaac-3’，merA基因檢測探針的序列為 FAM-accggcggcgatg-MGBNFQ ；第三步在每一個PCR反應孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的merA基因正向引物溶液0. l_lul、merA基因反向引物溶液0. I-Iul、merA基因檢測探針溶液0. Ι-lul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品0. Ι-lul，用滅菌重蒸餾水補足25ul ；在熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-10(TC保溫1_3分鐘，再運行30-50個循環，每個循環包括在 80-100°C保溫 10-20 秒，再在 50-70°C保溫 0. 5-1. 5 分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進行結果分析，PCR結果呈S形曲線即為攜帶merA基因。本發明是對多藥耐藥銅綠假單胞菌中是否還有耐消毒劑merA基因的檢測，細菌一旦獲得此基因即可對現用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過檢測了解細菌中merA基因的攜帶情況，有利于對含有耐消毒劑基因的菌株的監控，防止菌株繼續流行，同時從科研角度對其耐藥機理的進一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開發。本發明基于實時熒光定量PCR技術，應用具有分辨率更高、雜交特異性更強、重現性好等特點的Taqman-MGB探針，不僅檢測率高、可重復性強，檢測速度快，全部反應在封閉的反應管中完成，有效避免了交叉污染，且自動化程度高，能夠實時監控，提供質控標準品， 使結果判讀更直觀。
圖1為攜帶merA基因的陽性對照品的Realtime PCR曲線圖；圖2為Realtime PCR陰性對照品的Realtime PCR曲線圖；圖3為攜帶merA基因檢測樣品的Realtime PCR曲線圖；圖4為merA基因檢測樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5為merA基因檢測樣品的測序圖。
具體實施例方式以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。實施例1、采用固相亞磷酰胺三酯法制備一組用于檢測MDRPA中merA基因攜帶情況的引物，包括merA 基因正向弓I物5，-cgagcaacccgaacatctac-3‘；merA 基因反向弓I物5，-acttgcggatcggtgaac-3'
2、檢測方法(1)取經培養后鑒定為多藥耐藥銅綠假單胞菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活， 用商品化的細菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術有限公司，YP030(^)提取樣本DNA，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，置-20°C保存，待用；將標準銅綠假單胞菌株(保藏單位中國農業微生物菌種保藏管理中心，保藏編號ATCC Number :27853)，高溫滅活， 用商品化的細菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術有限公司，YP030(^)提取樣本DNA，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，作為陰性對照品；人工合成merA序列(由上海生工合成)，構建攜帶merA基因的重組質粒，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，為陽性對照品。(2)根據merA基因的保守區域，采用ABI Primer Express 3.0實時熒光定量PCR 引物設計軟件，設計合成引物及Taqman探針，探針序列一端標記有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料(由上海生工合成)，用無菌水配制濃度為lOumol/L的merA基因正向引物溶液，濃度為lOumol/L的merA基因反向引物溶液以及濃度為lOumol/L的merA基因檢測探針溶液，其中，引物和檢測探針序列如下merA 基因正向弓I物5，-cgagcaacccgaacatctac-3，；merA 基因反向弓I物5，_acttgcggatcggtgaac_3，；merA 基因檢測探針FAM_accggcggcgatg-MGBNFQ。(3)在每一個 PCR 反應孔中加入 PCR Master Mix (Applied Biosystems 公司生產的 iTaqman Universal PCR Master Mix 2X，包括 10XPCR 緩沖液、MgC12、dNTP、DNA 聚合酶)12. 5ul，merA基因正向引物溶液0. 5ul，merA基因反向引物溶液0. 5ul，merA基因檢測探針溶液0. 5ul。然后在不同的PCR反應孔中分別加入步驟(1)得到的檢測樣品、陰性對照品或陽性對照品0. 5ul，最后用滅菌重蒸餾水補足25ul。在ABI7300型熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為50°C保溫2分鐘，95°C保溫2分鐘，再運行40個循環，每個循環包括在95°C保溫15秒，再在60°C保溫1分鐘。(4)用軟件SDS2. 2進行結果分析，如圖1所示，為陽性對照品的Realtime PCR曲線，呈S形。如圖2所示，為陰性對照品的Realtime PCR曲線，為非S形。如圖3所示，為檢測樣品的Realtime PCR曲線，呈S形。得出判斷，該樣品為攜帶merA基因菌株。利用本發明對超過100例MDRPA樣本的檢測結果顯示，根據上述方法進行的merA 基因攜帶情況檢出率可達99%以上，可重復性達到100%。而瓊脂糖凝膠電泳法的檢出率約80%，如圖4所示，為merA基因檢測樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖；本發明與直接測序法相比，結果一致性可達到99. 5%以上，如圖5所示，為merA基因檢測樣品的測序圖。
權利要求
1.MDRPA中merA基因的檢測引物，其特征在于，包括(A)· merA 基因正向弓I物5，-cgagcaacccgaacatctac-3，；(B).merA 基因反向弓I物5，-acttgcggatcggtgaac-3，。
2.—種MDRPA中merA基因的檢測方法，其特征在于，采用權利要求1所述的MDRPA中 merA基因的檢測引物，具體步驟為第一步取經培養后鑒定為MDRPA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶merA基因的銅綠假單胞菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成merA序列，構建攜帶merA基因的重組質粒為陽性對照品；第二步用無菌水配制濃度為5-15umol/L的merA基因正向引物溶液，濃度為5-15umol/L的merA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的merA基因檢測探針溶液；merA基因正向引物的序列為5，-cgagcaacccgaacatctac-3', merA基因反向引物的序列為5’ -acttgcggatcggtgaac-3’，merA基因檢測探針的序列為 FAM-accggcggcgatg-MGBNFQ ；第三步在每一個PCR反應孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的 merA基因正向引物溶液0. l_lul、merA基因反向引物溶液0. I-Iul、merA基因檢測探針溶液0. Ι-lul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品0. Ι-lul，用滅菌重蒸餾水補足25ul ；在熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-10(TC保溫1_3分鐘，再運行30-50個循環，每個循環包括在 80-100°C保溫 10-20 秒，再在 50-70°C保溫 0. 5-1. 5 分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進行結果分析，PCR結果呈S形曲線即為攜帶merA基因。
全文摘要
本發明公開了一組MDRPA中merA基因的檢測引物及使用該引物的檢測方法。所述的MDRPA中merA基因的檢測引物其特征在于，包括merA基因正向引物5’-cgagcaacccgaacatctac-3’；merA基因反向引物5’-acttgcggatcggtgaac-3’。檢測方法為取經培養后鑒定為MDRPA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶merA基因的銅綠假單胞菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成merA序列，構建攜帶merA基因的重組質粒為陽性對照品；分別進行PCR反應。本發明檢測率高、可重復性強。
文檔編號C12R1/385GK102534028SQ201210032899
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月14日 優先權日2012年2月14日
發明者傅詠南, 張奕, 王校 申請人:上海中優醫藥高科技有限公司