專利名稱：一種海南霉素的發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種抗生素的發酵方法，具體涉及一種采用微生物菌種發酵海南霉素的方法，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
海南霉素是白色或類白色粉末，無臭無味，英文名Hainanmycin,分子式C47H80O15H2O,分子量884。海南霉素是中國自主開發的單價離子載體類抗生素獸藥，在防止雞球蟲感染和提高反芻動物飼料轉化率上具有顯著效果，為高效抗球蟲藥物。它對革蘭氏陽性菌如桿菌、球菌有廣泛的抗菌譜，對厭氧及某些植物病原菌、水稻紋枯病和油菜菌核病等真菌也有抗菌作用；對革蘭氏陰性菌不顯活性。南海霉素還能提高飼料轉化率，增進肉雞體重，改善雞肉品質，促進牛、羊等反芻動物的增長，被稱為長肉素。海南霉素是從我國海南島土壤中分離的一種稠李鏈霉菌東方變種(Streptomycespadanus Var dangfangeusls)培養液中提取出的,現今制備方法是取沙土管中的孢子，接種于斜面，28°C培養7天，接種2 3代斜面，備用，采用挖塊法接種，發酵主要原料為淀粉、魚粉。此方法孢子需在斜面上培養2-3代，難以保持菌種穩定，發酵單位無法達到生產要求。
發明內容
本發明針對背景技術中提到的現有發酵海南霉素的不足，提供了一種海南霉素的發酵方法，該方法海南霉素發酵單位穩定，較現有發酵工藝發酵單位高，具備生產要求。本發明采用發酵法生產海南霉素，所用的稠李東方鏈霉菌(Streptomycespadanus var. dangfangeusls) SDSL-HNl 109 已于 2011 年 9 月 29 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 5308。該SDSL-HN1109菌株是通過以下幾個階段選育出來的
一、從稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls) HNl 菌株出發，經連續亞硝基胍誘變得到比出發菌株產量提高20 %的SDSL-HN337號高產菌株。二、將SDSL-HN337號高產菌株經氮離子注入誘變，得到較SDSL-HN337菌株產量提高15%的SDSL-HNl 109菌株，產量在5210ug/ml左右。本發明采用上述菌種生產海南霉素，其技術方案如下
一種海南霉素的發酵方法，其特征是以稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanusvar. dangfangeusls) SDSL-HN1109 CGMCC NO. 5308為菌種進行發酵制備，包括以下步驟
(1)將冷藏的稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls)SDSL-HNl 109 CGMCC NO. 5308沙土孢子接種到斜面培養基上，在28°C下培養7天；
(2)用無菌水洗下步驟(I)斜面培養所得的孢子，加入甘油配成孢子懸浮液，在-70°C _80°C下保存備用；
(3)將孢子懸浮液O. 2ml接種到45-60ml種子培養基中，在28°C培養40 42小時，得種子液；
(4)將種子液按照10 20%的接種量接種到發酵培養基中，在28°C培養90 144小時，得發酵液。上述方法中，稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls)HNl 109沙土孢子的制備方法是將菌種進行斜面培養，用接種針將所得孢子刮下，送入滅菌的沙土管中，攪動沙土，使粘附在接種針上的孢子與沙土充分混合，塞緊棉塞，敲松沙土，將沙土管放入真空干燥器內，常溫下保持真空度O. 08 O. IMpa連續抽干40 60分鐘，然后敲松沙土，將沙土管放入盛有變色硅膠的干燥器中，置于O 8°C冰箱中保藏備用。 上述方法中，斜面培養基組分包括玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸鈣O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. 0wt%,飲用水余量。在配制斜面培養基時，玉米淀粉在70 80°C糊化10分鐘再與其他成分混合。上述方法中，種子培養基組分包括玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸鈣
O.8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。上述方法中，發酵培養基組分包括豆油6 10wt%，黃豆餅粉2. O 3. 0wt%，葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,氯化鈉
O.2 wt%，飲用水余量，ρΗ7· 4 7. 9。上述步驟(2)中，制得的孢子懸浮液中，每毫升孢子懸浮液含有IXlO8 IXIOiq個孢子。上述步驟(2)中，甘油的濃度為20wt%，甘油與無菌水的體積比為1:1。上述步驟(3)中，優選的，孢子懸浮液O. 2ml接種到50ml種子培養基中。本發明通過誘變選育得到了高產量的稠李東方鏈霉菌變異菌株，利用此菌株發酵制備海南霉素，發酵結果穩定，重復性好，海南霉素產量大大提高。此外，與現有工藝相比，本發明在制備發酵種子時僅需要一次斜面培養，避免了傳2 3代斜面，保證了菌種的純度，避免了菌種污染，簡化了操作，并且優化了發酵培養基組成及接種量，進一步的提高了海南霉素的產量。菌種保藏信息
稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls) SDSL-HN1109 已于2011年9月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC NO. 5308。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明進行進一步闡述，應該明白的是，下述說明僅是為了解釋本發明，并不對其內容進行限定。本發明的變異菌株是由我國海南島土壤中分離的稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls)誘變選育得來的，主要經兩步得到。第一步，從稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls) HNl 菌株出發，經連續亞硝基胍誘變得到比出發菌株產量提高20 %的SDSL-HN337號高產菌株；第二步，將SDSL-HN337號高產菌株經氮離子注入誘變，得到較SDSL-HN337菌株產量提高15%的SDSL-HNl 109菌株，產量在5000 ug/ml左右，隨著工藝條件的變化發酵產量有所不同，尤其是發酵時間的變化對發酵產量具有重要影響，在一定范圍內，發酵量隨發酵時間的增加而變大。
本發明在生產時，將選育所得海南霉素產生菌種放入沙土管中進行保存，其保存方法是將菌種進行斜面培養，用接種針將所得孢子刮下，送入滅菌的沙土管中，攪動沙土，使粘附在接種針上的孢子與沙土充分混合，塞緊棉塞，敲松沙土，將沙土管放入真空干燥器內，常溫下保持真空度O. 08 O. IMpa連續抽干40 60分鐘，然后敲松沙土，將沙土管放入盛有變色硅膠的干燥器中，置于O 8°C冰箱中保藏備用。 所用斜面培養基為玉米淀粉1. 0wt%,酵母粉1. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂 2. 0wt%o下面以上述制得的沙土孢子為菌種，進行發酵生產海南霉素，通過下列實施例進一步的解釋、詳述本發明。若無特別說明，下述實施例中所用培養基的組分含量均為重量百分比。實施例I
I、孢子斜面培養
在無菌條件下，用接種勺在沙土管內取出一勺沙土均勻散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均勻，瓶口用棉塞塞緊，外扎紗布，在28°C下培養7天；
所用斜面培養基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. 0wt%，飲用水余量。2、孢子懸浮液制備
使用50ml無菌水洗下培養所得的斜面孢子，然后加入等體積無菌的20wt%甘油，混合均勻后，制得孢子懸浮液，每毫升懸浮液中約含IO9個孢子，將懸浮液分裝與5ml耐低溫帶蓋塑料管中，在-70°C _80°C保存備用。3、種子液制備
按50ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養基，在28°C培養40小時，得種子液。種子培養基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,飲用水余量4取.4 7.9。4、發酵培養
將種子液按發酵培養基體積的10%接入發酵培養基中，在28°C下培養90小時，發酵單位為3852u/ml。所用配方為豆油6wt%，黃豆餅粉2. 0wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸鈣
O.5wt%，酵母粉O. 5wt%，硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,氯化鈉O. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。實施例2
I、孢子斜面培養在無菌條件下，用接種勺在沙土管內取出一勺沙土均勻散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均勻，瓶口用棉塞塞緊，外扎紗布，在28°C下培養7天；
所用斜面培養基為玉米淀粉I. Owt%,酵母粉I. Owt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. Owt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. Owt%，飲用水余量。2、孢子懸浮液制備 使用50ml無菌水洗下培養所得的斜面孢子，然后加入等體積無菌的20wt%甘油，混合均勻后，制得孢子懸浮液，每毫升懸浮液中約含IO9個孢子，將懸浮液分裝與5ml耐低溫帶蓋塑料管中，在-70°C _80°C保存備用。3、種子液制備
按50ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養基，在28°C培養40小時，得種子液。種子培養基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,飲用水余量4取.4 7.9。4、發酵培養
將種子液按發酵培養基體積的10%接入發酵培養基中，所用配方為豆油8wt%，黃豆餅粉2. 5wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀
O.02wt%，氯化鈉O. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。在28°C下培養120小時，發酵單位為5063u/ml。實施例3
I、孢子斜面培養
在無菌條件下，用接種勺在沙土管內取出一勺沙土均勻散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均勻，瓶口用棉塞塞緊，外扎紗布，在28°C下培養7天；
所用斜面培養基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. 0wt%，飲用水余量。2、孢子懸浮液制備
使用50ml無菌水洗下培養所得的斜面孢子，然后加入等體積無菌的20wt%甘油，混合均勻后，制得孢子懸浮液，每毫升懸浮液中約含109_101(1個孢子，將懸浮液分裝與5ml耐低溫帶蓋塑料管中，在_70°C _80°C保存備用。3、種子液制備
按50ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養基，在28°C培養40小時，得種子液。種子培養基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,飲用水余量4取.4 7.9。4、發酵培養
將種子液按發酵培養基體積的20%接入發酵培養基中，所用配方為豆油1(^丨％，黃豆餅粉3wt%,葡萄糖2. Owt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%，氯化鈉O. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。在28°C下培養144小時，發酵單位為6770u/ml。實施例4
I、孢子斜面培養
在無菌條件下，用接種勺在沙土管內取出一勺沙土均勻散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均勻，瓶口用棉塞塞緊，外扎紗布，在28°C下培 養7天；
所用斜面培養基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,瓊脂2. 0wt%，飲用水余量。2、孢子懸浮液制備
使用50ml無菌水洗下培養所得的斜面孢子，然后加入等體積無菌的20wt%甘油，混合均勻后，制得孢子懸浮液，每毫升懸浮液中含IO8-IO9個孢子，將懸浮液分裝與5ml耐低溫帶蓋塑料管中，在-70°C -80V保存備用。3、種子液制備
按45ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養基，在28°C培養40小時，得種子液。種子培養基為玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化鈉O. 3wt%,黃豆餅粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸鎂O. 05wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%,飲用水余量4取.4 7.9。4、發酵培養
將種子液按發酵培養基體積的20%接入發酵培養基中，所用配方為豆油8wt%，黃豆餅粉2. 5wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸鎂O. 08wt%,磷酸氫二鉀O. 02wt%，氯化鈉O. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。在28°C下培養144小時，發酵單位為6870u/ml。實施例5
按照實施例2的方法發酵生產海南霉素鈉，不同的是種子培養時，按60ml種子液接種O. 2ml孢子懸浮液的比例接種種子培養基,最終發酵單位為4876u/ml。
權利要求
1.一種海南霉素的發酵方法，其特征是以稠李東方鏈霉菌(Streptomyces padanusvar. dangfangeusls) SDSL-HNl 109 CGMCC NO. 5308為菌種進行發酵制備，包括以下步驟 (1)將冷藏的稠李東方鏈霉菌(Streptomycespadanus var. dangfangeusls)SDSL-HNl 109 CGMCC NO. 5308沙土孢子接種到斜面培養基上，在28°C下培養7天； (2)用無菌水洗下步驟(I)斜面培養所得的孢子，加入甘油配成孢子懸浮液，在-70°C _80°C下保存備用； (3)將孢子懸浮液0.2ml接種到45-60ml種子培養基中，在28°C培養40 42小時，得種子液； (4)將種子液按照10 20%的接種量接種到發酵培養基中，在28°C培養90 144小時，得發酵液。
2.根據權利要求I所述的發酵方法，其特征是稠李東方鏈霉菌(Streptomycespadanus var. dangfangeusls)沙土孢子的制備方法是將菌種進行斜面培養，用接種針將所得孢子刮下，送入滅菌的沙土管中，攪動沙土，使粘附在接種針上的孢子與沙土充分混合，塞緊棉塞，敲松沙土，將沙土管放入真空干燥器內，常溫下保持真空度0. 08 0. IMpa連續抽干40 60分鐘，然后敲松沙土，將沙土管放入盛有變色硅膠的干燥器中，置于0 8°C冰箱中保臧備用。
3.根據權利要求I所述的發酵方法，其特征是，斜面培養基組分包括玉米淀粉I.0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐0. 8wt%,氯化鈉0. 3wt%,黃豆餅粉0. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨0. lwt%，硫酸鎂0. 05wt%，磷酸氫二鉀0. 02wt%，瓊脂2. 0wt%，飲用水余量。
4.根據權利要求3所述的發酵方法，其特征是斜面培養基在配制時，玉米淀粉在70 80°C糊化10分鐘再與其他成分混合。
5.根據權利要求I所述的發酵方法，其特征是，種子培養基組分包括玉米淀粉I.0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐0. 8wt%,氯化鈉0. 3wt%,黃豆餅粉0. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨0. lwt%，硫酸鎂0. 05wt%，磷酸氫二鉀0. 02wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。
6.根據權利要求I所述的發酵方法，其特征是，發酵培養基組分包括豆油6 10wt%，黃豆餅粉2. 0 3. 0wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐0. 5wt%,酵母粉0. 5wt%,硫酸鎂0. 08wt%,磷酸氫二鉀0. 02wt%,氯化鈉0. 2 wt%，飲用水余量，pH7. 4 7. 9。
7.根據權利要求I所述的發酵方法，其特征是制得的孢子懸浮液中，每毫升孢子懸浮液含有I X IO8 I X 101°個孢子。
8.根據權利要求I所述的發酵方法，其特征是步驟(2)中，甘油的濃度為20wt%，甘油與無菌水的體積比為1:1。
9.根據權利要求I所述的發酵方法，其特征是步驟(3)中，孢子懸浮液0.2ml接種到50ml種子培養基中。
全文摘要
本發明公開了一種海南霉素的發酵方法，步驟為將冷藏的稠李東方鏈霉菌SDSL-HN1109沙土孢子接種到斜面培養基上，28℃培養7天；洗下斜面培養所得的孢子，加入甘油配成孢子懸浮液，在-70℃～-80℃下保存備用；將孢子懸浮液0.2ml接種到45-60ml種子培養基中，28℃培養40～42小時，得種子液；將種子液按照10～20%的接種量接種到發酵培養基中，28℃培養90～144小時，得發酵液。本發明利用高產量的稠李東方鏈霉菌變異菌株制備海南霉素，發酵結果穩定，重復性好，產量高。此外，在制備發酵種子時僅需要一次斜面培養，保證了菌種的純度，避免了菌種污染，簡化了操作。
文檔編號C12R1/465GK102634553SQ20121006496
公開日2012年8月15日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者劉寧, 張旭, 李承鈺, 王煒, 趙碩珍, 馬景武 申請人:山東勝利股份有限公司