專利名稱：一種改進的clip法鑒定rna結合蛋白的靶標rna的方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學及細胞生物學領域，涉及對細胞內RNA結合蛋白所結合的靶標RNA基序的鑒定。更準確地說，本發明是對一項已發表的紫外交聯-免疫共沉淀偶聯實驗技術的改良與優化。
背景技術：
RNA結合蛋白是生物體內一大類十分重要的蛋白，具有廣泛的生物學功能。許多RNA結合蛋白被發現與眾多人類的疾病有關，例如自身免疫疾病和神經性疾病。要理解這些RNA結合蛋白在正常和非正常細胞中所發揮的作用就需要首先鑒定出它們在體內所結合的靶標RNA所處的位置以及這些靶標RNA的基序。過去鑒定這些靶標RNA常用的手段主要是通過體外指數富集配基的系統進化技術(SELEX, Singh R, Valcarcel J, GreenMR 1995 Distinct binding specificities and functions of higher eukaryoticpolypyrimidine tract-binding proteins. Science 268(5214) :1173-1176);結合體內免疫共沉淀獲得RNA-蛋白質復合物偶聯基因芯片分析的技術(Buckanovich RJ,Darnell RB1997 The neuronal RNA binding protein Nova-I recognizes specific RNA targetsin vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 17(6)3194-3201 ；Tenenbaum SA，Carson CC,Lager PJ，Keene JD 2000 Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoproteincomplexes by using cDNA arrays. PNAS 97 (26) 14085-14090 ； Jensen KB, Dredge BK，Stefani G， Zhong R， Buckanovich RJ, Okano HJ, Yang Yolanda YL, Darnell RB 2000Nova—I regulates neuron-specific alternative splicing and is essential forneuronal viability. Neuron 25 359—371 ；Darnell JC，Jensen KB,Jin P,Brown V,WarrenST，Darnell RB 2001 Fragile X mental retardation protein targets G quartet mRNAsimportant for neuronal function.Cell 107 489-499 ；Brown V,Jin P,Ceman S,DarnellJC, 0’ Donnell WT, Tenenbaum SA, Jin X，Feng Y，Wilkinson KD, Keene JD, Darnell RB，Warren ST 2001 Microarray identification of FMRP—associated brain mRNAs andaltered mRNA translational profiles in fragile X syndrome Cell. 107(4)477-487)。但這些手段存在很重要的缺陷，例如信噪比很低，無法區分RNA和蛋白質是直接相互作用還是間接相互作用，以及無法知道蛋白質所結合的RNA的具體區域等。紫外交聯-免疫共沉淀技術(UVCrosslinking-Immunopricipitation, CLIP)是一種自2003年起興起的實驗技術，由美國洛克菲勒大學的Darnell教授實驗室首先發明(Ule J, Jensen KB, Ruggiu M, Mele A, Ule A, Darnell RB 2003 CLIP identifiesNOVA-regulated RNA networks in the brain. Science 302(5648) 1212-1215)。該方法首先用365nm波長的紫外光照射組織或細胞，使組織或細胞中的直接相互作用的蛋白質和RNA之間形成共價鍵(得到蛋白-RNA復合物)，而RNA與RNA之間此時則不會形成共價鍵。因為只有直接相互作用的蛋白質與RNA(距離在A以內)在這種條件下才能交聯形成共價鍵，所以排除了間接相互作用。另外由于形成了共價鍵，蛋白-RNA復合物可以承受后續步驟中更嚴格的處理，如在SDS-PAGE電泳中的分離，轉膜等。而且由于蛋白交聯結合的保護，還可以對樣品作部分的核酸酶降解處理進而得到被RNA結合蛋白保護的核心片段，這些片段通常為30-100個堿基的RNA標簽序列(RNA tag)。該實驗技術結合最近興起的第二代高通量測序技術(The Second-Generation DNA Sequencing),成功鑒定了多種RNA結合蛋白體內結合的靶標RNA的基序以及在基因組中的分布(Yeo Gff, Coufal NG, LiangTY, Peng GE，Fu XD, Gage FH 2009 An RNA code for the F0X2 splicing regulatorrevealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat. Struct. Mol.Biol. 16(2) 130-137 ；Xue YC，Zhou Y，Wu TB，Zhu T，Ji X，Kwon YS，Zhang C，Yeo G，Black DL,Sun H，Fu XD，Zhang Y 2009 Genome-wide analysis of PTB-RNA interactionsreveals a strategy used by the general splicing repressor to modulate exoninclusion or skipping. Mol. Cell. 36 (6) 996-1006 ;iCLIP，Koenig J，Zarnack K，Rot G， Curk T，Kayikci M，Zupan B，Turner DJ, Luscombe NM, Ule J 2010 iCLIP reveals thefunction of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.Nat. Struct. Mol. Biol. 17(7)909-915 ；Licatalosi DD, Mele A，Fak JJ, Ule J，KayikciM，Chi SW, Clark TA，Schweitzer AC，Blume JE, Wang X，Darnell JC, Darnell RB 2008HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processingNature. 456(7221)464-469)。鑒于CLIP技術的強大功能，在最初基礎之上作出改進的CLIP方法近兩年也開始陸續被報道，例如光可激活核苷酸增強紫外交聯-免疫共沉淀技術(PAR-CLIP，HafnerM, Landthaler M, Burger L, Khorshild M, Hausser J, Berninger P, Rothballer A,Ascano Jr. M, Jungkamp AC, Munschauer M, Ulrich A, Wardle GS, Dewell S, ZavolanM, Tuschl T 2010 Transcriptome-wide identification of RNA binding proteinand microRNA target sites by PAR-CLIP Cell. 141 (I) 129-141)和單喊基分辨率紫外交聯 _ 免疫共沉淀技術(iCLIP, Koenig J, Zarnack K, Rot G, Curk T, Kayikci M,Zupan B, Turner DJ, Luscombe NM, Ule J 2010 iCLIP reveals the function of hnRNPparticles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat. Struct.Mol.Biol. 17 (7) 909-915)，這些改進的CLIP技術有效地提高了該方法捕獲靶標RNA的效率，或提聞了鑒定祀標RNA序列的分辨率。目前對于蛋白-RNA復合物進行處理都是用RNase Tl或RNase A做RNA的部分酶，然而本發明發現RNase A和RNase Tl會很大程度影響下游實驗，使得目標RNA降解。此夕卜，已發表的CLIP實驗方案中在部分降解RNA后都是先給靶標RNA 3’端連接RNA linker,而當RNA結合蛋白本身在3’ RNA附近與其他蛋白形成復合物時，此時形成的空間位阻會使3’ linker難以被連接上(圖I)。
發明內容
本發明的目的在于針對上述不足提供一種改進的紫外交聯-免疫共沉淀方法，用于靶標RNA的鑒定。針對現有技術中CLIP都是用RNase Tl或RNase A做RNA的部分酶解，造成對下游實驗影響的問題，本發明采用微球菌核酸酶(micrococcal nuclease)來替代RNase A和RNaseTl，因為微球菌核酸酶的酶切活性依賴于Ca2+，酶切反應后加入含有EGTA緩沖液螯合掉溶液中的Ca2+，就可以讓微球菌核酸酶完全失活，不影響下游實驗。故，本發明首先提供微球菌核酸酶在紫外交聯-免疫共沉淀中的用途。針對現有技術中CLIP在部分降解RNA后都是先給靶標RNA 3’端連接RNA linker可能會形成空間位阻致使3’ linker難以被連接上的問題，本發明改用先連接5’ RNAlinker再連接3’ RNA linker來解決該問題。本發明首先提供一種紫外交聯-免疫共沉淀獲得RNA結合蛋白的靶標RNA方法，其包括使用微球菌核酸酶對紫外交聯后的靶標RNA作不完全酶解。在酶解結束后使該核酸酶失活，具體可以使用能去除Ca2+離子的螯合劑使該酶失活，這種螯合劑可以是單一型的 也可以是組合型的。進一步本發明提供對紫外交聯-免疫共沉淀獲取的RNA結合蛋白的靶標RNA進行cDNA合成的方法包括將上述方法獲得的靶標RNA 5’末端磷酸化并連接5’ RNA接頭，之后對連接產物去磷酸化、分離和回收，之后連接3’ RNA接頭，并進行RT-PCR擴增，獲得靶標RNA相應的cDNA文庫。具體地，將樣品經紫外交聯后用微球菌核酸酶對靶標RNA作不完全酶解，酶解后使用能去除Ca2+離子的螯合劑使該酶失活，使靶標RNA 5’末端磷酸化并連接5’ RNA接頭，去磷酸化后進行SDS-PAGE分離，轉膜，回收連接有5’ RNA接頭的游離靶標RNA,連接3’ RNA接頭，并進行RT-PCR，獲得靶標RNA相應的cDNA文庫。上述5’ RNA接頭的5’端具有保護基團，以避免接頭分子相互之間的連接，例如連接生物素進行封閉保護。類似的，3’ RNA接頭的3’端也具有保護基團，例如連接嘌呤霉素進行封閉保護。上述5’ RNA接頭及3’ RNA接頭在設計時應考慮到后續的RT-PCR擴增，符合測序引物的相關設計要求即可。本發明提供的一種改進的CLIP法法鑒定RNA結合蛋白的靶標RNA的方法，其包括按照上述方法進行cDNA合成，獲得靶標RNA相應的cDNA文庫，并對cDNA文庫進行高通量測序，并根據測序結果進行基因定位。更具體地，本發明采用如下技術方案I)收集組織或對數生長期的細胞，在紫外交聯儀內置冰上以400mj/cm2的能量照射；2)對收集到的細胞用裂解緩沖液在冰上裂解，加入無RNAase的DNA酶消解染色質DNA，然后用偶聯有特異性單抗的磁珠純化出蛋白-RNA復合物；3)利用微球菌核酶(micrococal nuclease)對蛋白-RNA復合物進行片斷化,通過控制酶的濃度及反應時間使得靶標mRNA大小在30-60nt之間；4)以a -32P-ATP標記靶標RNA 5’端，之后進行5’端的linker連接；5)靶標RNA連接5 ’端I inker之后，對靶標RNA去磷酸化，以SDS-PAGE膠分離，轉膜后，從膜上切下對應大小的目標蛋白-RNA復合物條帶后，用蛋白酶K進行消解、酚氯仿抽提而后酒精沉淀得到連接有5’ linker的自由的靶標RNA ；6)再連接3’linker，然后進行RT-PCR、連T載體、克隆，少量樣品作低通量的常規測序檢測；7)低通量測序檢測樣品序列和分布正確后，再進行高通量測序(如采用SolexaIG genome analyzer 測序)；8)對得到的RNA標簽(tag)進行基因組定位、分析。本發明使用微球菌核酸酶作部分RNA消解，有效地減少了靶標RNA的降解；采用先連接5’RNA linker的方案，克服了可能存在的蛋白復合物在3’端形成的空間位阻，提高了CLIP技術的成功率。
圖I為蛋白質復合物可能對靶標RNA 3’末端造成空間位阻的原理圖；圖2為本發明改進的紫外交聯-免疫共沉淀(CLIP)流程圖；圖3為免疫共沉淀效率的檢測結果，圖中INPUT為細胞裂解液，Beads為偶聯抗體的A蛋白磁珠，SUP為免疫共沉淀后的上清，a U2AF65-IP表示磁珠偶聯的抗體為U2AF65的抗體，Ctrl-IP表示磁珠偶聯的抗體是鼠源IgG ； a ACTB是作為western雜交內參的@肌動蛋白；圖4為微球菌核酸酶對RNA的酶切結果；圖5 為 CLIP-PCR 的結果；圖6為高通量測序結果。
具體實施例方式以下結合實施例進一步具體說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。實施例I :RNA linker的設計與合成使用的linker序列與UCSD的Solexa測序儀匹配，序列為5’ linker 5’Biotin-AAU GAU ACG GCG ACC ACC GA 3’；3’linker :5’P04_UCG UAU GCC GUC UUC UGCUUG-Puromycino 5’linker的5’端生物素與3’linker 3’端的嘌呤霉素如前文所述起封閉linker末端防止首尾自連的作用。逆轉錄引物為3’linker的反向互補DNA序列即5’CAAGCA GAA GAC GGC ATA CGA，PCR 所用的正向引物為 5，AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA，反向引物即逆轉錄引物。實施例2 :紫外交聯及細胞裂解液的制備I)使用150mm細胞培養皿培養HeLa細胞，培養基用DMEM(Invitrogen)，待細胞豐度達到80%以上時棄去培養基，用IxPBS緩沖液漂洗2次后，再加入適量PBS緩沖液覆蓋過細胞表面；2)將培養皿置于冰上，放入HL-2000交聯儀(UVP)下部的抽屜中，使用400mj/cm2能量的254nm紫外線照射I到I. 5分鐘。而后取出培養皿，倒去PBS，加入15ml PBS，用細胞刮將細胞刮下；3)用移液器將所有細胞的PBS懸液吸入15ml離心管，4°C 4000rpm離心5分鐘，去上清。加入1.5ml PBS，用移液器吹起沉淀，轉入干凈的1.5ml離心管中(DEPC處理或者使用進口 RNase free的離心管)，再次4000rpm離心5分鐘，去上清，放入_80°C保存備用或者直接使用；4)向收集的細胞沉淀中加入600 U I洗脫緩沖液，吹打數下直至細胞沉淀全部重懸，置于冰上15-20分鐘，每隔5分鐘將細胞顛倒混勻；
5)向細胞裂解液中加入30iil RQl DNA酶(Promega)，30 RNA酶抑制劑(TaKaRa)混儀(Thermomixer, Eppendorf)上兩分鐘(IOOOrpmdT11C)；6)將離心管放冰上5分鐘。然后放入預冷4°C的冷凍離心機中10，OOOrpm離心20分鐘，再用移液器吸出上清，保留50 Ul用以Western檢測。洗脫緩沖液
權利要求
1.微球菌核酸酶在紫外交聯-免疫共沉淀技術中的應用。
2.一種紫外交聯-免疫共沉淀獲取RNA結合蛋白的靶標RNA方法，其包括使用微球菌核酸酶對紫外交聯后的靶標RNA作不完全酶解。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，其還包括在酶解后使用能去除Ca2+離子的螯合劑使該酶失活。
4.一種對紫外交聯-免疫共沉淀獲取的RNA結合蛋白的靶標RNA進行cDNA合成的方法，其包括對根據權利要求2或3所獲得的靶標RNA 5’末端磷酸化并連接5’ RNA接頭，之后對連接產物去磷酸化、分離和回收，之后連接3’ RNA接頭，并進行RT-PCR擴增，獲得靶標RNA相應的cDNA文庫。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步驟將樣品經紫外交聯后用微球菌核酸酶對靶標RNA作不完全酶解，酶解后使用能去除Ca2+離子的螯合劑使該酶失活，對靶標RNA 5’末端進行磷酸化并加上5’ RNA接頭，去磷酸化后進行SDS-PAGE分離，轉膜，回收連接有5’ RNA接頭的游離靶標RNA，連接3’ RNA接頭，并進行RT-PCR擴增獲得cDNA文庫。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述不完全酶解是將靶標RNA酶解至.30 — 60nt 之間。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述5’RNA接頭的5’端連接有封閉保護基團。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述3’RNA接頭的3’端連接有封閉保護基團。
9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述5’RNA接頭的5’端連接有生物素封閉保護。
10.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述3’RNA接頭的3’端連接有嘌呤霉素封閉保護。
11.一種鑒定RNA結合蛋白的靶標RNA的方法，其包括按照權利要求5 10任一項所述的方法進行cDNA合成，獲得靶標RNA相應的cDNA文庫，并對cDNA文庫進行高通量測序，并根據測序結果進行基因定位。
全文摘要
本發明公開了一種紫外交聯-免疫共沉淀法鑒定RNA結合蛋白的靶標RNA方法，該方法采用微球菌核酸酶(micrococcalnuclease)來替代RNaseA和RNaseT1來做不完全酶解，通過酶解結束后通過去除溶液中的鈣離子(Ca2+)即使該核酸酶完全失活。此外在酶解結束后采用先連接5’RNAlinker再連接3’RNAlinker的方式來給靶標RNA的兩端加上接頭。本發明使用微球菌核酸酶作部分RNA消解，有效地減少了靶標RNA的降解；采用先連接5’RNAlinker的方案，克服了可能存在的蛋白復合物在3’端形成的空間位阻，提高了CLIP技術的成功率。
文檔編號C12N15/10GK102628038SQ201210100749
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月9日 優先權日2012年4月9日
發明者付向東, 吳同彬, 張翼, 薛愿超, 邵長偉, 黃晨 申請人:武漢生命之美科技有限公司