專利名稱：靶向GPMV NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種靶向GPMV NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備，特別是涉及一種靶向鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備方法，屬于ー種新的抗 病育種方法，應用于禽類動物疫病防治領域。
背景技術：
新城疫是由I型禽副粘病毒引起的雞和火雞急性高度接觸性傳染病，是危害養禽業最重要的傳染病之一。傳統理論認為“雞、火雞、珠雞及野雞對新城疫有易感性；而水禽不能自然感染新城疫”。但是自1997年在我國多個縣市的鵝群中發生和流行ー種具有高度發病率和死亡率的鵝傳染病。該病是以消化系統發生病變為主要的臨床癥狀和病變特征的傳染病，經過流行病學分析并通過對分離毒株的生物學和分子生物學特性鑒定，確定為血清I型副粘病毒，也就是新城疫病毒，并定名為鵝副粘病毒病。扭轉了曾經認為新城疫僅侵害雞，水禽即使以強毒感染也不致病的傳統理論。目前，鵝副粘病毒病已經成為現代集約化養鵝業的主要疫病之一。在我國鵝副粘病毒病發生和流行十分嚴重，毎年的經濟損失很大，嚴重威脅著我國養鵝業的健康發展。且目前尚未發現對GPMV有特效的藥物，GPMV防制必須以預防為主，有計劃地做好鵝群的免疫監測和疫苗接種工作是防制本病發生和流行的重要措施。盡管有多種強毒疫苗和滅活疫苗用于免疫預防，但是仍然不能控制鵝副粘病毒病的發生。同時在我國還未見有分離出或研究鵝源副粘病毒弱毒株病毒的報道。目前研究結果均表明，利用新城疫病毒強毒苗或滅活苗甚至是傳統的Lasota弱毒疫苗來免疫預防鵝源副粘病毒病不能起到完全免疫保護作用。因此，對于鵝源副粘病毒我們須尋求ー種新的預防思路和技術手段。傳統分子抗病育種工作進展緩慢目前畜禽抗病育種的方法主要有三種(1)傳統的育種方法-基于表型性狀進行直接或間接選擇；(2)利用DNA多態標記進行標記輔助選擇(Marker assisted selection, MAS)(3)在獲得抗病基因的基礎上進行轉基因抗病育種。遺傳抗病性主要是由免疫系統控制的多基因性狀，由于影響動物個體抗病性的基因相當復雜，到目前為止，定位和克隆抗病相關的DNA標記或主效基因的成功報道寥寥無幾。因此依靠DNA標記進行輔助選擇和通過制備轉抗病基因的轉基因動物來進行分子抗病育種的エ作進展非常緩慢。慢病毒載體介導RNAi的轉基因動物方面的研究，慢病毒載體介導在建立轉基因動物模型和哺乳動物基因組改造方面，已經成為很有發展前景的ー種新方法。雖然傳統的顯微注射轉基因方法已經成功的培育出成活的轉基因動物個體，但是其轉基因效率相對較低，所以有待我們進一歩探尋能夠提高轉基因效率的方法。慢病毒載體介導的轉基因方法與傳統方法相比，能夠將外源基因高效整合到宿主細胞基因組當中，特別是未分裂的細胞，其介導的外源基因能夠長期穩定的表達，從而可以提高轉基因效率。慢病毒載體與SiRNA技術結合抑制特異基因的表達制備轉基因動物，對于改良畜牧動物生長性狀、提高飼料利用率和抗病能力等都有重要價值。二者結合使用可能成為制備抗病毒動物的有用方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種靶向GPMV NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備，該方法容易操作，可獲得滴度較高的重組慢病毒顆粒，且該重組病毒即可感染分裂期細胞，也可感染非分裂期細胞，由該重組慢病毒顆粒介導的RNAi可在不同細胞系中持續穩定的表 達。本發明的技術方案是這樣實現的靶向GPMV NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備，其特征在于首先分別設計針對鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因的SiRNA干擾序列，然后將其與酶切后的慢病毒載體連接，經PCR和測序鑒定；將鑒定正確的重組慢病毒載體質粒與其他2個慢病毒包裝系統中的輔助質粒共轉染293T細胞，進行重組慢病毒的包裝；包裝后測定該重組慢病毒的滴度；將滴度較高的重組慢病毒感染293T細胞或veix)細胞，48h后觀察熒光蛋白表達情況，并通過PCR方法鑒定，具體步驟如下
1.針對鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因RNAi靶位的設計
根據GeneBank上GPMV NA-I株NP、M基因序列及Ambion公司網站設計siRNA干擾 序列，設計結果見表I
2.shRNA序列與pLKD-EGFP載體連接，轉化及鑒定
siRNA上下游序列退火后形成shRNA，將其與酶切線性化的pLKD-EGFP載體4°C連接過夜，將連接產物轉化入DH5a感受態細胞中，挑去菌落，應用OMEGA質粒提取試劑盒提取質粒，通過PCR及測序鑒定結果顯示該重組慢病毒重組載體構建成功分別命名為pLKD-shNPl、pLKD-shNP2、pLKD-shNP3、pLKD-shMl、 pLKD_shM2 、pLKD_shM3 、pLKD_shC0N。結果如圖1、2
3.慢病毒包裝及其滴度測定
將構建成功的慢病毒重組載體與慢病毒包裝系統中2個輔助質粒(pCMV-dR8. 2和pCMV-VSV-G)共轉染293T細胞，進行重組慢病毒的包裝。包裝后，超速離心將重組慢病毒進行濃縮并測定其滴度，結果如圖3
4.重組慢病毒感染細胞檢測
將重組慢病毒感染veix)細胞，48h后觀察熒光蛋白表達情況，并提取細胞基因組 DNA,通過PCR方法檢測EGFP基因序列。本發明的積極效果是可為禽類動物分子抗病育種奠定分子生物學基礎；同時為新城疫等動物源性病毒病的防治提供新的途徑，其具有深遠的研究性和廣泛的應用性。
圖I為重組慢病毒載體PCR鑒定結果。圖2為重組慢病毒載體測序結果。圖3為重組慢病毒滴度測定結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做詳細說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規方法。實施例I RNAi靶位的設計及shRNA慢病毒載體的構建
應用Ambion公司的siRNA在線設計軟件和設計原則，對GPMV NA-I株NP、M基因進行RNAi靶位篩選，同時將得到的靶位序列在GenBank中進行BLAST分析；將靶位siRNA寡核苷酸序列送上海生工合成，合成的寡核苷酸序列退火形成雙鏈，與經內切酶Age I和EcoR I雙酶切后線性化的pLKD-EGFP載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5a，挑取重組陽性克隆進行PCR及測序鑒定(上海生エ公司進行測序分析)，產生pLKD-shNP、pLKD-shM慢病毒載體。PCR 鑒定陽性克隆的引物序列F :5’ -AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTG-3’，
R :5’ -TGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCT- 3’，PCR 反應循環條件94°C預變性 2 min ；94°C變性 30s，59°C退火 30s，72°C延伸 30s (30 個 cycles);最后 72°C延伸 10 min。實施例2慢病毒包裝
轉染前24h，將處于對數生長期的293T細胞用O. 25%胰蛋白酶消化，并細胞計數，將細胞密度調整為5X IO6個/ml，重新接種于T75的細胞培養瓶，當細胞密度達到70%_80%時進行轉染。將慢病毒包裝系統中質粒的DNA溶液pLKD-shNP或pLKD-shM :9Pg ;pCMV-dR8. 2 :6. 75μδ和pCMV-VSV-G :2. 25Pg加入到500μ1無雙抗，無血清的DMEM培養液與54μ I,混合均勻，在室溫下溫育20min。將DNA與FuGENG HD轉染試劑混合液轉移至293T細胞的培養液中混勻，于37°C、5% C02細胞培養箱中培養，培養6h后棄去含有轉染混和物的培養基，每個培養皿中加入含10% FBS血清的細胞培養基12ml，于37°C、5% C02培養箱內繼續培養48 h。收集轉染48 h后的293T細胞上清液。于4°C，4，000r/m離心10 min，除去細胞碎片。以O. 45ΜΠ1濾器過濾上清液于超速離心管中，4°C，50000r/m離心。然后將病毒沉淀用小體積雙無DMEM重懸，分裝后-80°C長期保存。實施例3 LaSRT法測定慢病毒滴度
293T細胞以2X IO4/孔接種于96孔培養板，12h后以8孔為I組，更換成含8 μδ/πι1的Polybrene和10% FBS的DMEM培養液，90μ1/孔。第一孔中加入待測慢病毒原液ΙΟμΙ，此后每孔依次10 I倍比稀釋，設立并測定3組復孔。感染48h后，以濃度自高到低的方向，在熒光倒置顯微鏡下觀察各孔GFP陽性細胞數量的變化，確定計量孔(第η孔)，并計數陽性細胞數m，病毒滴度(TU/ml)=mX10n+1。實施例4重組慢病毒感染細胞檢測
將重組慢病毒感染細胞48h后觀察熒光蛋白表達情況，并提取感染后細胞的基因組，以 IyL (50 IOOng)細胞基因組 DNA 為模板，2 X Taq Mix 12. 5μ L (含 Mg2+、25mM dNTPs,Taq酶)，上下游引物以EGFP序列設計，EGFP-Pl:
5' -CGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3';EGFP-P2:5'-CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTC-3' 為引物)各 O. 5yL (lOpmol/μ L)，加 ddH20 10. 5 μ L，總體系 25 μ し反應條件95 °C預變性5 min后，94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 S，30個循環，最后72°C延伸
5min, 4°C保存。PCR擴增獲得EGFP基因片段，取PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
權利要求
1.一種靶向鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因ShRNA的重組慢病毒的制備方法，其特征在于首先分別設計針對鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因的SiRNA干擾序列，然后將其連接到酶切后的慢病毒載體的多克隆位點處，經PCR和測序鑒定；將鑒定正確的重組慢病毒載體質粒與其他2個慢病毒包裝系統中的輔助質粒共轉染293T細胞，進行重組慢病毒的包裝；包裝后測定該重組慢病毒的滴度；將滴度較高的重組慢病毒感染293T細胞或vero細胞，48h后觀察熒光蛋白表達情況，并通過PCR方法鑒定，具體步驟如下 1)根據GeneBank上GPMVNA-I株NP、M基因序列及Ambion公司網站設計siRNA干擾序列； 2)shRNA序列與pLKD-EGFP載體連接，轉化，挑去菌落，應用OMEGA質粒提取試劑盒提取質粒，通過PCR及測序鑒定結果顯示該重組慢病毒重組載體構建成功； 3)慢病毒包裝及其滴度測定； 4)將重組慢病毒感染veix)細胞，48h后觀察熒光蛋白表達情況，并提取細胞基因組DNA,通過PCR方法檢測EGFP基因序列。
2.根據權利要求I所述的一種靶向鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備方法，其特征在于所設計的特異性siRNA序列，與含有禽U6啟動子的自身復制缺陷型慢病毒表達載體pLKD-EGFP構建成重組載體pLKD-EGFP-shNP/M。
3.根據權利要求2所述的一種靶向鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備方法，其特征在于重組慢病毒載體的構建方法如下 1)特異性siRNA靶序列選擇及設計合成； 2)將合成的寡核苷酸siRNA序列退火形成雙鏈，與經內切酶AgeI和EcoR I雙酶切后線性化的pLKD-EGFP載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5a，挑取重組陽性克隆進行PCR及測序鑒定。
全文摘要
本發明是一種利用慢病毒載體介導RNAi的方法，具體是先對鵝源副粘病毒NA-1株NP、M基因的核酸序列進行同源性分析，找出保守區域，設計出針對保守區的siRNA；將siRNA克隆到慢病毒表達質粒pLKD-EGFP后，再與pCMV-dR8.2和pCMV-VSV-G共同轉染293T細胞中，收集轉染后細胞上清，經超速離心、純化、濃縮后形成了表達siRNA的高滴度的慢病毒載體，然后將其轉導入靶細胞，使其在細胞內穩定表達，發揮抗病毒效應。本發明因其高效的轉導率及嚴格的控制體系可以真實的評價siRNA在體內的抗病毒作用，可為禽類動物分子抗病育種奠定分子生物學基礎；同時為新城疫等動物源性病毒病的防治提供新的途徑。
文檔編號C12N15/867GK102618581SQ201210069488
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者丁壯, 叢彥龍, 黨源, 姜翠翠, 朱利塞, 李想, 楊建新, 王澤 , 郭育培, 韓明明 申請人:吉林大學