一種提高m2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制備方法

一種提高m2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種提高M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白制備方法，具體的說，針對PKM2蛋白的特性，在蛋白表達時設計兩種不同形式的片段：A片段用于免疫，通過標簽GST連接PKM2特異序列多肽抗原，不但可提高蛋白的表達量，而且易于純化，明顯提高免疫效果；B片段群用于篩選，包括PKM2的9個獨特的氨基酸序列，減少非特異性抗體，提高篩選效率，可以用于篩選不同表位的抗體。通過這些不同特點的抗原，一方面提高蛋白的表達純化及免疫效果，另一方面用于篩選特異的高親和力抗體，提高單克隆抗體的制備效率。
【專利說明】一種提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制備方法
[0001]【技術領域】本發明涉及生物【技術領域】，具體地，涉及一種提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制備及抗體篩選的方法。
[0002]【背景技術】近年來腫瘤生物學技術的進展，發現許多新型的腫瘤診斷生物標志物。M2型丙酮酸脫氫酶激酶(PKM2)是目前腫瘤研究領域最為熱門的一個腫瘤生物標志物，它作為腫瘤細胞糖酵解代謝通路的關鍵酶，與腫瘤發生發展密切相關。它在正常組織中僅表達于肌肉和快速增生組織，在腫瘤組織顯著高表達，是許多腫瘤細胞共性的特征。丙酮酸激酶有四種亞型:PKM1、PKM2、PKL及PKR。PKMl主要表達于分化成熟的組織如肌肉和神經組織，PKM2主要表達于快速增生的細胞，如胚胎干細胞、正常快速增生細胞及腫瘤細胞等，PKL主要表達于肝臟、腎臟及結腸，PKR表達于紅細胞中。
[0003]結腸癌中PKM2的高表達，常隨著腫瘤細胞的脫落，可在糞便中被檢測到，因此可作為結腸癌的診斷生物標志物。以往對結腸癌的篩查和診斷，常通過糞便中的隱血試驗，然而隱血試驗由于取樣的誤差及飲食因素影響等，常導致較高的假陽性率和假陰性率。近幾年的臨床研究發現，糞便中的PKM2檢測可顯著提高結腸癌的診斷準確率，靈敏度達80 %，特異性達92%，因此將成為今后結腸癌的篩查和診斷的重要生物標志物。血液中PKM2的表達增加，提示有腫瘤的發生，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌等。此外，尿液中的PKM2增加，提示患有腎癌，這是第一個有希望作為腎癌的腫瘤生物標志物。綜上所述，PKM2是一個重要的腫瘤生物標志物，糞便中的PKM2檢測可幫助診斷結腸癌等胃腸道腫瘤，尿液中PKM2的檢測可輔助診斷腎癌，血液中PKM2的檢測可輔助診斷乳腺癌及肺癌等。
[0004]目前PKM2的檢測試劑盒僅德國的ScheB0.Biotech AG公司有生產相關診斷產品，主要有用于結腸癌篩選的檢測試劑盒及血清中PKM2的檢測試劑盒，其產品“免疫層析法快速檢測試劑盒”能在數分鐘內檢測糞便中的PKM2含量，現已用于各醫院的臨床檢測。此產品由于價格比較昂貴，若進口到國內在醫院中使用，其昂貴的價格普通病人難以承受，因此也不便在人群中推廣。`其它如Abcam等科研試劑公司提供的PKM2抗體，僅限于科研使用，價格昂貴，且無親和力、特異性和靈敏度較高的抗體用于臨床檢測。因此，我國必須開發具有自主知識產權的PKM2檢測試劑盒，降低試劑盒的成本，以便能在國內進行推廣和普及，使結腸癌等腫瘤能夠早期發現早期治療，提高腫瘤治療的有效率，能夠服務于人民群眾的健康事業。目前，PKM2的檢測試劑盒的開發主要有兩種方法:一是常用的酶聯免疫法(ELISA)檢測試劑盒，二是基于免疫層析法的快速檢測試劑盒。其相關產品均可用于臨床的檢測。因此，本申請的研究也開發兩種診斷試劑盒，分別為常規的酶聯免疫法檢測試劑盒和膠體金免疫層析法的快速檢測試劑盒。兩種類型的檢測試劑盒，從價格和便利性方面滿足臨床上不同的實際需求。
[0005]由于PKM2僅在氨基酸序列的389-433位與PKMl存在差異(見說明書附圖2)，因此需取這部分氨基酸進行作為抗原。而這特異的45個氨基酸序列，由于其片段較小，因此免疫原性較差。本申請的研究策略是將45個氨基酸的抗原序列連接在帶有GST標簽的pET24a載體上，促進蛋白的正確折疊，提供蛋白的得率及純化，同時有利于提高抗體的免疫原性，并且可作為初步的抗體篩選所用。在抗體的篩選階段，合成不同表位的肽段，用于篩選特異性和親和力高的抗體，用于后續的試劑盒開發。這樣的一種針對M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白制備方法，即克服了蛋白免疫原性差的弱點，也有利于目的蛋白的獲取和后續抗體的篩選，因此鑒于以上的技術背景，提出本發明方法。
[0006]
【發明內容】
本發明的目的就是提供一種能簡便、高效地進行PKM2蛋白在原核系統中的制備工藝。該發明使得PKM2蛋白的免疫原性增強，增加了抗PKM2蛋白抗體的多樣性。該發明簡單易行，適用于低分子量蛋白的表達、純化和抗體制備。同時，本發明合成PKM2的多種獨特的多肽序列，用于高特異性和高親和力抗體的篩選，減少非特異性抗體，提高抗體的篩選效率。
[0007]本發明的內容主要由兩部分組成:
[0008]1.構建pET24a-GST-PKM2_A的重組蛋白，用于動物的抗原免疫。本申請使用的pET24a載體，已經構建有帶有GST的標簽。PKM2-A片段的序列為:IYHLQLFEELRRLAPITSDPTEATAVGAVEASFKCCS GAIIVLTK。特異序列見說明書附圖1。
[0009]2.合成PKM2的表位篩選多肽組，序列分別為:l)Biotin-1YHLQLFEEL，2)Biotin-RRLAPITSDP,3)Biotin-TE ATAVGAVE,4)Biotin-ASFKCCSG,5)Biotin-AIIVLTK,6)Biotin-LFEELRRLAP,7)Biotin-1TSDPTEATA,8)Biotin-VGAVEASFKC,9)Biotin-CSGAIIVLTK。
[0010]【具體實施方式】運用基因克隆的方法構建原核重組表達質粒，純化蛋白，制備抗體，同時合成篩選多肽，進行單抗篩選。
[0011]1:pET24a-G ST-PKM2-A重組蛋白的構建及蛋白表達純化
[0012]1.1原核表達載體pET24a—GST-PKM2-A的構建
[0013]1.1.1PCR擴增:PKM2-A基因的PCR擴增，以人結腸癌細胞株HCT116cDNA為模板，進行PCR擴增。總反應體系為80ul，其中含有模板8ul，IOXPCR buffer (Mg+) 8.0 μ 1，2mM dNTP8.Ομ?，正向引物 4.Ομ? (250uM)，反向引物 4.0 μ I (250uM)，Ex-Taq DNA 聚合酶0.8μ 1，補水至80ul。反應條件:預變性94°C 5min ;變性94°C 50sec，退火56°C 50sec，復性延伸72°C Imin ;變性一復性延伸循環30次；延伸72°C IOmin0 PCR產物經電泳驗證后用PCR、酶切產物回收純化試劑盒回收純化，測其濃度。
[0014]1.1.2酶切和連接:回收純化了的PKM2-A基因和質粒pET24a各取約800ng，分別用限制性內切酶BamH I和Xho I進行酶切。反應總體系30ul，其中含有模板20ul，BamH Ilul, Xho I I μ I, IOXbuffer 3 μ I,補去離子水 30ul ;于 0.5mlEppendorf 管中，37°C水浴
3小時。酶切后的PKM2-A基因和質粒pET24a，用PCR、酶切產物回收純化試劑盒回收純化；純化后的目的基因片段和載體酶切片段，測定260nm處吸光度值(0D260值)，計算片段和載體濃度，目的片段和載體片段按6: I摩爾比進行連接。連接體系:T4 DNA連接酶?μ?，IOX連接緩沖液1μ l，pET24a lOOng，PKM2-A基因70ng，去離子水補至10 μ I ;16°C連接過夜。
[0015]1.1.3連接產物的轉化
[0016]通過鈣轉法將連接產物轉化大腸桿菌TGl感受態細胞:10 μ I連接產物加至80 μ I感受態細胞中，緩緩轉動混勻，冰上放置30min，42°C熱激90sec，冰上放置3min。轉化后的菌體加入Iml無抗生素的LB培養液，輕輕混勻，37°C，250rpm振蕩培養Ihr后，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，培養皿倒置于37°C培養過夜。[0017]1.1.4 表達載體 pET24a-GST-PKM2-A 的鑒定
[0018]隨機挑取上述平板上的單個菌落至10 μ I蒸餾水中混勻，作為模板用于PCR鑒定。反應體系:模板(菌落混懸液)2μ 1，10XPCR buffer (Mg+) 2 μ I, 2mM dNTP 2μ I,T7promoter primer I μ I, T7terminator primer I μ I, Ex-Taq DNA 聚合酶 0.1 μ I, ddH20補至20 μ I。
[0019]反應條件:預變性94 °C 5min ；變性94 °C 50sec ;退火56 °C 50sec ;復性延伸72°C Imin ;變性一復性延伸循環30次；延伸72°C IOmin。
[0020]挑取經PCR鑒定的陽性單克隆菌落于5ml LB培養基(含氨芐青霉素)中，37°C，250rpm振蕩培養過夜；將培養的菌液留出500 μ I保種，其余用小量質粒抽提試劑盒抽提質粒，質粒再用PCR、限制性內切酶BamH I和Xho I酶切驗證；經驗證的質粒用核酸測序的方法驗證插入片段序列的正確性。
[0021]1.1.5pET24a-GST-PKM2-A重組質粒在大腸桿菌BL21中的誘導表達
[0022]I)轉化:通過鈣轉法將以上抽提的pET24a-GST-PKM2_A重組質粒轉化入感受態大腸桿菌BL21:內含8(^181^21鈣轉感受態細胞的1.5111把--611(10忖管中加入重組質粒14 1，緩緩轉動混勻，冰上放置30min，42°C熱激90sec，冰上放置3min。轉化后的菌體加入ImlLB培養液，370C，250rpm振蕩培養Ihr后，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，培養皿倒置于37 °C培養過夜。
[0023]2)誘導:隨機挑取PKM2-A陽性克隆接種于3ml含60 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C，250rpm搖至0D600約為0.6 ;取出Iml未加誘導劑的菌液，4°C暫存作為誘導前對照，余下2ml菌液加入0.8M異丙基硫代半乳糖(IPTG) 2 μ I至終濃度0.8mM, 30°C，250rpm,誘導培養4hr。`
[0024]3) SDS-PAGE 電泳驗證
[0025]A.樣品:誘導前后菌液經4°C, 1000Og離心5min,棄去上清,保留菌體沉淀；誘導管加入300 μ I預冷的PBS，冰上超聲裂解細菌(每次超聲5sec，間隔lOsec，如此循環5次)；誘導管超聲結束后，41:，13200印111離心301^11，取上清液28111并保留沉淀。上清加入5 X SDS-PAGE樣品緩沖液7 μ I，沉淀中加入I X SDS-PAGE樣品緩沖液30 μ I ;對照管則在菌體沉淀中加入I X SDS-PAGE樣品緩沖液50 μ 1，混勻菌體沉淀。
[0026]B.將樣品管置于100°C水浴中煮5min，然后13200g離心lOmin，分別取10 μ I上清作SDS-PAGE電泳，濃縮膠5 %，分離膠12 %。
[0027]C.電泳條件:濃縮膠部分恒壓80V，分離膠部分恒壓120V。
[0028]D.電泳結束后，凝膠于考馬斯亮藍R250染液中固定、染色，室溫2hr。
[0029]E.棄去染色液，蒸餾水洗去殘留染色液后加脫色液脫色。
[0030]1.1.6重組蛋白GST-PKM2-A的大規模制備
[0031]質粒pET24a含有一個GST標簽，誘導表達的融合蛋白比目的蛋白大26KD。
[0032]選取可表達融合蛋白的細菌克隆接種于IOml含60μ g/nl氨芐青霉素的LB液體培養基，37°C培養過夜。第2天分別將其接種到800ml (1000ml三角燒瓶每瓶200ml)含60 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中(培養基體積不超過三角燒瓶容積的1/4)。37°C，250rpm,振蕩培養至OD6tltl約0.6后，每瓶加入IPTG至終濃度為0.8mM, 30°C繼續培養4hr。4°C, 1000Orpm離心IOmin收獲細菌存于-20°C。[0033]1.1.7重組蛋白的純化
[0034]1)每100ml培養物的細胞沉淀懸于4ml PBS緩沖液；加入溶菌酶至最終濃度Img/ml,冰上或冷藏放置30min ；
[0035]2)用針筒將IOml0.2% TritonX-1OO強行注入細胞裂解物中，劇烈震動數次混勻，加入DNase和RNase至終濃度5ug/ml,4°C震動并溫育IOmin ；
[0036]3) 40C 3000g(5000r/min)離心30min ;上清轉移到一只新試管，加入DTT至終濃度為 Immol/I,；
[0037]4)細胞裂解物與50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合，每100ml細胞培養物加2ml樹脂，于室溫下輕搖30min ；
[0038]5)混合物于4°C以500g(2100r/min)離心5min,小心去掉上清并留樣少許進行SDS-PAGE ；
[0039]6)沉淀中加入10倍標準體積的PBS，顛倒離心管數次混勻，洗去未與樹脂結合的蛋白；洗滌3次。
[0040]7)沉淀中加入I倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動lOmin，洗脫樹脂上結合的蛋白；
[0041]8)用Western blot方法鑒定蛋白(說明書附圖2)。
[0042]2:合成PKM2的表位篩選多肽組
[0043]采用多肽合成儀進行多肽片段的合成，多肽合成儀為:ABI 433型多肽合成系，合成的序列進行biotin的標記，以利于肽片段固定于帶有strepavidin的酶標版上，B片段組的序列如下:I) Biotin-1YHLQLFEEL, 2) Biotin-RRLAPITSDP, 3) Biotin-TE ATAVGAVE, 4)Biotin-ASFKCCSG,5)Biotin-AIIV LTK, 6)Biotin-LFEELRRLAP,7)Biotin-1TSDPTEATA, 8)Biotin-VGAVEASFKC，9)Biotin-CSGAIIVLTK。
[0044]3:PKM2的A、B片段的篩選及結果判定和分析
[0045]3.1 PKM2-A片段的篩選
[0046]PKM2-A片段偶聯有GST序列，因此此序列僅用于抗體的初步篩選。按照常規單克隆制備方法免疫Balb/c小鼠，制備雜合瘤單克隆細胞。篩選時，在96孔的酶標板上用固定液(碳酸鹽固定液)直接固定GST-PKM2-A抗原，同時固定GST作為對照。選擇對GST-PKM2-A片段強陽性(0D值大于1.5)的而對GST陰性的抗體，排除針對GST的抗體，初步篩選到針對PKM2-A片段的特異性抗體。同時，采用合成PKMl的同源序列(MF HRKLFEELVR ASSHSTDLMEAMAMGSVEASYKCLAAALIV LTE)進行反應，排除對PKMl有結合的抗體，提高PKM2抗體的特異性。
[0047]3.2PKM2-B片段群多肽的篩選及結果判定和分析
[0048]通過PKM2-A片段的初步篩選，獲取針對PKM2的特異性抗體。對這部分特異性的PKM2抗體，用合成的多肽分別進行篩選，選擇各個片段相應的高親和力抗體。對于針對每種獨特片段的高親和力抗體(0D值大于2.0)，進行多輪的篩選，最后篩選到各自相應的單克隆抗體，其應具備高親和力和高特異性。不同表位的抗體進行組合及優化，用于開發后續的試劑盒。
[0049]【專利附圖】

【附圖說明】圖1 PKM2-A的特異序列。在PKM2的389-433位的氨基酸序列為PKM2的獨特序列A (黃色標記部分)，PKMl的特異序列為綠色標記部分。為了克服PKM2對PKMl的交叉反應，必須選擇這段獨特氨基酸序列作為抗原進行免疫。
[0050]圖2 GST-PKM2A重組蛋白Western Blot鑒定圖。Non-1nduced為無誘導的樣本；Induced為誘導的GST-PKM2`重組蛋白，大小為31kD。
【權利要求】
1.一種提高M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白的制備方法，其特征在于: (1)通過GST標簽連接PKM2特異序列多肽抗原，提高免疫效果。 (2)多種PKM2的多肽序列，偶聯至生物素，減少非特異性抗體結合，提高篩選效率。 (3)9個多肽中獨特的氨基酸序列，可以用于篩選不同表位的抗體。
2.如權利要求書I(I)所述，其特征在于將PKM2的獨特序列(IY HLQLFEELRRLAPITSDPTE ATAVGAVEASFKCCSGAIIV LTK)連接至帶有標簽谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)的pET24a載體上，通過GST標簽與PKM2特異序列的連接，增加免疫原的特異性及分子量，提高免疫效果。
3.如權利要求書1(2)所述，其特征在于將PKM2的多肽序列偶聯至生物素上，與固定有鏈唑霉素(strepavidin)的酶標板結合，由于多肽序列的片段較小，具有高特異性和親和力的抗體才能有較強的結合，因此可以減少非特異性抗體的結合，提高免疫效果。
4.如權利要求書1(3)所述，其特征在于合成PKM2的9個多肽的獨特氨基酸序列，序列如下:l)Biotin-1YHLQLFEEL，2)Biotin-RRLAPITSDP，3)Biotin-TE ATAVGAVE，4)Biotin-ASFKCCSG,5)Biotin-AIIV LTK，6)Biotin-LFEELRRLAP，7)Biotin-1TSDPTEATA，8)Biotin-VGAVEASFKC,9)Biotin-CSGAIIVLTK0這些具不同特異性的抗原，可用于篩選不同表位的抗體。
【文檔編號】C12N15/54GK103667321SQ201210106866
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年4月12日 優先權日:2012年4月12日
【發明者】鄒國源, 陳琍, 高文霞 申請人:上海鉑嵋生物科技有限公司