專利名稱：豬甘丙肽樣肽基因galp作為豬產仔數性狀的遺傳標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及豬遺傳標記制備技術領域，具體涉及一種豬甘丙肽樣肽基因GALP作為豬產仔數性狀的遺標記及應用，它包括甘丙肽樣肽基因(galanin-like peptide, GALP)基因突變位點的檢測方法與應用。
背景技術：
繁殖是養豬生產過程中的關鍵一環，該環節成功與否直接影響整個養豬業的經濟效益。傳統的數量遺傳學在指導家畜育種中起到了重要的作用，但是繁殖性狀遺傳力低、性狀表現晚、而且是限性遺傳，通過常規選擇難以有所進展。因此，繁殖性狀改良一般僅依賴于雜交，然而其遺傳改良不能固定，還會引入其它品種的劣勢。隨著現代分子生物學理論和實驗技術的發展，大量與繁殖性狀有關的分子標記的發現、鑒別和應用，為繁殖性狀的遺傳改良提供了新的機遇。在明確了太湖豬高產仔數的生理機制后，將與下丘腦-垂體-性腺軸有關的激素及其受體基因、激活素和抑制素等基因作為產仔數性狀的候選基因。最初一個候選基因是雌激素受體(ESR)基因(Rothschild et al.A major gene for litter size in pigs.Proc 5th World Congr Genet Appl Livest Prod, Guelph, Canada,1994,21:225-228),后又將目光集中到視黃酸受體Y基因、視黃酸結合蛋白4基因、褪黑激素受體IAOnelatoninreceptor IA,MTNRIA)基因及促乳素受:體(prolactin receptor,PRLR)基因上來。我國李寧等通過候選基因法，在促卵泡素β亞基(FSH-β)基因上發現有益等位基因可控制2.0頭/窩的總產仔數和1.5頭/窩的產活仔數(Li et al.Candidate gene analysis foridentification of genetic loci controlling litter size in swine.Proc 6th WorldCongr Genet Appl Livest Prod, Armidale, Australia, 1998, 26:183-186) 這表明控制豬產仔數性狀的主效 基因或許不止一個。豬甘丙素樣肽(galanin-like peptide,簡稱GALP)是一種從豬下丘腦分離得到的由60個氨基酸組成的新型神經多肽，其第9-21個氨基酸順序與甘丙素前13個氨基酸序列完全一致(Ohtaki T et al.1solation and cDNA cloning of a novel galanin-likepeptide (GALP)from porcine hypothalamus.J Biol Chem，1999，274:37041-37045)。Cunningham 等(2002.Galanin-like peptide (GALP)as a potential regulator ofpituitary hormone secretion.Soc Neurosci, 27:1370)研究指出，GALP 能直接作用于GnRH的分泌從而實現對LH(促黃體素)的調節。Fraley等(2004.Stimulation of sexualbehavior in the male rat by galanilike peptide(GALP).Hormones and Behavior,2004,46:551-557)報道稱，注射GALP能增加無論是性腺完整還是去勢的雄大鼠的性行為，表明GALP對繁殖的調節也包括對性行為的調節。Kauffman等(2005.Effects ofgalanin-like peptide(GALP)on locomotion,reproduction,and body weight in femaleand male mice.Horm Behav, 48:141-151)也指出 GALP 能激活 GnRH-1 能神經兀而增加小鼠脊椎前凸行為(一種表現接受交配的性行為表現)。此外，在我們前期研究中GALP基因在大白豬和中國二花臉豬排卵前卵泡中差異表達(Sun et al.Microarray profilingfor differential gene expression in PMSG—hCG stimulated preovulatory ovarianfollicles of Chinese Taihu and Large White sows.BMC Genomics,2011,12(I):111)。因此我們將GALP基因作為豬產仔數性狀候選基因，研究該基因多態性，并與產仔數性狀進行關聯分析，為產仔數性狀改良提供新的標記。
發明內容
本發明的目的在于獲得一種豬產仔數性狀的遺傳標記，克隆豬GALP基因序列，尋找突變位點以及基因多態性的檢測方法，為豬產仔數性狀的標記輔助提供一種選擇方法。本發明的技術方案如下:本發明獲得了一種豬產仔數性狀的遺傳標記，它是大白豬、太湖豬GALP基因序列，其核苷酸序列如序列表 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ IDN0.5和SEQ ID N0.6 ;通過上述序列進行ClustalW比對提供了位于該擴增片段1157堿基處存在I個C/G突變(如圖1所示)，導致PCR-Hha1-RFLP多態性。申請人:設計了一種擴增豬GALP基因序列的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID N0.7和 SEQ ID N0.8 所示。申請人:提供了一種篩選豬產仔數性狀的遺傳標記的方法，按照以下步驟:從豬血液中提取基因組DNA。登錄Ensembl上豬GALP基因序列，并以此作為靶序列，設計特異引物(該引物的序列如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示)。以大白豬和太湖豬的基因組DNA為模板進行擴增，對PCR產物回收和克隆測序，得到如序列表SEQID N0.1-6所示的基因片段(即圖4所示的6個基因片段，但圖4顯示在1157位突變后的等位基因有差異:在有些品種個體上該突變是“C”，在有些品種個體上該突變是“G”)；進而進行序列Clustalw比對，篩查S NP(如圖1所示)，在該序列的1157堿基處(即該基因第3外顯子116bp處)發現C/G等位基因突變，引起了 HhaI酶切位點(GCG丨C)多態性。該突變位于3’非翻譯區，因此不會導致氨基酸改變。以豬GALP基因1368bp的DNA片段SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.6序列為靶序列，設計引物，該引物的序列如序列表SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示。擴增區域包括豬GALP基因第2外顯子的396bp的基因組核苷酸序列(如圖2所示)，然后進行HhaI酶切，SNP位點檢測如圖3所示。本發明提供了鑒定上述序列C/G變異的HhaI_RFLP(限制性內切酶酶切片段長度多態性)基因型分型方法。其引物序列分別如序列表SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示，在豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR擴增片段HhaI酶切分型及檢測。進一步，本發明提供了利用Hha1-RFLP方法確定豬不同基因型個體與產仔數性狀間的關聯分析的應用。更詳細的發明方案見《具體實施方式
》所述。
序列表SEQ ID N0.1:是擴增的中國血緣豬種“梅山豬個體I”的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0.2:是擴增的中國血緣豬種“梅山豬個體2”的核苷酸序列。
序列表SEQ ID N0.3:是擴增的中國血緣豬種“梅山豬個體3”的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0.4:是擴增的國外血緣豬種“大白豬個體I”的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0.5:是擴增的國外血緣豬種“大白豬個體2”的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0.6:是擴增的國外血緣豬種“大白豬個體3”的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0.7:是制備SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.6特異基因片段所用的正向引物。序列表SEQ ID N0.8:是制備SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.6特異基因片段所用的反向引物。 序列表SEQ ID N0.9:是實施豬GALP基因第3外顯子C/G變異Hha1-RFLP (限制性內切酶酶切片段長度多態性)基因型分型方法的正向引物。序列表SEQ ID N0.10:是實施豬GALP基因第3外顯子C/G變異Hha1-RFLP (限制性內切酶酶切片段長度多態性)基因型分型方法的反向引物。圖1:是大白豬和太湖豬GALP基因序列片段比對結果和SNP位點。圖中:*代表該列的堿基是相同的。圖2:是包括豬GALP基因序列片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜。瓊脂糖凝膠濃度為1.0%;圖中:M泳道為DNA Marker DL2, 000 ;泳道 為序列表SEQ ID N0.9和 SEQ ID N0.10所示引物在不同豬種中的擴增片段，片段大小為402bp。圖3:是豬GALP基因片段Hha1-RFLP檢測結果。瓊脂糖膠濃度為1.5%;圖中:泳道M為DL 2000Markers ;CC基因型:片段大小為402bp ;CG基因型:片段大小為402bp，204bp，198bp ;基因型:GG片段大小為204bp，198bp。圖4:是本發明提供的6個原始序列片段(顯示了在1157位出現的等位突變的堿基，以英文字母R表不，括弧內的喊基為突變后的喊基)。
具體實施例方式實施例1:豬GALP基因片段的獲得及多態性檢測方法的建立下載Ensembl上豬GALP基因序列，并以此作為靶序列，利用Primer2軟件在線設計引物。引物序列如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示，如下:正向引物GALP-F:GTATTGAACCTGCGTCCTC ；GALP-R:ACCAGATGCCAGCCTCCCT PCR 擴增包含 GALP 基因第 2 外顯子片段。PCR反應體系為25 μ 1，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200 μ mol/L,每條引物濃度為 0.4 μ mol/L, 3U 的 Taq DNA 聚合酶(Biostar International, Canada),加去離子水至總體積25 μ I ;PCR反應程序:94°C預變性4min ;然后94°C變性50s、60°C退火50s、72°C延伸lmin，共35個循環；最后72°C延伸lOmin。PCR產物經純化(UNI Q-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術有限公司)，克隆后，進行序列測定，序列測定由上海生工生物工程技術有限公司完成。不同豬種的PCR產物序列經ClustalW軟件進行序列比對，序列間比對結果見圖1。上述擴增片段大小為1368bp，位于該片段1157堿基處(即位于該基因第3外顯子的第116個堿基)C/G突變(見圖1)，引起了 HhaI酶切位點(G CG丨C)多態性。由于該位點位于3’非翻譯區，不會造成氨基酸改變。以獲得豬GALP基因1368bp的DNA片段SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.6序列為靶序列，設計引物，該引物的序列如序列表SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示，序列如下:正向引物GALP-SNP-F:ATGCCAGCCTCCCTTCTAG，GALP-SNP-R:CTGGGCTGCTGGTTCTGTG 擴增區域包括豬GALP基因第3外顯子的402bp的基因組核苷酸序列，如圖2所示。PCR擴增，取8.5μ I PCR產物加入 0.5μ 1(10υ/μ I)限制性內切酶和 1μ I 10 X buffer (含 10 X BSA)，37 °C HhaI 酶切4h，取5 μ I酶切產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察并記錄酶切結果，如圖3所示:此擴增片段大小為402bp，在198bp處有HhaI酶切位點，若該處堿基為C，則不存在HhaI酶切位點，用HhaI酶切檢測結果有402bp —條片段(C等位基因)，當該位點為G時，結果導致一個HhaI酶切位點的產生，酶切得到兩個片段，長度均為204bp，198bp (G等位基因)。實施例2:本發明制備的遺傳標記在不同豬群中的多態性分布豬基因組DNA的提取(樣本見表I所示)方法參照熊遠著《豬生化及分子遺傳實驗導論》中國農業出版社，1999介紹的方法進行。在11個群體豬，其中6個國外血緣豬群和4個中國地方血緣豬群、I個合成系(中國瘦肉豬新品系DIV系(華中農業大學和湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所共同培育，在中國大規模推廣應用的瘦肉型新品種豬)中檢測豬GALP基因PCR-Hha1-RFLP多態性，檢測結果如表I所示。結果表明:只有在中國瘦肉豬新品系DIV(合成系)、杜洛克、皮特蘭和長白豬(國外血緣豬群)中存在少量的GG基因型，而在通城豬(中國地方血緣豬)等7個群體中沒有檢測GG型，可能G等位基因純合個體會在胚胎發育早期死亡。在所有檢測的11群體中，C等位基因頻率為0.55-1.00，為優勢等位基因(見表I)。表I豬GALP基因PCR-Hha1-RFLP在不同豬種中的分布結果
權利要求
1. 一種豬產仔數性狀的遺傳標記，它是豬甘丙肽樣肽基因GALP第3外顯子的特異基因片段，它們的核苷酸序列如下所述SEQ ID NO. I梅山豬個體IGTATTGAACCTGCGTCCTCATGGATGCTAGGCATGTTCTTTTCCACTGAGCCACAGTGGGAACTCCAAAGCAGTGGGGCTTTTTAAAAAAGCTTTCTGCCTTTAGAGGTCTTCAGTTTCCTCACTGGTGACGTTCAGATTAAGCAAAGCTGCTTCACAGACCAGCAGTTAAGTGGCATGCGGACCACGTCATCTCAGACCTGGGGGATGACCGCTAGCCTTTCTGTCTCTCTGAGCCTTGGTCTTTCCTTCTCTGTCCAGGGGCGAGGAGGCTGGACCCTCAACAGTGCTGGTTACCTCCTGGGTCCCGGTAAGTGAGCCTGTTCCGAGCACTTCCACCCTGGCTCCTACCTGCTTGGAGCCTGTGGGCAGTGAGTTTGCGACCCTGCAAAGACCCTCGAGCACATTCGCTGACGTCCACAGGTTTCACCAGGGTTAGGCTGGTGGAGTGACTGGCGCATGGATCCAGCAGCCAGAGCGTTGGGTTGAAGTCCCACTCTGACCCCCCGCTGGATATTCAACCTTTACGTCTCCACGCCTCCATTGCCTCGTCTGTGGCAATGGGTGTAGCGATGTCCACCCCCACCCCCACCCCGCCCCGCACAAGGTTGTTATGAGGATTAGATGACTTAGAGCAATTCTGGCATGTTCCTCCATCCATCTCTCTCCGTTCACTGCGTACTTGTGTCCGTAGTAGGGCGCTCTTTCCCTGCAGTTAAGGTTACGTGCCAGGACCCCTGCAATGCTACGGTTCGGAAGAGCTGGAGGGACGTGGGAATTGGATCTAGACAGTGGTGGCCTCGAACCCCAGTTCTGCTACTTAGCAGTGGGGTAACCTTGAGCCAAGGGCTCTACTTCTCGGAGCCTTGGGGTCCTCTCTGGGACATCAGGATGGTCGGTGTGCACCCCGCCCCTCCGCATTTGTTGGAGGTGCGCCACCAGGCGGATAGCGCCCTGGGGCTCTGGGCTGCTGGTTCTGTGTGTTCTCACTGCCTTTAATGACCAACTGGTCTTGCTCCCTCTCCTCACCCCTGCCCCCCAGTACTCCATCCGCCCTCCAGGGCTGAAGGAGGCGGGAAGGGGAAGACAGCCCTCGGGATCCTGGACCTGTGGAAGGCCATTGGTGAGTGAATCAGGAGTCTGACGGCCCTGTCCCTRCGCCGCAACGCTCCCCTCCACCTGCCCCTCGCTGGTGTTGGAAACTGGTGGGTGTGGGTTCCCACCCTTGTTCTGCACGTCCCAGATGGCGGAGCTTGAGCAACTTACTTCACATGCCTCCATGGGTAACACAGTCTCCTGAAAACCACCGCACAACGCGTGCAGTGAAAGCAGGTATGTACAATTCCTAGAAGGGAGGCTGGCATCTGGT上述序列中的R是C或G，導致HhaI-RFLP多態性；SEQ ID NO. 2梅山豬個體2GTATTGAACCTGCGTCCTCATGGATGCTAGGCATGTTCTTTTCCACTGAGCCACAGTGGGAACTCCAAAGCAGTGGGGCTTTTTAAAAAAGCTTTCTGCCTTTAGAGGTCTTCAGTTTCCTCACTGGTGACGTTCAGATTAAGCAAAGCTGCTTCACAGACCAGCAGTTAAGTGGCATGCGGACCACGTCATCTCAGACCTGGGGGATGACCGCTAGCCTTTCTGTCTCTCTGAGCCTTGGTCTTTCCTTCTCTGTCCAGGGGCGAGGAGGCTGGACCCTCAACAGTGCTGGTTACCTCCTGGGTCCCGGTAAGTGAGCCTGTTCCGAGCACTTCCACCCTGGCTCCTACCTGCTTGGAGCCTGTGGGCAGTGAGTTTGCGACCCTGCAAAGACCCTCGAGCACATTCGCTGACGTCCACAGGTTTCACCAGGGTTAGGCTGGTGGAGTGACTGGCGCATGGATCCAGCAGCCAGAGCGTTGGGTTGAAGTCCCACTCTGACCCCCCGCTGGATATTCAACCTTTACGTCTCCACGCCTCCATTGCCTCGTCTGTGGCAATGGGTGTAGCGATGTCCACCCCCACCCCCACCCCGCCCCGCACAAGGTTGTTATGAGGATTAGATGACTTAGAGCAATTCTGGCATGTTCCTCCATCCATCTCTCTCCGTTCACTGCGTACTTGTGTCCGTAGTAGGGCGCTCTTTCCCTGCAGTTAAGGTTACGTGCCAGGACCCCTGCAATGCTACGGTTCGGAAGAGCTGGAGGGACGTGGGAATTGGATCTAGACAGTGGTGGCCTCGAACCCCAGTTCTGCTACTTAGCAGTGGGGTAACCTTGAGCCAAGGGCTCTACTTCTCGGAGCCTTGGGGTCCTCTCTGGGACATCAGGATGGTCGGTGTGCACCCCGCCCCTCCGCATTTGTTGGAGGTGCGCCACCAGGCGGATAGCGCCCTGGGGCTCTGGGCTGCTGGTTCTGTGTGTTCTCACTGCCTTTAATGACCAACTGGTCTTGCTCCCTCTCCTCACCCCTGCCCCCCAGTACTCCATCCGCCCTCCAGGGCTGAAGGAGGCGGGAAGGGGAAGACAGCCCTCGGGATCCTGGACCTGTGGAAGGCCATTGGTGAGTGAATCAGGAGTCTGACGGCCCTGTCCCTRCGCCGCAACGCTCCCCTCCACCTGCCCCTCGCTGGTGTTGGAAACTGGTGGGTGTGGGTTCCCACCCTTGTTCTGCACGTCCCAGATGGCGGAGCTTGAGCAACTTACTTCACATGCCTCCATGGGTAACACAGTCTCCTGAAAACCACCGCACAACGCGTGCAGTGAAAGCAGGTATGTACAATTCCTAGAAGGGAGGCTGGCATCTGGT上述序列中的R是C或G，導致HhaI-RFLP多態性；SEQ ID NO. 3梅山豬個體3GTATTGAACCTGCGTCCTCATGGATGCTAGGCATGTTCTTTTCCACTGAGCCACAGTGGGAACTCCAAAGCAGTGGGGCTTTTTAAAAAAGCTTTCTGCCTTTAGAGGTCTTCAGTTTCCTCACTGGTGACGTTCAGATTAAGCAAAGCTGCTTCACAGACCAGCAGTTAAGTGGCATGCGGACCACGTCATCTCAGACCTGGGGGATGACCGCTAGCCTTTCTGTCTCTCTGAGCCTTGGTCTTTCCTTCTCTGTCCAGGGGCGAGGAGGCTGGACCCTCAACAGTGCTGGTTACCTCCTGGGTCCCGGTAAGTGAGCCTGTTCCGAGCACTTCCACCCTGGCTCCTACCTGCTTGGAGCCTGTGGGCAGTGAGTTTGCGACCCTGCAAAGACCCTCGAGCACATTCGCTGACGTCCACAGGTTTCACCAGGGTTAGGCTGGTGGAGTGACTGGCGCATGAATCCAGCAGCCAGAGCGTTGGGTTGAAGTCCCACTCTGACCCCCCGCTGGATATTCAACCTTTACGTCTCCACGCCTCCATTGCCTCGTCTGTGGCAATGGGTGTAGCGATGTCCACCCCCACCCCCACCCCGCCCCGCACAAGGTTGTTATGAGGATTAGATGACTTAGAGC AATTCTGGCATGTTCCTCCATCCATCCCTCTCCGTTCACTGCGTACTTGTGTCCGTAGTAGGGCGCTCTTTCCCTGCAGTTAAGGTTACGTGCCAGGACCCCTGCAATGCTACCGTTCGGAAGAGCTGGAGGGACGTGGGAATTGGATCTAGACAGTGGTGGCCTCGAACCCCAGTTCTGCTACTTAGCAGTGGGGTAACCTTGAGCCAAGGGCTCTACTTCTCGGAGCCTTGGGGTCCTCTCTGGGACATCAGGATGGTCGGTGTGCACCCCGCCCCTCCGCATTTGTTGGAGGTGCGCCACCAGGCGGATAGCGCCCTGGGGCTCTGGGCTGCTGGTTCTGTGTGTTCTCACTGCCTTTAATGACCAACTGGTCTTGCTCCCTCTCCTCACCCCTGCCCCCCAGTACTCCATCCGCCCTCCAGGGCTGAAGGAGGCGGGAAGGGGAAGACAGCCCTCGGGATCCTGGACCTGTGGAAGGCCATTGGTGAGTGAATCAGGAGTCTGACGGCCCTGTCCCTRCGCCGCAACGCTCCCCTCCACCTGCCCCTCGCTGGTGTTGGAAACTGGTGGGTGTGGGTTCCCACCCTTGTTCTGCACGTCCCAGATGGCGGAGCTTGAGCAACTTACTTCACATGCCTCCATGGCTAACACAGTCTCCTGAAAACCACCGCACAACGCGTGCAGTGAAAGCAGGTATGTACAATTCCTAGAAGGGAGGCTGGCATCTGGT上述序列中的R是C或G，導致HhaI-RFLP多態性；SEQ ID NO. 4大白豬個體IGTATTGAACCTGCGTCCTCATGGATGCTAGGCATGTTCTTTTCCACTGAGCCACAGTGGGAACTCCAAAGCAGTGGGGCTTTTTAAAAAAGCTTTCTGCCTTTAGAGGTCTTCAGTTTCCTCACTGGTGACGTTCAGATTAAGCAAAGCTGCTTCACAGACCAGCAGTTAAGTGGCATGCGGACCACGTCATCTCAGACCTGGGGGATGACCGCTAGCCTTTCTGTCTCTCTGAGCCTTGGTCTTTCCTTCTCTGTCCAGGGGCGAGGAGGCTGGACCCTCAACAGTGCTGGTTACCTCCTGGGTCCCGGTAAGTGAGCCTGTTCCGAGCACTTCCACCCTGGCTCCTACCTGCTTGGAGCCTGTGGGCAGTGAGTTTGCGACCCTGCAAAGACCCTCGAGCACATTCGCTGACGTCCACAGGTTTCACCAGGGTTAGGCTGGTGGAGTGACTGGCGCATGGATCCAGCAGCCAGAGCGTTGGGTTGAAGTCCCACTCTGACCCCCCGCTGGATATTCAACCTTTACGTCTCCACGCCTCCATTGCCTCGTCTGTGGCAATGGGTGTAGCGATGTCCACCCCCACCCCCACCCCGCCCCGCACAAGGTTGTTATGAGGATTAGATGACTTAGAGCAATTCTGGCATGTTCCTCCATCCATCTCTCTCCGTTCACTGCGTACTTGTGTCCGTAGTAGGGCGCTCTTTCCCTGCAGTTAAGGTTACGTGCCAGGACCCCTGCAATGCTACGGTTCGGAAGAGCTGGAGGGACGTGGGAATTGGATCTAGACAGTGGTGGCCTCGAACCCCAGTTCTGCTACTTAGCAGTGGGGTAACCTTGAGCCAAGGGCTCTACTTCTCGGAGCCTTGGGGTCCTCTCTGGGACATCAGGATGGTCGGTGTGCACCCCGCCCCTCCGCATTTGTTGGAGGTGCGCCACCAGGCGGATAGCGCCCTGGGGCTCTGGGCTGCTGGTTCTGTGTGTTCTCACTGCCTTTAATGACCAACTGGTCTTGCTCCCTCTCCTCACCCCTGCCCCCCAGTACTCCATCCGCCCTCCAGGGCTGAAGGAGGCGGGAAGGGGAAGACAGCCCTCGGGATCCTGGACCTGTGGAAGGCCATTGGTGAGTGAATCAGGAGTCTGACGGCCCTGTCCCTRCGCCGCAACGCTCCCCTCCACCTGCCCCTCGCTGGTGTTGGAAACTGGTGGGTGTGGGTTCCCACCCTTGTTCTGCACGTCCCAGATGGCGGAGCTTGAGCAACTTACTTCACATGCCTCCATGGGTAACACAGTCTCCTGAAAACCACCGCACAACGCGTGCAGTGAAAGCAGGTATGTACAATTCCTAGAAGGGAGGCTGGCATCTGGT上述序列中的R是C或G，導致HhaI-RFLP多態性；SEQ ID NO. 5大白豬個體2GTATTGAACCTGCGTCCTCATGGATGCTAGGCATGTTCTTTTCCACTGAGCCACAGTGGGAACTCCAAAGCAGTGGGGCTTTTTAAAAAAGCTTTCTGCCTTTAGAGGTCTTCAGTTTCCTCACTGGTGACGTTCAGATTAAGCAAAGCTGCTTCACAGACCAGCAGTTAAGTGGCATGCGGACCACGTCATCTCAGACCTGGGGGATGACCGCTAGCCTTTCTGTCTCTCTGAGCCTTGGTCTTTCCTTCTCTGTCCAGGGGCGAGGAGGCTGGACCCTCAACAGTGCTGGTTACCTCCTGGGTCCCGGTAAGTGAGCCTGTTCCGAGCACTTCCACCCTGGCTCCTACCTGCTTGGAGCCTGTGGGCAGTGAGTTTGCGACCCTGCAAAGACCCTCGAGCACATTCGCTGACGTCCACAGGTTTCACCAGGGTTAGGCTGGTGGAGTGACTGGCGCATGGATCCAGCAGCCAGAGCGTTGGGTTGAAGTCCCACTCTGACCCCCCGCTGGATATTCAACCTTTACGTCTCCACGCCTCCATTGCCTCGTCTGTGGCAACGGGTGTAGCGATGTCCACCCCCACCCCCACCCCGCCCCGCACAAGGTTGTTATGAGGATTAGATGACTTAGAGCAATTCTGGCATGTTCCTCCATCCATCTCTCTCCGTTCACTGCGTACTTGTGTCCGTAGTAGGGCGCTCTTTCCCTGCAGTTAAGGTTACGTGCCAGGACCCCTGCAATGCTACGGTTCGGAAGAGCTGGAGGGACGTGGGAATTGGATCTAGACAGTGGTGGCCTCGAACCCCAGTTCTGCTACTTAGCAGTGGGGTAACCTTGAGCCAAGGGCTCTACTTCTCGGAGCCTTGGGGTCCTCTCTGGGACATCAGGATGGTCGGTGTGCACCCCGCCCCTCCGCATTTGTTGGAGGTGCGCCACCAGGCGGATAGCGCCCTGGGGCTCTGGGCTGCTGGTTCTGTGTGTTCTCACTGCCTTTAATGACCAACTGGTCTTGCTCCCTCTCCTCACCCCTGCCCCCCAGTACTCCATCCGCCCTCCAGGGCTGAAGGAGGCGGGAAGGGGAAGACAGCCCTCGGGATCCTGGACCTGTGGAAGGCCATTGGTGAGTGAATCAGGAGTCTGACGGCCCTGTCCCTRCGCCGCAACGCTCCCCTCCACCTGCCCCTCGCTGGTGTTGGAAACTGGTGGGTGTGGGTTCCCACCCTTGTTCTGCACGTCCCAGATGGCGGAGCTTGAGCAACTTACTTCACATGCCTCCATGGGTAACACAGTCTCCTGAAAACCACCGCACAACGCGTGCAGTGAAAGCAGGTATGTACAATTCCTAGAAGGGAGGCTGGCATCTGGT上述序列中的R是C或G，導致HhaI-RFLP多態性；SEQ ID NO. 6大白豬 個體3GTATTGAACCTGCGTCCTCATGGATGCTAGGCATGTTCTTTTCCACTGAGCCACAGTGGGAACTCCAAAGCAGTGGGGCTTTTTAAAAAAGCTTTCTGCCTTTAGAGGTCTTCAGTTTCCTCACTGGTGACGTTCAGATTAAGCAAAGCTGCTTCACAGACCAGCAGTTAAGTGGCATGCGGACCACGTCATCTCAGACCTGGGGGATGACCGCTAGCCTTTCTGTCTCTCTGAGCCTTGGTCTTTCCTTCTCTGTCCAGGGGCGAGGAGGCTGGACCCTCAACAGTGCTGGTTACCTCCTGGGTCCCGGTAAGTGAGCCTGTTCCGAGCACTTCCACCCTGGCTCCTACCTGCTTGGAGCCTGTGGGCAGTGAGTTTGCGACCCTGCAAAGACCCTCGAGCACATTCGCTGACGTCCACAGGTTTCACCAGGGTTAGGCTGGTGGAGTGACTGGCGCATGGATCCAGCAGCCAGAGCGTTGGGTTGAAGTCCCACTCTGACCCCCCGCTGGATATTCAACCTTTACGTCTCCACGCCTCCATTGCCTCGTCTGTGGCAATGGGTGTAGCGATGTCCACCCCCACCCCCACCCCGCCCCGCACAAGGTTGT
2.擴增如權利要求I所述的遺傳標記的特異引物，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
3.一種篩選豬產仔數性狀的遺傳標記的方法，其特征在于按照以下步驟 從豬血液中提取基因組DNA，根據豬GALP基因序列和權利要求I中所述序列表SEQ IDNO. I至SEQ ID NO. 6所示的序列設計引物，該引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示，用該引物在豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR擴增片段HhaI酶切分型及檢測。
4.權利要求I所述遺傳標記在豬產仔數性狀標記輔助選擇中的應用。
5.權利要求2所述的引物在豬產仔數性狀標記輔助選擇中的應用。
全文摘要
本發明屬于豬遺傳標記制備與應用技術領域。具體涉及豬甘丙肽樣肽GALP編碼基因第2外顯子的單核苷酸多態性(SNP)檢測領域。其步驟包括從豬血液中提取基因組DNA，設計引物，PCR擴增，PCR產物克隆、測序，序列比較分析，單核苷酸多態性檢測，標記與產仔數性狀間相關性分析。公開了豬GALP基因第3外顯子的DNA序列和SNP分型的檢測技術。本發明的遺傳標記的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，在上述序列的1157位bp處有一個堿基突變(C/G)，并導致HhaI-RFLP多態性。本發明還公開了該遺傳標記的制備方法及在豬產仔數標記輔助選擇中的應用。
文檔編號C12Q1/68GK103255144SQ20121003932
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者李鳳娥, 蘇麗娜, 梅書棋, 陶虎, 李嚴, 彭先文, 蔣思文, 鄧昌彥, 熊遠著 申請人:華中農業大學