專利名稱：人乳頭瘤病毒的定型、定量基因檢測方法
技術領域：
本發明屬于臨床病原體DNA檢測方法，檢測對象為乳頭瘤病毒(Papillomavirus)，尤其是可以致癌的高危險型人乳頭瘤病毒(HPV)。
背景技術：
乳頭瘤病毒(Papillomavirus)乳頭瘤病毒是雙股DNA小分子病毒，全長7KB左右，感染人類的主要是人乳頭瘤病毒，分為皮膚型和粘膜型，后者感染生殖道是造成女性宮頸炎和男性前列腺炎的原因，并且證實高危型HPV持續感染是幾乎所有宮頸癌和大部分前列腺癌的病因，同時越來越多的證據顯示在口腔、食道癌中HPV也有致病作用。
致癌的高危險型人乳頭瘤病毒(HPV)高危型HPV的分型依據來自多年的流行病學資料，那些最常見于宮頸癌標本中的HPV類型成為高危型。國際上規定和各種已知HPV的全基因組序列差異大于10％的HPV可以稱為獨立的新亞型。現在確定的10種高危型HPV是16、18、31、33、35、45、51、52、58、59，為婦科臨床、病毒和遺傳專家所公認。
現有的檢測方法巴氏涂片PAP SMEAR是一種常用的細胞學宮頸檢查，能發現癌前的不典型細胞和宮頸癌細胞，是預防和早期發現宮頸癌的主要普查方式，缺點是不能檢測HPV，只能等到HPV感染發展至癌前病變，此時已經太晚。
基于雜交的檢測具代表性的是HC方法。缺點是靈敏度低，對少于10+E4病毒無法檢測。操作復雜，從DNA結合、洗脫到測定需要嚴格的反應條件和復雜的檢測設備，干擾因素多，常常帶有較強的背景干擾，目的DNA在測定過程中易降解和丟失。得出的結果數據不確切，只能判斷種屬差異，需DNA序列大于30％，無法精確了解核苷酸構成信息，缺乏分型能力。
PCR即聚合酶鏈式反應，由K.B.Mullis發明(美國專利4683202)，可在短時間內使組織樣本中含有的病毒DNA片段得到快速擴增。不過，常規的PCR技術由于產物檢測技術和聚合酶熱穩定性等因素的限制，對小于103拷貝數的HPV病原體難以發現。
實時熒光定量PCR(Real-time PCR)，原理是將特殊的熒光標記的探針加入PCR體系中，探針5‘端標記發光基團，3’端標記淬滅基團，長度約20～30核苷酸探針。PCR過程中，探針結合在目的基因片段上。Taq酶延伸到該處時切下5端熒光基團，釋放后基團一經激發，發出熒光，根據熒光強弱，測定實時DNA含量，進而計算原始DNA模板的含量。
DNA測序(DNA sequencing)，即是對特定DNA序列進行測定的技術和過程。現代DNA測序都是通過自動化的DNA測序儀進行的。
發明內容
本發明提供一種新的人乳頭瘤病毒的定型、定量基因檢測方法，主要解決現有檢測方法檢測靈敏度低，無法對感染的HPV病毒亞型進行鑒別的技術問題，實現病毒的定量檢測，并能對病毒的亞型進行定型為解決上述技術問題，本發明是這樣實現的一種人乳頭瘤病毒的定型、定量基因檢測方法，其特征是包括如下步驟①以簡并引物對HPV目的基因擴增；②產物DNA測序；③病毒的定量依靠實時熒光定量PCR(Real-time PCR)。
該HPV簡并引物包括①針對L1區的引物2對，HPV-L1-F15’-GNGGDCAGCCWTTAGGTGTD-3’HPV-L1-R15’-AARTCCATNGCMCCAWAGCCWGTN-3’HPV-L1-F25’-RNGCACAGGGHCAYAAYAATG-3’HPV-L1-R25’-NCGWCCCARNGGAAAYTGATCY-3’②針對E6E7區的引物(1對)，HPV-E6E7-F15’-TTAHBHRTDGTRTATAGAGA-3’HPV-E6E7-R15’-GGACACARHGGTBTTTGRCA-3’其中R＝A，G W＝A，T M＝A，C Y＝T，C K＝G，T S＝G，CD＝A，G，T H＝A，C，T V＝A，C，G B＝C，G，T N＝A，C，G，T。
在DNA測序結果的基礎上，選擇的熒光探針是
針對HPV-L1-F1、HPV-L1-R1的探針，HPV-L1-P15’-FAM-TAGGGGAACACTGGGGCAAAGGAT-TAMRA-3’針對HPV-L1-F2、HPV-L1-R2的探針，HPV-L1-P25’-FAM-TAGCCTCAGATTTAACAAAGCTA-TAMRA-3’熒光定量PCR的內參照基因選擇GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)GAPDH引物探針，Human GAPDH-F 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’human GAPDH-R 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’human GAPDH-P 5’-fam-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-tamra-3’。
使用本發明檢測HPV具有以下優點1.適用于各種亞型的HPV病毒檢測，對較常見的病毒亞型2、6、7、10、11、16、18、27、28、30、31、32、33、34、35、40、42、45、51、52、58、59、61、66、69、84、90等均可檢測，其檢測范圍超過目前的雜交捕獲方法(檢測范圍為16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和68型)。
2.檢測靈敏度高，對于50例隨機臨床樣品的檢測結果表明，使用本發明檢測靈敏度為95.2％，明顯高于傳統的巴氏涂片76％的水平3.可以檢測出整合型病毒，專有的E6E7引物可以檢測已有方法無法檢測的整合到人基因組上的病毒。
4.可以對感染的HPV病毒亞型進行鑒別，準確判定感染的病毒亞型。已有方法均不能對此進行準確判定。這對于了解病人的病狀及預后判斷均有重要意義。
具體實施例方式本發明綜合利用簡并引物PCR、實時熒光定量PCR和DNA測序技術，顯著提高HPV檢測的靈敏度和特異性，實現病毒的定量檢測，并能對病毒的亞型進行定型，這對于HPV感染狀態的臨床診斷和研究工作都有顯著意義。
1、以簡并引物對HPV目的基因擴增。
HPV是有中-高度進化速率的DNA病毒，目前已有近100多種亞型。在以往的PCR檢驗中，對于這種高變異病毒，特異性引物設計常常是難題。單一引物往往不能在所有亞型中保持一致的結合效率，因此使部分類型HPV無法檢出。
解決方法是針對HPV的保守區設計簡并引物。
病毒學研究現將HPV分為五個超級組，A超級組為生殖道HPV，包含10個組型，A1～A10。每組內有感染途徑和致病能力相似的若干種HPV，其中A7和A9中有致宮頸癌的高危險型HPV16、18、31、33、45、52，但其他組中也有致癌HPV種。區分HPV的標準對象通常是L1和E6、E7基因。前者是病毒的外殼蛋白，相對保守。后者E6、E7是原癌基因，保守性低，但對區分高危或低危病毒有意義。
分析HPV基因序列，得到理想引物3對(其中L1引物2對，E6E7引物1對)
樣品來源為陰道組織樣品，通過傳統的酚氯仿方法制備基因組DNA，作為PCR反應模板。
每次檢測用3對引物對待測樣品分別擴增。
PCR體系(50ul)10×Buffer 5u1MgCl2(25mM) 4u1dNTPs(10mM) 1ulTAQ polymerase(5u/ul)0.5ul引物1(20mM) 0.5ul引物2(20mM) 0.5ulH2O 34.5ulPCR循環條件95℃9min；
95℃1min，55℃1min，72℃1min，35cycles.
PCR產物通過瓊脂糖電泳分析檢測。
2、DNA測序從特異性PCR產物擴增條帶中選出較清晰的DNA條帶，通過DNA凝膠回收試劑盒純化后進行DNA測序。
測序采用ABI Bigdye Terminator試劑盒(ver3.1)及ABI 377型自動測序儀。
L1區的產物測序結果可用于病毒分型，并確定用于病毒定量的探針。E6E7擴增產物的測序結果則主要用于分析HPV類型，區分宮頸癌的高危或低危型HPV。使用DNA序列同源比較軟件，不僅能區分HPV所屬亞型，而且對于未知類型的HPV，尚能進行病毒分類和種系發生分析。
3、病毒的定量依靠實時熒光定量PCR(Real-time PCR)。
在測序結果的基礎上，選擇合適的引物和熒光探針，保證探針結合溫度的一致可比性。
測定的標準曲線通過對標準摸板系列稀釋品的Real-time PCR測定結果繪制。
Real-time PCR反應體系加樣體積模板 1ulBuffer10× 5ulMgcl2(25mM) 5ul
dNTP 10mM 1ulPrimer F(20pmol/ul) 0.8ulPrimer R(20pmol/ul) 0.8ulProbe(20pmol/ul) 0.4ulTaq酶(5U/ul) 0.5ulH2O to 50ul反應條件94℃2分鐘(94℃10秒 53℃30秒 72℃40秒)45個循環探針序列如下
熒光定量PCR的內參照基因選擇GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
權利要求
1.一種人乳頭瘤病毒的定型、定量基因檢測方法，其特征是包括如下步驟①以簡并引物對HPV目的基因擴增；②以DNA測序方法對HPV進行分型；③熒光定量PCR(Real-time PCR)對病毒進行定量。
2.根據權利要求1所述的人乳頭瘤病毒的定型、定量基因檢測方法，其特征是該HPV簡并引物包括①針對L1區的引物2對，HPV-L1-F15’-GNGGDCAGCCWTTAGGTGTD-3’HPV-L1-R15’-AARTCCATNGCMCCAWAGCCWGTN-3’HPV-L1-F25’-RNGCACAGGGHCAYAAYAATG-3’HPV-L1-R25’-NCGWCCCARNGGAAAYTGATCY-3’②針對E6E7區的引物(1對)，HPV-E6E7-F15’-TTAHBHRTDGTRTATAGAGA-3’HPV-E6E7-R15’-GGACACARHGGTBTTTGRCA-3’其中R＝A，G W＝A，T M＝A，C Y＝T，C K＝G，TS＝G，CD＝A，G，T H＝A，C，T V＝A，C，G B＝C，G，T N＝A，C，G，T。
3.根據權利要求2所述的人乳頭瘤病毒的定型、定量基因檢測方法，其特征是在DNA測序結果的基礎上，選擇的熒光探針是針對HPV-L1-F1、HPV-L1-R1的探針，HPV-L1-P15’-FAM-TAGGGGAACACTGGGGCAAAGGAT-TAMRA-3’針對HPV-L1-F2、HPV-L1-R2的探針，HPV-L1-P25’-FAM-TAGCCTCAGATTTAACAAAGCTA-TAMRA-3’熒光定量PCR的內參照基因選擇GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)GAPDH引物探針，Human GAPDH-F 5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’human GAPDH-R 5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’human GAPDH-P 5’-fam-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-tamra-3’。
全文摘要
本發明屬于臨床病原體DNA檢測方法，檢測對象為乳頭瘤病毒(Papillomavirus)，尤其是可以致癌的高危險型人乳頭瘤病毒(HPV)。它包括如下步驟①以簡并引物對HPV目的基因擴增；②擴增產物DNA測序；③實時熒光定量PCR(Real－time PCR)病毒定量。本發明主要解決現有檢測方法檢測靈敏度低，無法對感染的HPV病毒亞型進行鑒別的技術問題，實現病毒的定量檢測，并能對病毒的亞型進行定型。
文檔編號C12Q1/68GK1706966SQ20041002493
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月4日 優先權日2004年6月4日
發明者朱江, 何以豐, 劉佩 申請人:何以豐