專利名稱：肺腺癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種肺腺癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估肺腺癌發病的風險級別，并作為預防和治療肺腺癌的方向指導。
背景技術：
肺腺癌在各類肺癌中約占20% -30%。肺腺癌大多數起源于較小的支氣管黏膜分泌粘液的上皮細胞，因此大多數腺癌位于肺的周圍部分，呈球形腫塊，靠近胸膜。女性病人較為多見，發病年齡亦較小。肺腺癌與吸煙無密切關系，一部分病例癌腫發生在肺纖維疤痕病變的基礎上。腺癌在早期一般沒有明顯的臨床癥狀，往往在胸部X線檢查時才發現，因此通過一定檢測手段篩查出易患肺腺癌的高危人群，指導這類人群提早預防肺腺癌的發生至關重要。研究表明，CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點多態性，XRCCl基因上Arg399Gln 位點多態性，MTHFR基因上C677T位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的6個單核苷酸位點多態性與肺腺癌的發生密切相關，可以作為預測受檢者是否屬于易患肺腺癌高危人群的科學依據。CYPlAl基因編碼細胞色素P4501A1。該蛋白是重要的活化多環芳烴類致癌物的主要酶類。被激活的CYPlAl能夠將多種環境中的有機物質如多環芳烴轉化為細胞毒素或其他致癌物質，從而早呢更加癌癥發生的危險。分子生物學研究表明，CYPlAl第462號氨基酸由Ile變為Val，以及CYP1A1MSPI位點T — C，會增加CYPlAl酶活性，可產生高誘導活性的CYPlAl酶，使多環芳烴類化合物活化速率加快，導致多種癌癥的發生風險增高。國內外研究表明CYPlAl基因多態性與肺癌相關，大樣本的中國人群的關聯分析顯示，該位點的多態現象是中國人群中重要的肺癌遺傳易感因素之一。因此該位點可以作為肺癌易感性的遺傳檢測因子。XRCCl是人類X射線交錯互補修復基因I。XRCCl基因編碼的蛋白對因電離輻射和烷基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到有效的修復作用。XRCCl編碼的蛋白與DNA連接酶 III、聚合酶β、多聚ADP核糖轉移酶交互作用，參與DNA的堿基切除通路。分子生物學研究表明，XRCCl基因上第399號氨基酸Arg-Gln的替代，可引起XRCCl活性降低，導致個體的 DNA修復能力下降。MTHFR基因編碼5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶。在葉酸代謝過程中是葉酸活化的核心酶，研究發現MTHFR基因上C677T多態性位點突變可以導致酶的熱穩定性和酶活性的下降，從而引起DNA甲基化出現異常，這種甲基化異常可能導致癌基因和抑癌基因表達異常，影響對細胞生長和功能的調控，促進癌癥的發生。GSTMl全稱Glutathione S-transferase Ml,中文名為谷胱;甘妝硫轉移酶Ml。該基因最為常見的變異為整個基因的缺失，該缺失型導致整個基因的功能喪失，與多種癌癥的發病相關，會大大提高癌癥的發病率。原因可能就是對環境毒物和致癌物質的易感性提高導致的。分子生物學研究也表明，GSTTl缺失型的個體整個基因缺失并喪失功能，從而也相當于增加了環境毒素和致癌物質的濃度，提高了個體易患一系列類型癌癥的風險。綜上所述，鑒于CYPlAl基因，XRCCl基因，MTHFR基因，GSTMl基因，GSTTl基因在肺腺癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在肺腺癌發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患肺腺癌的高危人群，從而有針對性的預防和治療肺腺癌，這對于降低肺腺癌的發病率有非常重要的意義。
發明內容
基于CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點多態性，XRCCl基因上Arg399Gln位點多態性，MTHFR基因上C677T位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的6個單核苷酸多態性位點基因型可作為評估肺腺癌發病的危險因子的基礎上，本發明提供一種肺腺癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點多態性，XRCCl基因上Arg399Gln位點多態性，MTHFR基因上C677T位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的6個單核苷酸多態性位點基因型的特異性弓I物對及DNA測序引物； PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(I)CYPlAl (Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'(2)CYP1A1 (MspI)正向引物5' GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3'CYPlAl (MspI)反向引物5' AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3'(3)XRCCl(Arg399Gln)正向引物5' TGACCTTGCGGGACCTTAG3'XRCCl(Arg399Gln)反向引物5' CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3'(4)MTHFR(C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(5)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;(6)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(I)CYPlAl (Ile462Val)測序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'(2) CYPlAl (MspI)測序引物5' GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3'(3)XRCCl(Arg399Gln)測序引物5' TGACCTTGCGGGACCTTAG3'(4)MTHFR(C677T)測序引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(5)GSTMl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(6)GSTTl (Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA 測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行預防肺腺癌發病的基因無創檢測的服務I.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的CYPlAl基因上Ile462Val及 MSPI位點多態性，XRCCl基因上Arg399Gln位點多態性，MTHFR基因上C677T位點多態性， GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的6個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這6個SNPs位點的基因型。3.肺腺癌發病高危人群風險評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具肺腺癌易感基因風險評估分析報告單。 報告中詳細說明了受檢者CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點多態性，XRCCl基因上 Arg399Gln位點多態性，MTHFR基因上C677T位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/ Null)位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的6個基因上SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀肺腺癌易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種檢測肺腺癌易感基因無創檢測試劑盒，其特征在于檢測CYPlAl基因上 Ile462Val及MSPI位點多態性，XRCCl基因上Arg399Gln位點多態性，MTHFR基因上C67H 位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性，GSTTl基因缺失與否 (Present/Null)位點多態性的6個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對CYPlAl 基因上Ile462Val及MSPI位點多態性，XRCCl基因上Arg399Gln位點多態性，MTHFR基因上 C677T位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性，GSTTl基因缺失與否 (Present/Null)位點多態性的6個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這6個SNPs 位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對CYPlAl基因上Ile462Val及MSPI位點多態性，XRCCl基因上Arg399Gln位點多態性，MTHFR基因上 C677T位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性，GSTTl基因缺失與否 (Present/Null)位點多態性的6個單核苷酸多態性位點而設計,能通過DNA測序技術特異性檢測出上述6個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的6對特異性引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'(2)CYPlAl (MspI)正向引物5, GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3'CYPlAl (MspI)反向引物5' AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3'(3)XRCCl(Arg399Gln)正向引物5'TGACCTTGCGGGACCTTAG3'XRCCl (Arg399Gln)反向引物5' CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3'(4)MTHFR (C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR (C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(5)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(6)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的6條DNA測序引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)測序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'(2)CYPlAl (MspI)測序引物5, GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3'(3)XRCCl(Arg399Gln)測序引物5'TGACCTTGCGGGACCTTAG3'(4)MTHFR(C677T)測序引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(5)GSTMl(Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(6)GSTTl(Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)卩0 反應體系10\ 0 反應緩沖液2.5111，251111 dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測肺腺癌易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP1A1基因上Ile462Val及MSPI位點多態性，XRCC1基因上Arg399Gln位點多態性，MTHFR基因上C677T位點多態性，GSTM1基因缺失與否(Present/Null)位點多態性，GSTT1基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的6個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與肺腺癌發生密切相關的6個單核苷酸多態性位點的基因型來評估受檢者肺腺癌患病的風險級別，并最終根據每一位受檢者的基因檢測結果從基因層面指導受檢者有針對性的預防肺腺癌的發生，降低肺腺癌的發病幾率。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102586444SQ20121005361
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司