專利名稱：菌種誘變儀以及利用其復合誘變放射形根瘤菌的方法
技術領域：
本發明屬于菌種誘變，特別是指一種菌種誘變儀以及利用其復合誘變放射形根瘤菌的方法。
背景技術：
微生物正常狀態下發生基因突變的機率為10_6，發生正向突變的機率更低。采用單一的物理誘變方法對微生物突變產生的效應小，兩種或兩種以上的物理誘變方法復合使用對微生物突變產生的效應大。專利號為03218655. x的實用新型專利中公開了一種誘變接種兩用箱，該實用新型通過外接的磁力攪拌器對其內部的菌種實現單一物理方法的誘變， 其強度不易實現調整和控制，且誘變效果不明顯。放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的菌種，申請號為201110219188. 5的發明專利申請中公開可以利用該菌種生產可得然膠，但利用該菌種生產可得然膠發酵液中可得然膠的固含量較低。
發明內容
本發明的目的之一在于提供一種菌種誘變儀，本發明的目的之二是提供利用菌種誘變儀復合誘變放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031的方法，通過采用紫外燈光照、外加強度可調的磁場、使用紅外線燈提高菌種誘變環境溫度、以及利用藥物誘變對放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031進行誘變，達到提高突變效應，提高突變后菌種的產膠率的目的。
保藏編號為CGMCCNo. 5031的放射形根瘤菌已于2011年7月12日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，該保藏單位位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號， 該誘變株的分類命名為放射性根瘤菌(Rhizobium radiobacter)。本發明的目的之一是這樣實現的
菌種誘變儀，包括箱體、封裝于箱體前部的箱門、設置于箱體外部的箱蓋；電路部分包括電源、紫外燈管、紅外線燈、變壓器、電感線圈、滑動變阻器以及顯示儀表，紫外燈管、紅外線燈和變壓器初級線圈并聯后分別接于電源兩端，變壓器次級線圈經滑動變阻器與電感線圈構成回路，顯示儀表聯接于回路中；其中紫外燈管、紅外線燈設于箱體內部上方；顯示儀表包括串聯設置于回路中的電流表，分別聯接于電感線圈首尾兩端的電壓表；電源選用220V交流電源，電感線圈用直徑O. 5毫米銅導線、纏繞匝數為1000，紫外燈管的波長為 260nm，紅外線燈的功率為35W。本發明的第二個目的是這樣實現的
利用菌種誘變儀復合誘變放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031的方法，由如下工藝步驟組
成
A、化學誘變
將放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031試管菌種斜面接種于裝有滅菌后的150-200ml培養基的三角瓶中，進行搖床培養得到菌懸液，搖瓶培養的條件為轉速200-220轉/分鐘，溫度36-38°C，培養時間20-24小時；
搖瓶培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖O. 5%-1%、蛋白肽O. 1%-0. 3%、磷酸氫二鉀O. 15%-0. 25%、磷酸二氫鉀
O.05%-0. 1%、生物素 5ppm-10ppm、5-溴尿嘧啶 O. 005%-0. 01%、利福平 O. 0005%-0. 001%、余量為無菌水，pH=6-7 ；
B、磁光熱藥復合誘變 BI、培養平板的制備
將步驟A中制備的菌懸液稀釋后，取O. 1-0. 15ml均勻涂覆在盛有固體培養基的培養皿表面，固體培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖O. 5%-1%、花生餅粉O. 1%-0. 3%、蛋白胨O. 1%-0. 3%、磷酸氫二鉀O. 08%-0. 1%、 磷酸二氫鉀O. 02%-0. 04%、生物素20ppm-30ppm、5-溴尿嘧啶O. 005%-0. 01%、利福平 lppm-1. 5ppm、瓊脂 I. 5%-2. 0%、余量為無菌水，pH=6_7 ；
B2、復合誘變
開啟菌種誘變儀預熱，打開紅外線燈D3使箱體內溫度保持至36-38°C ;打開紫外燈管 D2，然后調節滑動變阻器R旋鈕使電流表A指針指向O. 6A，紫外照射30秒后關閉紫外燈管 D2 ；72小時時，調節滑動變阻器R旋鈕使電流表A指針指向O刻度，關閉紅外線燈D3 ;將培養皿包扎嚴密后取出，倒置放置于培養箱中36-38°C培養86-96小時得到該菌種的誘變株。申請人:已于2012年3月6日將該誘變株提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，該保藏單位位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號，該誘變株的分類命名為放射性根瘤菌rat/ioAacier),保藏編號為CGMCCNo. 5848。本發明的具體技術構思還有
為便于進行箱體內的菌種誘變操作，觀察操作過程中培養容器中的菌落形態，優選的技術方案是在箱體內部上方還設一照明燈，該照明燈與紫外燈管、紅外線燈、變壓器初級線圈并聯后接于電源兩端。為便于對電感線圈所在的回路中的電流和電壓情況進行觀察和控制，優選的技術方案是電壓表和電流表設于箱蓋表面，變壓器、滑動變阻器、電感線圈、電源設于箱體一側外部的箱蓋內。電感線圈可以根據實際情況選用包括鐵氧體線圈、鐵芯線圈等多種現有的形式， 并不脫離本發明的實質。其中優選的技術方案是采用鐵芯線圈。為便于對滑動變阻器進行控制，以有效改變電感線圈所產生的磁場強度，優選的設計方案是滑動變阻器的滑動端與位于箱蓋表面的控制手柄聯連。所述的步驟BI中的菌懸液稀釋是將步驟A中制備的菌懸液稀釋為體積比為10, 的菌懸液。優選的稀釋方法是，稀釋是按照體積比為1:10的比例依次將步驟A中制備的菌懸液稀釋為體積比為10_10的菌懸液，即依次稀釋為10' 10_2、10' 10_4、10_5、10' 10' 10_8、 10'I (Tici。可以顯而易見的是，步驟B2中對培養皿的包扎可以選用多種現有不透氣的遮光材料(如牛皮紙、遮光膜等等)，以避免外界環境對培養皿內菌種的影響。其中較為優選且常見的是，步驟B2中采用牛皮紙將培養皿包扎嚴密。誘變后菌種發酵制備可得然膠固形物的檢測(一)發酵液制備
將誘變后的放射形根菌CGMCC NO. 5031試管斜面I支，無菌操作接種于裝有滅菌好的 150-200ml培養基的三角瓶中進行搖床培養制成搖瓶種子，培養條件為轉速200-220轉/ 分鐘，溫度36-38°C，培養時間20-24小時。搖瓶培養的培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖O. 5%-1%、蛋白肽O. 1%-0. 3%、磷酸氫二鉀O. 15%-0. 25%、磷酸二氫鉀 O. 05%-0. 1%、生物素 5ppm-10ppm、pH=6-7、余量為無菌水。將培養好搖瓶種子按照質量百分比為5-10%的接種量接入滅菌后的發酵培養基中進行搖床培養發酵，發酵條件為轉速200-220轉/分鐘，溫度36-38°C，培養時間90-96 小時，制得發酵液。發酵培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖10%-12%、硝酸鈉O. 3%-0. 45%、磷酸氫二鉀O. 1%-0. 2%、磷酸二氫鉀O. 15%-0. 3%、 FeSO4 10ppm-15ppm、生物素20ppm-30ppm、聚醚消泡劑O. 03%-0. 1%、余量為無菌水；
(二)檢測
對發酵液中可得然膠的含量采用如下檢測方法
將發酵液倒入一定體積的小燒杯中，用玻璃棒攪拌使其無氣泡，用玻璃棒把表面抹平， 把杯子外的發酵液清洗干凈。發酵液用質量百分比為90-95%的乙醇提取、沉降、過濾布擠干，將其撕碎后全部徹底移入到培養皿中，在微波爐小火烘3分鐘，然后放入100±5°C烘箱中烘至恒重(約4小時)，拿出稱重。(三)計算
固形物含量(g/L)=(稱樣克數/發酵液體積)X 100%
經檢測計算，檢測固含量最高可達96克/升，而現有的菌種在培養溫度為30-33°C時發酵液中可得然膠的固含量為78克/升。本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于
I、本發明巧妙的將紫外燈光照、磁場和使用紅外線燈提高菌種誘變環境溫度三種物理誘變方法結合于菌種誘變儀上，其結構設計簡單有效，對菌種誘變機率大。2、由于電感線圈L所產生的磁場強度、紫外燈的照射強度以及提高菌種誘變環境溫度的調整，均可以實現較為準確的控制，從而可以科學的對菌種誘變的成因進行分析，為科學實驗奠定了基礎，同時可以有效縮短實驗的進程，有助于菌種誘變的工業化生產。3、采用磁光熱藥對放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031進行復合誘變，有效提高了誘變后菌種的產膠率，為工業化生產中可得然膠固形物收率的提高提供了有效的技術支撐。
圖I是本發明的結構示意圖。圖2是本發明的電路圖。圖3是圖I的后視圖。本發明中的附圖標記如下
I、箱蓋；2、箱體；3、箱門；4、控制手柄；A、電流表；D1、照明燈；D2、紫外燈管;D3、紅外線燈；L、電感線圈；L1、初級線圈；L2、次級線圈；R、滑動變阻器；T、變壓器；V、電壓表。該放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031的誘變株申請人已于2012年3月6日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，該誘變株的保藏編號為 CGMCCNo. 5848。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的實施例做進一步描述，但不作為對本發明的限定，本發明的保護范圍以權利要求記載的內容為準，任何依據本說明書所做出的等效技術手段替換均不脫離本發明的保護范圍。實施例I
本實施例中菌種誘變儀整體技術構造如圖所示，其中包括箱體2、封裝于箱體2前部的箱門3、設置于箱體2外部的箱蓋I ;電路部分包括電源、紫外燈管D2、紅外線燈D3、變壓器 T、電感線圈L、滑動變阻器R以及顯示儀表，紫外燈管D2、紅外線燈D3和變壓器初級線圈LI 并聯后分別接于電源兩端，變壓器次級線圈L2經滑動變阻器R與電感線圈L構成回路，顯示儀表聯接于回路中；其中紫外燈管D2、紅外線燈D3設于箱體2內部上方，變壓器T、滑動變阻器R、電感線圈L、電源設于箱體2 —側外部的箱蓋I內；顯示儀表包括串聯設置于回路中的電流表A，分別聯接于電感線圈L首尾兩端的電壓表V ;電源選用220V交流電源，電感線圈L用直徑O. 5毫米銅導線、纏繞匝數為1000，紫外燈管D2的波長為260nm，紅外線燈D3 的功率為35W。在箱體2內部上方還設一照明燈D1，該照明燈Dl與紫外燈管D2、紅外線燈D3、變壓器初級線圈LI并聯后接于電源兩端。電壓表V和電流表A設于箱蓋I表面。電感線圈L采用鐵芯線圈。滑動變阻器R的滑動端與位于箱蓋I表面的控制手柄4聯連。利用磁光熱復合菌種誘變儀復合誘變放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031的方法，由如下工藝步驟組成
A、化學誘變
將放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031試管菌種斜面接種于裝有滅菌后的150ml培養基的三角瓶中，進行搖床培養得到菌懸液，搖瓶培養的條件為轉速200轉/分鐘，溫度36°C，培養時間20小時；
搖瓶培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖O. 5%、蛋白肽O. 1%、磷酸氫二鉀O. 15%、磷酸二氫鉀O. 05%、生物素5ppm、5-溴尿嘧啶O. 005%、利福平O. 0005%、余量為無菌水，pH=6-7 ；
B、磁光熱藥復合誘變 BI、培養平板的制備
將步驟A中制備的菌懸液稀釋后，取O. 1-0. 15ml均勻涂覆在盛有固體培養基的培養皿表面，固體培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖O. 5%、花生餅粉O. 1%、蛋白胨O. 1%、磷酸氫二鉀O. 08%、磷酸二氫鉀O. 02%、生物素20ppm、5-溴尿嘧啶O. 005%、利福平I. 5%、余量為無菌水，pH=6_7 ；B2、復合誘變
開啟菌種誘變儀預熱，打開紅外線燈D3使箱體內溫度保持至36°C ;打開紫外燈管D2， 然后調節滑動變阻器R旋鈕使電流表A指針指向O. 6A，紫外照射30秒后關閉紫外燈管D2 ； 72小時時，調節滑動變阻器R旋鈕使電流表A指針指向O刻度，關閉紅外線燈D3 ;將培養皿包扎嚴密后取出，倒置放置于培養箱中36°C培養86小時。所述的步驟BI中的菌懸液稀釋是將步驟A中制備的菌懸液稀釋為體積比為10, 的菌懸液。優選的稀釋方法是，稀釋是按照體積比為1:10的比例依次將步驟A中制備的菌懸液稀釋為體積比為10_10的菌懸液，即依次稀釋為10' 10_2、10' 10_4、10_5、10' 10' 10_8、 10'I (Tici。步驟B2中采用牛皮紙將培養皿包扎嚴密。實施例2
本實施例中菌種誘變儀的結構同實施例I，利用菌種誘變儀復合誘變放射形根瘤菌 CGMCC NO. 5031的方法，由如下工藝步驟組成
A、化學誘變
將放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031試管菌種斜面接種于裝有滅菌后的200ml培養基的三角瓶中，進行搖床培養得到菌懸液，搖瓶培養的條件為轉速220轉/分鐘，溫度38°C，培養時間24小時；
搖瓶培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖1%、蛋白肽O. 3%、磷酸氫二鉀O. 25%、磷酸二氫鉀O. 1%、生物素10ppm、5-溴尿嘧啶O. 01%、利福平O. 001%、余量為無菌水，pH=6-7 ；
B、磁光熱藥復合誘變 BI、培養平板的制備
將步驟A中制備的菌懸液稀釋后，取O. 15ml均勻涂覆在盛有固體培養基的培養皿表面，固體培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖1%、花生餅粉O. 3%、蛋白胨O. 3%、磷酸氫二鉀O. 1%、磷酸二氫鉀O. 04%、生物素 30ppm、5-溴尿嘧啶O. 01%、利福平L 5ppm、瓊脂2. 0%、余量為無菌水，pH=6_7 ；
B2、復合誘變
開啟菌種誘變儀預熱，打開紅外線燈D3使箱體內溫度保持至38°C ;打開紫外燈管D2， 然后調節滑動變阻器R旋鈕使電流表A指針指向O. 6A，紫外照射30秒后關閉紫外燈管D2 ； 72小時時，調節滑動變阻器R旋鈕使電流表A指針指向O刻度，關閉紅外線燈D3 ;將培養皿包扎嚴密后取出，倒置放置于培養箱中38°C培養96小時。其余步驟同實施例I。實施例3
本實施例中菌種誘變儀的結構同實施例1，利用菌種誘變儀復合誘變放射形根瘤菌 CGMCC NO. 5031的方法，由如下工藝步驟組成
A、化學誘變
將放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031試管菌種斜面接種于裝有滅菌后的180ml培養基的三角瓶中，進行搖床培養得到菌懸液，搖瓶培養的條件為轉速210轉/分鐘，溫度37°C，培養時間22小時；
8搖瓶培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖O. 8%、蛋白肽O. 2%、磷酸氫二鉀O. 2%、磷酸二氫鉀O. 08%、生物素8ppm、5-溴尿嘧啶O. 007%、利福平O. 0008%、余量為無菌水，pH=6-7 ；
B、磁光熱藥復合誘變 BI、培養平板的制備
將步驟A中制備的菌懸液稀釋后，取O. 13ml均勻涂覆在盛有固體培養基的培養皿表面，固體培養基由如下質量百分數的組分組成
葡萄糖O. 8%、花生餅粉O. 2%、蛋白胨O. 2%、磷酸氫二鉀O. 09%、磷酸二氫鉀O. 03%、生物素25ppm、5-溴尿嘧啶O. 008%、利福平I. 2ppm、瓊脂I. 8%、余量為無菌水，pH=6_7 ；
B2、復合誘變
開啟菌種誘變儀預熱，打開紅外線燈D3使箱體內溫度保持至37°C ;打開紫外燈管D2， 然后調節滑動變阻器R旋鈕使電流表A指針指向O. 6A，紫外照射30秒后關閉紫外燈管D2 ； 72小時時，調節滑動變阻器R旋鈕使電流表A指針指向O刻度，關閉紅外線燈D3 ;將培養皿包扎嚴密后取出，倒置放置于培養箱中37°C培養90小時。其余步驟同實施例I。
權利要求
1.菌種誘變儀，包括箱體(2)、封裝于箱體(2)前部的箱門(3)、設置于箱體(2)外部的箱蓋(I);電路部分包括電源、紫外燈管(D2)、紅外線燈(D3)、變壓器(T)、電感線圈(L)、滑動變阻器(R)以及顯示儀表；其特征在于紫外燈管(D2)、紅外線燈(D3)和變壓器初級線圈 (LI)并聯后分別接于電源兩端，變壓器次級線圈(L2)經滑動變阻器(R)與電感線圈(L)構成回路，顯示儀表聯接于回路中；其中紫外燈管(D2)、紅外線燈(D3)設于箱體(2)內部上方，顯示儀表包括串聯設置于回路中的電流表(A)，分別聯接于電感線圈(L)首尾兩端的電壓表(V);電源選用220V交流電源，電感線圈(L)用直徑O. 5毫米銅導線、纏繞匝數為1000， 紫外燈管(D2)的波長為260nm，紅外線燈(D3)的功率為35W。
2.根據權利要求I所述的菌種誘變儀，其特征在于在箱體(2)內部上方還設一照明燈 (D1)，該照明燈(Dl)與紫外燈管(D2)、紅外線燈(D3)、變壓器初級線圈(LI)并聯后接于電源兩端。
3.根據權利要求I所述的菌種誘變儀，其特征在于變壓器(T)、滑動變阻器(R)、電感線圈(L)、電源設于箱體(2) —側外部的箱蓋(I)內，電壓表(V)和電流表(A)設于箱蓋(I)表面。
4.根據權利要求I所述的菌種誘變儀，其特征在于電感線圈(L)選用鐵芯線圈。
5.根據權利要求I所述的菌種誘變儀，其特征在于滑動變阻器(R)的滑動端與位于箱蓋(I)表面的控制手柄(4)聯連。
6.一種利用如權利要求1-5所述的利用菌種誘變儀復合誘變放射形根瘤菌的方法，其特征在于由如下工藝步驟組成A、化學誘變將放射形根瘤菌CGMCC NO. 5031試管菌種斜面接種于裝有滅菌后的150-200ml培養基的三角瓶中，進行搖床培養得到菌懸液，搖瓶培養的條件為轉速200-220轉/分鐘，溫度 36-38°C，培養時間20-24小時；搖瓶培養基由如下質量百分數的組分組成葡萄糖O. 5%-1%、蛋白肽O. 1%-0. 3%、磷酸氫二鉀O. 15%-0. 25%、磷酸二氫鉀 O. 05%-0. 1%、生物素 5ppm-10ppm、5-溴尿嘧啶 O. 005%-0. 01%、利福平 O. 0005%-0. 001%、余量為無菌水，pH=6-7 ；B、磁光熱藥復合誘變BI、培養平板的制備將步驟A中制備的菌懸液稀釋后，取O. 1-0. 15ml均勻涂覆在盛有固體培養基的培養皿表面，固體培養基由如下質量百分數的組分組成葡萄糖O. 5%-1%、花生餅粉O. 1%-0. 3%、蛋白胨O. 1%-0. 3%、磷酸氫二鉀O. 08%-0. 1%、 磷酸二氫鉀O. 02%-0. 04%、生物素20ppm-30ppm、5-溴尿嘧啶O. 005%-0. 01%、利福平 lppm-1. 5ppm、瓊脂 I. 5%-2. 0%、余量為無菌水，pH=6_7 ；B2、復合誘變開啟磁光熱復合菌種誘變儀預熱，打開紅外線燈(D3)使箱體內溫度保持至36-38°C;打開紫外燈管(D2)，然后調節滑動變阻器(R)旋鈕使電流表(A)指針指向O. 6A，紫外照射30 秒后關閉紫外燈管(D2 );72小時時，調節滑動變阻器(R)旋鈕使電流表(A)指針指向O刻度， 關閉紅外線燈(D3);將培養皿包扎嚴密后取出，倒置放置于培養箱中36-38°C培養86-96小時。
7.根據權利要求6所述的利用菌種誘變儀復合誘變放射形根瘤菌的方法，其特征在于所述的步驟BI中的菌懸液稀釋是將步驟A中制備的菌懸液稀釋為體積比為10,的菌懸液。
8.根據權利要求6所述的利用菌種誘變儀復合誘變放射形根瘤菌的方法，其特征在于所述的稀釋是按照體積比為1:10的比例依次將步驟A中制備的菌懸液稀釋為體積比為I。-10 的菌懸液，即依次稀釋為 ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο,。
9.根據權利要求6所述的利用菌種誘變儀復合誘變放射形根瘤菌的方法，其特征在于所述的步驟B2中采用牛皮紙將培養皿包扎嚴密。
全文摘要
本發明屬于菌種誘變，特別是指一種菌種誘變儀以及利用其復合誘變放射形根瘤菌的方法。菌種誘變儀包括箱體、箱門、箱蓋；電路部分包括電源、紫外燈管、紅外線燈、變壓器、電感線圈、滑動變阻器以及顯示儀表，紫外燈管、紅外線燈和變壓器初級線圈并聯后分別接于電源兩端，變壓器次級線圈經滑動變阻器與電感線圈構成回路，顯示儀表聯接于回路中，采用上述誘變儀對放射形根瘤菌CGMCCNO.5031進行復合誘變。本發明解決了現有技術存在解決了現有設備中誘變效果不明顯、菌種產膠率低的問題，具有復合誘變儀可有效提高菌種誘變機率、誘變后的菌種產膠率得到明顯提高等優點。
文檔編號C12N13/00GK102586102SQ20121006054
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日
發明者張星昊 申請人:張星昊