專利名稱：一種二點委夜蛾的分子鑒定方法
技術領域：
本發明涉及昆蟲種類鑒定的DNA序列，具體涉及玉米新害蟲ニ點委夜蛾的DNA序列及其分子鑒定方法。
背景技術：
ニ點委夜蛾\_Athetis lepigone (Moschler, 1860)]是我國夏玉米產區新發生的一種農業害蟲。據有關資料記載，國內最早于2005年7月在河北省石家莊地區發現ニ點委夜蛾危害夏玉米苗，鉆蛀莖基部，導致幼苗枯心萎蔫死亡，或咬斷玉米根，導致倒伏，造成嚴重的缺苗斷壟，這在國內屬于首次報道。據報道，2010年ニ點委夜蛾在河北省中南部夏玉米區普遍發生，2011年在河北、河南、山東、山西、安徽、江蘇等省暴發，發生面積達3000多萬畝，少數地塊補種或毀種，是近年玉米生產中少見的嚴重蟲害。由于ニ點委夜蛾是近幾年才引起人們關注的新發生害蟲，對該害蟲的認識還不夠，在發生較輕的地方，人們不會注意觀察，就認為是地老虎，根本意識不到這是ー種新害蟲，而在發生嚴重地區，農業技術人員和農民經過仔細觀察，還常會把它誤認為是地老虎， 延誤或使用了不當的防治措施，給生產造成損失，針對于此，在已有的形態特征描述的基礎上，本發明的目的就是要提供一種ニ點委夜蛾的基因片段，用于ニ點委夜蛾的準確鑒定。生物體的線粒體基因組(mtDNA)嚴格遵守母系遺傳，幾乎不發生遺傳重組，能夠全面反映種群內和種群間的遺傳變異，且其結構簡單，進化速率快，因而被廣泛應用于探索種群結構和遺傳多樣性的研究(Norgate et al.，2009)。其中細胞色素氧化酶C亞基(C0I) 基因在脊椎動物和無脊椎動物種類鑒別、群體遺傳多祥性和分子系統進化學等研究方面均得到廣泛應用(Novo et al.，2010 ； Feng et al.，2011 ；Xu et al.，2011XC0I 基因能夠用于研究昆蟲各類群系統發育關系和進化以及驗證傳統分類系統，建立物種的自然系統和進化關系，有助于物種的區別鑒定、發現隱存種、研究物種分化和遺傳多祥性(梁日霞等， 2011 ;池宇等，2010 ;楊寶山等，2009 ；Collet et al.，2006)。
發明內容
本發明的目的就是針對實際生產中容易把ニ點委夜蛾與地老虎混淆，提供ー種ニ 點委夜蛾的基因片段，用于ニ點委夜蛾的準確鑒定。本發明提供一種ニ點委夜蛾COI基因的DNA序列，其包含如下SEQ ID NO: I所示的序列(GenBank登錄號JQ395055)或與SEQ ID NO: I所示序列具有至少99%序列同一性的序列。本發明還提供一種ニ點委夜蛾種類的分子鑒定方法，其特征在于包括如下步驟
(1)收集昆蟲樣本采集的樣品放于95%こ醇中，一20°C保存；
(2)基因組DNA的提取按照動物組織/細胞基因組快速提取試劑盒提取昆蟲基因組 DNA，保存于-20°C備用；(3)COI基因的擴增、克隆、測序及序列分析，其中COI基因序列的PCR擴增引物上游引物 / 下游引物 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3/5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ；
(4)測序結果表明ZBl ZB17為ニ點委夜蛾不同單倍型，與ZBl(JQ395055)相似度均達到99%以上。在本發明的分子鑒定方法中，COI基因擴增的具體步驟為
20 ii L的PCR反應體系PCR擴增總反應體系為20iiL，其中模板DNA 2. Oy L、上下游引物各 I U L(濃度 IOii M) UOXPCR buffer 2. Ou L.dNTP I. 6u L (2. 5 mM)、酶 0. 3U、超純水補足；
反應程序:94°C、5min ；35 個循環(94°C、45s，54°C、45s，72°C、lmin);72°C延伸 5min ;用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的條帶。在本發明的分子鑒定方法中，按照TaKaRa試劑盒上的步驟把切膠回收的PCR產物與PMD19-T載體連接，把陽性克隆的菌液測序。在本發明的分子鑒定方法中，先利用Sequencher_v4. I. 4軟件讀取測序的序列， 觀察峰值進行反復校對，利用DNAMAN_v6、ClustalXl. 81軟件對測得的序列與JQ395055 所示的序列進行多序列同源比對；此外，根據MEGA5. 05建樹模型，以夜蛾科的小地老虎 (Agrotis ipsilon)C0I基因做為外群,用鄰近法構建單倍型系統樹,并利用/7-distance計算各單倍型之間的遺傳距離；結果表明與JQ395055相似度高達99%以上的即可認為該昆蟲為ニ點委夜蛾。本發明還涉及將上述分子鑒定方法用于快速區分鑒別ニ點委夜蛾的用途。本發明還涉及ー種用于鑒定ニ點委夜蛾種類的引物，其特征在于序列為5_GGTCA ACAAATCATAAAGATATTGG-3/5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAATCA-3。本發明還涉及包含上述引物的試劑盒。本發明的有益效果是被檢測昆蟲的COI基因序列與本發明提供的序列進行比對，可以快速準確的判斷該昆蟲是否為ニ點委夜蛾，為田間實施對應的有效防治措施提供依據。附核苷酸序列說明
序列表SEQ ID NO: I.本發明分離克隆的ニ點委夜蛾COI基因片段的序列。
圖I :實例一，河北、河南、山東、山西四省13市縣ニ點委夜蛾不同種群COI不同單倍型的(N-J)進化樹；
圖2 :實例ニ，河北6市縣ニ點委夜蛾不同種群COI不同單倍型的(N-J)進化樹。
具體實施例方式實施例I
I.收集昆蟲樣本
8月中、上旬ニ點委夜蛾盛發期，分別于河北、河南、山東、山西四省13個市縣的燈誘成蟲，經成蟲典型特征確保所采樣品為ニ點委夜蛾，然后放于95%こ醇中，一 20°C保存。表I ニ點委夜蛾種群樣本的米集信息
Table I Collecting data and individual number of Athelis lepigone
權利要求
1.一種ニ點委夜蛾種類的分子鑒定方法，其特征在于包括如下步驟(1)收集昆蟲樣本采集的樣品放于95%こ醇中，一20°C保存；(2)基因組DNA的提取按照動物組織/細胞基因組快速提取試劑盒提取昆蟲基因組 DNA，保存于-20°C備用；(3)COI基因的擴增、克隆、測序及序列分析，其中COI基因序列的PCR擴增引物上游引物 / 下游引物 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3/5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ；(4)測序結果表明ZBl ZB17為ニ點委夜蛾不同單倍型，與ZBl(JQ395055)相似度均達到99%以上。
2.根據權利要求I所述的ニ點委夜蛾種類的分子鑒定方法，其特征在于COI基因擴增的具體步驟為20 ii L的PCR反應體系PCR擴增總反應體系為20iiL，其中模板DNA 2. Oy L、上下游引物各 I UL(濃度 10 uM) UOXPCR buffer 2. Ou L.dNTP I. 6u L (2. 5 mM)、酶 0. 3U、超純水補足；反應程序:94°C、5min ；35 個循環(94°C、45s，54°C、45s，72°C、lmin);72°C延伸 5min ;用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的條帶。
3.根據權利要求2所述的ニ點委夜蛾種類的分子鑒定方法，其特征在于按照TaKaRa試劑盒上的步驟把切膠回收的PCR產物與PMD19-T載體連接，把陽性克隆的菌液測序。
4.根據權利要求3所述的ニ點委夜蛾種類的分子鑒定方法，其特征在于先利用Sequencher_v4. I. 4軟件讀取測序的序列，觀察峰值進行反復校對，利用 DNAMAN_v6、ClustalXl. 81軟件對測得的序列與JQ395055所示的序列進行多序列同源比對；此外，根據MEGA5. 05建樹模型，以夜蛾科的小地老虎(Agrotis ipsilon) COI基因做為外群，用鄰近法構建單倍型系統樹，并利用/^distance計算各單倍型之間的遺傳距離；結果表明與JQ395055相似度高達99%以上的即可認為該昆蟲為ニ點委夜蛾。
5.將權利要求I所述的方法用于快速區分鑒別ニ點委夜蛾的用途。
6.一種用于鑒定ニ點委夜蛾種類的引物，其特征在于序列為5-GGTCAACAAATCATAAAG ATATTGG-3/5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAATCA-3。
7.將權利要求5所述的引物用于鑒定ニ點委夜蛾種類的用途。
8.—種包含權利要求5所述引物的試劑盒。
全文摘要
本發明涉及昆蟲種類鑒定的DNA序列，具體涉及玉米新害蟲二點委夜蛾的DNA序列及其分子鑒定方法。本發明提供一種二點委夜蛾COI基因的DNA序列，其包含如下SEQIDNO:1所示的序列或與SEQIDNO:1所示序列具有至少99%序列同一性的序列本發明的效果在于，被檢測昆蟲的COI基因序列與本發明提供的序列進行比對，可以快速準確的判斷該昆蟲是否為二點委夜蛾，為田間實施對應的有效防治措施提供依據。
文檔編號C12Q1/68GK102605093SQ20121010125
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月10日 優先權日2012年4月10日
發明者劉磊, 朱彥彬, 李志勇, 李立濤, 白輝, 董志平, 董立, 馬繼芳 申請人:董志平