專利名稱：稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP及其方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業生物技術領域，特別涉及一種稻瘟病抗性基因Pik-m功能性分子標記PikmFNP及其方法與應用。
背景技術：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是對水稻生產危害最嚴重的病害之一,姆年都造成嚴重的糧食損失。從環境保護與農業可持續發展的觀點來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。傳統的水稻抗性育種依賴于抗性表型的鑒定，這不僅要求育種者必須具備豐富的接種、調查經驗，而且還容易受到環境以及人為因素的影響，鑒定結果容易造成誤差，目標基因的選擇效率往往較低。隨著分子標記技術的產生以及利用，其方便、直接、不受環境影響等優點使得該技術的應用價值及前景越來越受到關注。在育種方面，通過開發與目標基因緊密連鎖的分子標記，特別是在基因內部開發其功能特異性的分子標記來對目標基因進行選擇，不僅選擇可靠性高，而且還大大加快了育種步伐。由于含有5個具有不同抗譜以及小種特異性的等位基因Pik-m、Pik、Pik-p、Pik-h以及Pik-s，位于第11染色體長臂端上的Pik位點一直是稻瘟病抗性研究以及抗病育種的焦點。其中，Pik-m(Ashikawa et al. 2008. Two adjacent nucleotide-bindingsite—leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm—specific riceblast resistance. Genetics 180 :2267-2276)、Pik(Zhai et al. 2011. The isolation andcharacterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication. New Phytologist 189:321-334)以及Pik_p(Yuan et al. 2011. The Pik-presistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linkedCC-NBS-LRR genes. TheorAppl Genet 122:1017-1028)已被成功地鑒定并克隆 研究表明，這3個等位基因的稻瘟病抗性須由2個相鄰的NBS-LRR類抗病基因共同介導。同時，在水稻群體中，包含這3個等位基因的基因組區域存在著基因型的分化，即當相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因同時存在時，該基因型定義為K型；而當相鄰的2個功能性的NBS-LRR基因同時不存在時，該基因型定義為N型(基因型與感病水稻參考品種日本睛的相同)。為了加快Pik-m在抗病育種工作中的應用，如在大量的水稻種質資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標記輔助選擇育種、抗性基因Pik-m與其他功能基因的聚合育種、轉基因育種中的應用，開發出準確有效的且區別于其它稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特異性分子標記顯得尤為重要。
發明內容
為了克服現有技術的不足和缺點，本發明的首要目的是提供一種稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP。
本發明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的檢測方法。本發明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的應用。本發明目的通過以下技術方案實現一種稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標記PikmFNP，它是由引物對SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2從水稻總DNA中擴增出的核苷酸序列，并經特異性酶切之后，與稻瘟病抗性基因Pik-m呈特異性帶型的分子標記；所述的引物對的核苷酸序列如下所示
SEQ ID NO. 1(5，-3，)TCGCCGGTGACCTAAGAGAT ；SEQ ID NO. 2(5’ _3，) GATTTCACCGGCGCAAGCAT ；所述的水稻品種為Tsuyuake ；所述的稻瘟病抗性基因Pik-m包括2個編碼NBS-LRR類蛋白的基因Pikml-TS和Pikm2-TS ；所述的特異性酶切指的是Mbo I酶切；所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的檢測方法，通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列與Pikml-TS及Pikm2_TS做比對的方法，分析得到能區別于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特異性的I處單堿基差異(single nucleotide polymorphism, SNP),再通過引物設計得到SEQ IDNO. I及SEQ ID NO. 2，對水稻DNA進行擴增得到Pik_m功能特異性分子標記PikmFNP。優選的，上述稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的檢測方法，包括以下步驟(I)通過常規PCR法擴增，獲得多個K型水稻品種的Pik-m等位基因的編碼區DNA序列；(2)利用多序列比對軟件工具(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)，將步驟⑴所獲得的序列翻譯成蛋白質序列后進行比對，得到Pik_m抗性基因所特異的I個SNP，其位于Pik-m組成基因中的Pikml-TS的CC區域，最終導致功能特異性
氨基酸的改變；(3)根據步驟(2)所得到的 I 個 SNP 以及 dCAPS(Derived Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequences)標記的原理，利用 Primer Premier 5. 0 軟件工具(http://www.premierbiosoft. com)設計出引物對SEQ ID NO. I及SEQ ID NO. 2 ;并用這組引物分別對不同水稻的總DNA進行PCR擴增反應，然后分別對擴增產物進行酶切、電泳，比較驗證；(4)對步驟(3)所獲得的分子標記在不同水稻品種中進行驗證，從而確定Pik-m抗性基因的功能特異性的分子標記PikmFNP。更優選的，步驟(I)所述的K型水稻品種包括Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交4以及 Q1063 ；步驟(3)中在SNP處設計帶有錯配堿基的功能特異性上游引物SEQ ID NO. 1，而在其下游100_200bp處設計功能特異性下游引物SEQ ID NO. 2 ；
步驟(3)中所述的PCR的反應體系如下
10XPCR Buffer2 ^il
dNTPs (2.5 mM)1.6 ^il
上游引物(IOpM)0.5 ^il
下游引物(IOpM)0.5 ^il
r腳酶(5U4U)0.1 ^il
DNA模板(50ng/|il)Ifil
ddH20補至 20pl所述的PCR的反應條件如下預變性94°C 3分鐘；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分鐘，擴增35個循環；72°C 5分鐘;10°C保存。步驟(3)中所述的酶切為利用限制性內切酶Mbo I對所獲得的PCR產物進行酶切，
其反應體系如下
10 X酶切緩沖液1.2 W
PCR擴增產物5 ^il
Mbo I0.25 ^il
ddH20補至 12 ^il在3rc條件下酶切3小時后，取適量酶切產物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測，電泳條件為90V，2小時30分鐘。擴增所得到的PCR產物大小為166bp，酶切后所得到的產物大小為145bp，后者即為抗性基因Pik-m的功能特異性分子標記。所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的應用，包括在水稻種質資源中快速、直接地鑒定該抗性基因，以及在分子標記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉基因育種中的應用。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果本發明的Pik-m功能特異性選擇標記以PCR技術為基礎，不僅能區分水稻品種的基因型，而且能夠方便、快捷、直接地實現了目標基因Pik-m在水稻種質資源以及育種后代中的鑒定，且不受環境以及人為因素的影響。因此，能夠得到廣泛的應用，對降低勞動成本，提高育種工作效率起到積極重要的作用。
圖I是具有功能特異性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的組成基因之一Pikml-TS與4個Pik位點等位基因及2個感病等位基因的蛋白質序列比對圖；黑色星號表示由PikmFNP造成的功能特異性氨基酸的改變。圖2是水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的另ー組成基因Pikm2_TS與4個Pik位點等位基因及2個感病等位基因的蛋白質序列比對圖。
圖3是Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP在12個水稻品種中的驗證結果圖其中，泳道I :抗性基因供體品種Kusabue (Pik);泳道2 : IRBLk-Ka (Pik單基因系)；泳道3 :抗性品種Kando 51 (Pik);泳道4 :抗性品種Kuyuku 131 (Pik);泳道5 :抗性基因供體品種Tsuyuake (Pik-m);泳道6 : IRBLKm-TS (Pik-m單基因系)；泳道7 :抗性品種GA20 (Pik-m);泳道8 :抗性基因供體品種K60 (Pik_p);泳道9 :1RBLkp-K60 (Pik_p單基因系);泳道10 :抗性品種Taifenzhan(Pik-p);泳道11 =IRBLks-S(Pik-s單基因系);泳道12 IRBLKh-K3 (Pik-h 單基因系);泳道 M :DNAladder。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進ー步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例I :Pik等位基因編碼區序列的比對及SNP的鑒定通過常規的PCR擴增(Yuanet al. 2011. The Pik-p resistance to Magnaportheoryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NB S-LRR genes. TheorAppl Genet 122 :1017-1028 ;Zhai et al. 2011. The isolation and characterizationof Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologistl89 :321-334)、測序(上海英駿生物技術有限公司，廣州分公司)，從5個抗病水稻品種 Shin 2 (Pik-s 供體品種；Kiyosawa. 1987. With genetic view on themechanism of resistance and virulence. Japanese Journal of Genetics 41:89-92)、Tsuyuake(Pik-m 供體品種；Ashikawa et al. 2008. Two adjacent nucleotide-bindingsite—leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm—specificrice blast resistance. Geneticsl80 :2267-2276)、Kusabue (Pik 供體品種；Zhai etal.2011. i'he isolation and cnaracterization of Pik, a rice blast resistancegene wmch emerged after rice domestication. New Phytologist 189 :321-334)、K3 (Pik-h 供體品種；Xu et al. 2008. Efficient authentic fine mapping of the riceblast resistance gene Pik-h in the Pik cluster，using new Pik-h-differentiatingisolates. Molecular Breeding 22 :289-299)、K60 (Pik-p 供體品種；Yuan et al. 2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair ofclosely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genetl22 :1017-1028)及 2 個感病水稻品種黑交(K 型感病品種；Zhai et al. 2011. The isolation and characterization ofPik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. NewPhytologist 189 :321-334)、Q1063 (K 型感病品種；Zhai et al. 2011. The isolation andcharacterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication. New Phytologist 189 :321-334)中獲得相應的 Pik_m 等位基因編碼區DNA 序列[Pik-p (HM035369)，Pik(HM048900)，Pik_m(AB462256)，已經公開于 http://www.ncbi. nlm. nih. gov];利用多序列比對軟件工具(http://multalin. toulouse. inra. fr/multalin/)，通過對這些序列翻譯后的蛋白質序列進行比對分析，鑒定到存在于Pikml-TS基因cDNA第685位點的功能特異性SNP。在第685位點處，Pikml-TS編碼的第229位氨基酸為谷氨酰胺(Q)，而其它等位基因在該位點則編碼谷氨酸或賴氨酸(E或K)，因此，該位點可以將Pik-m與其它等位基因區分開(圖I)。圖2是水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的另ー組成基因Pikm2-TS與4個Pik位點等位基因及2個感病等位基因的蛋白質序列比對圖。在此，不存在Pik-m功能特異性的SNP。實施例2 :Pik_m功能特異性分子標記及其引物設計與檢測根據dCAPS 標記的原理(Neff et al. , 2002. Web-based primer design for thesingle nucleotide polymorphism analysis. Trends in Genetics 18 :d13_615),在上述SNP位點處設計帶有錯配堿基的功能特異性上游引物Pikm-FNP-F，如SEQ ID NO. I所示；在上述SNP位點下游100-200bp處設計功能特異性下游引物Pikm-FNP-R，如SEQ ID NO. 2所示。利用這該組引物對攜帶有Pik-m基因以及其他等位基因的品種DNA模板進行擴增。Pikm-FNP的PCR擴增反應體系如下
10XPCR Buffer2 ^il dNTPs (2.5 mM)1.6 ^il 上游引物 Pikm-FNP-F (10 ^iM)0.5 ^il 下游引物 Pikm-FNP-R (10 ^iM)0.5 ^il r腳酶(5U4U)0.1 ^il DNA模板(50ng/|il)Ifil ddH20補至 20plPikm-FNP的PCR擴增反應溫度循環條件如下94°C 3分鐘；94°C 30秒、58°C 30秒、720C I分鐘，35個循環；72°C 5分鐘；10°C保存。PCR反應結束后，利用限制性內切酶Mbo I對所獲得的PCR產物進行酶切，其反應
體系如下
10 X酶切緩沖液1.2 WPCR擴增產物5 ^ilMbo I0.25 ^il
ddH20補至 12 ^il在37°C條件下酶切3小時后，取適量酶切樣品在8%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測，電泳條件為90V，2小時30分鐘。擴增所得到的PCR產物大小為166bp，酶切后所得到的產物大小為145bp，后者(能被酶切)即為抗性基因Pik-m的功能特異性分子標記。實施例3 :抗性基因Pik-m功能特異性分子標記在鑒別不同稻瘟病抗性基因中的應用提取含有不同的稻瘟病抗性基因的12個水稻品種([分別為KuSabue、Kand051、Kuyuku 131、GA20、Taifenzhan(Zhai et al. 2011. The isolation and characterizationof Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologist 189 :321-334)、Tsuyuake(Ashikawa et al. 2008. Two adjacentnucleotide-binding site—leucine rich repeat class genes are required to conferPikm-specif ic rice blast resistance. Genetics 180 :2267-2276)、K60 (Yuan etal.2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pairof closely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet 122 :1017-1028)、IRBLk-Ka、IRBLKm-TS、IRBLkp_K60、IRBLks-S、及 IRBLKh_K3 (Kobayashi et al. 2007. Developmentofnew sets of international standard differential varieties for blast resistancein rice(Oryza sativa L.). JARQ 41:31-37]的基因組DNA，并以此為模板，利用實施例2中描述的Pikm-FNP的PCR擴增反應 體系和反應條件，對抗性基因Pik_m功能特異性的分子標記進行PCR擴增、酶切及電泳檢測。電泳結果分別如圖3所示。如
的那樣，試驗結果與設計分析的相吻合，說明抗性基因Pik-m功能特異性分子標記可在鑒別Pik-m基因與其他稻瘟病抗性基因得到應用。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標記PikmFNP，其特征在于是由引物對SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2從水稻總DNA中擴增出的核苷酸序列，并經特異性酶切之后，與稻瘟病抗性基因Pik-m呈特異性帶型的分子標記； 所述的引物對的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I :5’ -TCGCCGGTGACCTAAGAGAT-3’ ；SEQ ID NO.2 :5’ -GATTTCACCGGCGCAAGCAT-3’。
2.根據權利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標記PikmFNP，其特征在于所述的水稻為水稻品種Tsuyuake。
3.根據權利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標記PikmFNP，其特征在于所述的稻瘟病抗性基因Pik-m包括2個編碼NBS-LRR類蛋白的基因Pikml-TS和Pikm2-TS。
4.根據權利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特異性分子標記PikmFNP，其特征在于所述的特異性酶切為Mbo I酶切。
5.權利要求I 4任一項所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的檢測方法，其特征在于通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列與Pikml-TS及Pikm2-TS做比對的方法，分析得到能區別于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特異性的I處單堿基差異，再通過引物設計得到SEQ ID NO. I及SEQ ID NO. 2，對水稻DNA進行擴增得到Pik_m功能特異性分子標記PikmFNP。
6.根據權利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的檢測方法，其特征在于包括以下步驟 (1)通過常規PCR法擴增，獲得多個K型水稻品種的Pik-m等位基因的編碼區DNA序列； (2)利用多序列比對軟件工具，將步驟(I)所獲得的序列翻譯成蛋白質序列后進行比對，得到Pik-m抗性基因所特異的I個單堿基差異，其位于Pik-m組成基因中的Pikml-TS的CC區域，最終導致功能特異性氨基酸的改變； (3)根據步驟⑵所得到的I個單堿基差異以及dCAPS標記的原理，利用PrimerPremier 5. 0軟件工具設計出引物對SEQ ID NO. I及SEQ ID NO. 2 ;并用這組引物分別對不同水稻的總DNA進行PCR擴增反應，然后分別對擴增產物進行酶切、電泳，比較驗證； (4)對步驟(3)所獲得的分子標記在不同水稻品種中進行驗證，從而確定Pik-m抗性基因的功能特異性的分子標記PikmFNP。
7.根據權利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的檢測方法，其特征在于步驟(I)所述的K型水稻品種包括Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交4以及Q1063。
8.根據權利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述的PCR的反應體系如下10XPCR Buffer 2u 1,2. 5mMdNTP I. 6u l、10iiM 引物 SEQ ID NO. 10. 5 u l、10iiM 引物 SEQ ID NO. 20. 5 u l、5U/y I rTaq酶 0. I ii l、50ng/ V- I DNA 模板 I ii I、雙蒸水補至 20 ii I ; 所述的PCR的反應條件如下預變性94°C 3分鐘；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分鐘，擴增35個循環；72°C 5分鐘;10°C保存。
9.根據權利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的檢測方法，其特征在于 步驟(3)中所述的酶切為利用限制性內切酶Mbo I對所獲得的PCR產物進行酶切，其反應體系如下=IOX酶切緩沖液I. 2 μ I、PCR擴增產物5 μ I、Mbo I酶O. 25 μ 1，雙蒸水補至 12μ I。
10.權利要求I 4任一項所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP的應用，其特征在于所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP應用于在大量的水稻種質資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉基因育種。
全文摘要
本發明公開了一種稻瘟病抗性基因Pik-m功能特異性分子標記PikmFNP及其方法與應用。該分子標記PikmFNP是由引物對SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2從水稻總DNA中擴增出來的核苷酸序列。本發明通過對多個水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列與Pikm1-TS及Pikm2-TS序列做比對的方法，分析得到能區別于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特異性的單堿基差異，再通過設計，得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，對水稻DNA擴增，并經特異性酶切之后，得到Pik功能特異性分子標記PikmFNP。本發明可在大量的水稻種質資源中篩選、鑒定該功能性抗性基因，以及在分子標記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉基因育種中的得到應用。
文檔編號C12N15/11GK102618533SQ20121006027
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月8日 優先權日2012年3月8日
發明者林菲, 潘慶華, 王玲, 翟純 申請人:華南農業大學