專利名稱：小細胞肺癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種小細胞肺癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估小細胞肺癌發病的風險級別，并作為預防和治療小細胞肺癌的方向指導。
背景技術：
肺癌是最常見的肺原發性惡性腫瘤，絕大多數肺癌起源于支氣管黏膜上皮，故亦稱支氣管肺癌。近50多年來，世界各國特別是工業發達國家，肺癌的發病率和死亡率均迅速上升，死于癌癥的男性病人中肺癌已居首位，女性僅次于乳腺癌死亡占第二位，多發生在 45-75歲年齡段。40多年前，在我國因肺部疾病施行外科手術治療的病人中，絕大多數為肺炎，次之為支氣管擴張、肺膿腫等肺部感染性疾病，肺癌病例為數不多。近30多年來，肺切除術的病例中肺癌逐漸增多，已躍居首位。上海市惡性腫瘤統計資料顯示，在男性癌癥病例中，肺癌發病率急劇增多，居第一位。肺癌臨床上分兩大類小細胞肺癌(small cell lung carcinoma, SCLC)禾口非小細胞月市癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)。小細胞肺癌發病率占肺癌總數的10. 7% -21. 5%，癌細胞倍增時間為33天，因此癌細胞早期即可侵犯淋巴結及小血管，發生淋巴或血行轉移灶，其生物學行為和細胞學特性決定了患者轉移早、預后較差、易復發、生存期短。血管生長是腫瘤增殖、浸潤與轉移的必要條件，腫瘤長至直徑2_3mm、細胞數大于 IO7左右時，必須有新生的毛細血管和小血管生長來提供營養物質和氧來維持其生長。研究表明在肺癌患者中較多的血管生長與其預后較差存在一定的相關性，腫瘤組織中的毛細血管和小血管生長越多，腫瘤生長越快。而在腫瘤組織中血管生長的過程中，一些細胞因子如成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子(VEGF)等都起到了重要作用，其中VEGF是近來發現的一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，又稱血管通透性因子，在腫瘤血管行程中扮演著重要的作用。該基因T-460C位點T到C突變，導致VEGF基因表達水平升高，刺激血管生成增加，提高了小細胞肺癌的發病風險，因此該位點多態能用于小細胞肺癌易感性的檢測。CYPlAl主要在肺組織中表達，編碼的芳烴羥化酶，是活化煙草中多環芳烴類化合物如苯并芘(B〔a〕P)的主要酶類，而B〔a〕P經過I相代謝反應激活后的產物苯并芘-二醇環氧化物(BPDE)致癌性更強。CYPlAl的多態性主要表現在Εχοη7多態位點，其第4889位置出現了 A — G的轉換，使與該蛋白的亞鐵血紅素結合區相關的第462位的異亮氨酸(Ile) 被纈氨酸(Val)所替代，故又稱為Ile/Val多態。Ile/Val多態有三種基因型Ile/Ile (野生型)，Ile/Val (突變雜合型)和Val/Val (突變純合型)。Ile462Val多態的突變基因表達的CYPlAl酶活性比正常基因表達的酶活性明顯增高，可產生高誘導活性的CYPlAl酶，使多環芳烴類化合物活化速率加快，導致多種癌癥的發生風險增高。因此該位點可以作為肺癌易感性的遺傳檢測因子。MTHFR全稱5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶，在葉酸代謝過程中起著非常重要的作用。研究表明葉酸及其代謝中間產物在機體生理生化反應中的重要作用決定了一旦機體發生葉酸缺陷或者葉酸代謝酶缺陷，可能導致細胞周期異常，DNA、蛋白質甲基化反應異常、 DNA堿基無法正常合成等多種生化異常反應，而直接或間接導致新生兒神經管缺陷以及成年人的癌癥、心腦血管疾病的發生。研究發現，MTHFR 677位點的多態性是影響該酶的活性的一個重要因素。攜帶MTHFR 677T等位基因的個體的酶活性為攜帶野生型的45%左右，影響了葉酸代謝，引起一系列疾病發病風險的增加，導致肺癌發病風險增加，該位點可以作為小細胞肺癌的易感基因檢測位點。綜上所述，鑒于VEGF，CYPlAl, MTHFR在小細胞肺癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在小細胞肺癌發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患小細胞肺癌的高危人群，從而有針對性的預防和治療小細胞肺癌，這對于降低小細胞肺癌的發病率有非常重要的意義。
發明內容
基于VEGF 基因上 T-460C，CYPlAl 基因上 Ile462Val，MTHFR 基因上 C677T 的 3 個單核苷酸多態性位點基因型可作為評估小細胞肺癌發病的危險因子的基礎上，本發明提供一種小細胞肺癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測VEGF 基因上 T-460C，CYPlAl 基因上 Ile462Val，MTHFR 基因上 C677T 的 3 個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物； PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1.檢測試劑盒的使用1、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(1)VEGF(T-460C)正向引物5' TGTTTGGGAGGTCAGAAATAGG3‘VEGF (T-460C)反向引物5 ‘ GGGAGCAGGAAAGTGAGGTTA3 ‘(2)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3‘CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3‘(3) MTHFR (C677T)正向引物5 ‘ CATCCCTCGCCTTGAACAG 3 ‘
MTHFR (C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT 3 ‘PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq酶0. 125 μ 1、DNA模板 1 μ 1 (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C 1分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(1)VEGF(T-460C)測序引物5' TGTTTGGGAGGTCAGAAATAGG3‘(2)CYPlAl(Ile462Val)測序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3‘(3)MTHFR(C677T)測序引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測序引物lul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98°C 2mi η,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的轉速離心30min，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min離心15min，輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行預防小細胞肺癌發病的基因無創檢測的服務1.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的VEGF基因上T-460C，CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這3個SNI3s位點的基因型。3.小細胞肺癌發病高危人群風險評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具小細胞肺癌易感基因風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者VEGF基因上T-460C，CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3個基因上SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀小細胞肺癌易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種檢測小細胞肺癌易感基因無創檢測試劑盒，其特征在于檢測VEGF基因上 T-460C, CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對VEGF基因上T-460C，CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3個單核苷酸多態性位點， 能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對VEGF基因上T-460C，CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下(1)VEGF(T-460C)正向引物5‘ TGTTTGGGAGGTCAGAAATAGG3‘VEGF (T-460C)反向引物5 ‘ GGGAGCAGGAAAGTGAGGTTA3 ‘(2)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5, CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3‘CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3‘(3)MTHFR (C677T)正向引物5 ‘ CATCCCTCGCCTTGAACAG 3 ‘MTHFR (C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT 3 ‘
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下(1)VEGF(T-460C)測序引物5‘ TGTTTGGGAGGTCAGAAATAGG3‘(2)CYPlAl(Ile462Val)測序引物5, CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3‘(3)MTHFR(C677T)測序引物5'CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)PCR反應體系10XPCR反應緩沖液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 測序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測小細胞肺癌易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測VEGF基因上T-460C，CYP1A1基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與小細胞肺癌發生密切相關的3個單核苷酸多態性位點的基因型來評估受檢者小細胞肺癌患病的風險級別，并最終根據每一位受檢者的基因檢測結果從基因層面指導受檢者有針對性的預防小細胞肺癌的發生，降低小細胞肺癌的發病幾率。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102559902SQ20121002199
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月1日 優先權日2012年2月1日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司