專利名稱：：快速篩選分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物的方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物的快速分離方法，更具體的說是一種快速耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物的方法。
背景技術：
：脂肪酶(lipase),也稱為三脂酰甘油水解酶(triacylglycerolhydrolase,EC3.I.I.3)，能夠在油水界面上催化三脂酰甘油(甘油三酯)的酯鍵水解。除此之外，脂肪酶還可以催化酯合成、酯交換反應。和在水相進行催化相比，脂肪酶在有機相催化具有催化效率高、產物易于回收，可以催化水解的逆反應等優點。脂肪酶的有機相催化在食品、制藥、精細化工、有機合成等領域均有廣泛的應用，尤其是在食品及其相關領域，研究日益廣泛(王剛，陳光.蠟狀芽孢桿菌AaciBy1ScereusSWWL6產耐有機溶劑脂肪酶發酵條件優化及酶學性質，2011，32:241-245)。但是在有機相中，脂肪酶酶活力容易受到抑制或失活，在有機介質中維持較高的脂肪酶活性及脂肪酶催化底物的廣泛性，是實際生物催化過程中的難題。因此，開發天然耐有機溶劑脂肪酶，在理論和工業應用上具有重要的意義(肖素靜，曹艷，孫磊，何冰芳.耐有機溶劑脂肪酶產生菌的篩選及其酶學性質，食品與生物技術學報，2009，28:816-821)。目前有關耐有機溶劑脂肪酶產生微生物的報道較少，多為陸源微生物，且耐受極性常數較小的短鏈烴的能力較弱。因此，篩選新的分泌耐有機溶劑脂肪酶微生物至關重要。海洋覆蓋著地球表面積71%，且環境獨特，包羅了高鹽、高壓、低溫、低光照、寡營養等特點。海洋環境中分布著數量極其龐大、種類繁多的微生物。據估計有0.r2億種(李艷華等，2003)，而且相對于陸地微生物而言，來自海洋的微生物在物種、基因組成和生態功能上具有多樣性。通過實驗室人工培養培養已經分離和描述的海洋微生物物種數量僅僅占估計數量的1%5%，其余的微生物種群仍然未被分離和認識(李艷華，張利平.海洋微生物資源的開發與利用.微生物學通報，2003，:113-114)。因此，從海洋微生物中篩選新的分泌耐有機溶劑脂肪酶微生物機會較大。目前，耐有機溶劑脂肪酶產生菌的篩選采用傳統液體發酵方法。首先篩選脂肪酶產生菌，分離單菌，對所有菌株分別液體發酵產脂肪酶，測定蛋白酶耐有機溶劑特性，才能獲得耐有機溶劑脂肪酶產生菌(李俊峰，李紅芳，段效輝，門晉名，宿烽.耐有機溶劑脂肪酶產生菌的篩選及其粗酶酶學性質，食品科學，2012，33:116-120)。該方法成本高，周期長，勞動強度大
發明內容本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種成本低、操作簡單、周期短、效率高的快速篩選分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物的方法。本發明所要解決定的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種快速篩選分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物的方法，其特點是，其步驟如下(1)樣品采集用無菌取樣瓶采集海水或海泥樣品，4°C保存；(2)富集培養將0.5g樣品加入2216E培養基中，25°C，140rpm培養24h，得富集液；(3)平板制備2216E平板制備蛋白胨5g/L，酵母膏lg/L，磷酸高鐵0.1g/L，瓊脂20g/L，pH7.0，海水配制；每個直徑9cm的平皿加入15ml2216E固體培養基；有機溶劑、橄欖油雙層平板制備下層培養基將橄欖油、甲苯、20g/LPVA按體積比1:1:6置于燒杯中，300W超聲波乳化，超聲5s,間歇5s，再超聲5s，共5min，制備成乳化液;體積比20%乳化液，20g/L瓊脂、Ig/LCaCl2,0.01g/L羅丹明B，海水配制，pH7.0;每個直徑9cm的平皿加入8mL培養基；上層培養基5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2，海水配制，pH7.0;待下層瓊脂凝固后，再向平皿中加入8mL下層培養基；橄欖油雙層平板制備下層平板將橄欖油、20g/LPVA按體積比I:3置于燒杯中，300W超聲波乳化，超聲5s，間歇5s,再超聲5s，共5min,制備成乳化液；體積比10%乳化液，20g/L瓊脂、Ig/LCaCl2,0.01g/L羅丹明B，海水配制，pH7.0;每個直徑9cm的平皿加入8mL培養基；上層平板5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2，海水配制，pH7.0;待下層瓊脂凝固后，再向平皿中加入8mL下層培養基；(4)分離篩選對富集液進行梯度稀釋，取50yL不同稀釋度的稀釋液涂布2216E平板，25°C倒置培養36h，用一小塊滅菌的絲絨固定在直徑較平板小的圓柱形木塊上做成影印工具，將菌落影印到有機溶劑、橄欖油雙層平板和橄欖油雙層平板，22°C倒置培養值菌落36h，分別測定兩個雙層平板同樣位置產生的熒光圈直徑，計算有機溶劑、橄欖油雙層平板上熒光圈直徑和橄欖油雙層平板上熒光圈直徑的比值，比值越大，脂肪酶耐有機溶劑性能越強，依此篩選得到分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物。與現有技術相比，本發明的有益效果是本發明方法可以快速的篩選分離分泌耐有機溶劑蛋白酶海洋微生物。與傳統的液體發酵法相比，該方法不用單獨進行菌株的分離和液體發酵而直接快捷的篩選出分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物。整個過快速，操作簡單，勞動強度較小，為篩選分泌耐有機溶劑脂肪酶微生物提供了極大方便。具體實施例方式以下進一步描述本發明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。實施例1，一種快速篩選分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物的方法，其步驟如下(1)樣品采集用無菌取樣瓶采集海水或海泥樣品，4°C保存；(2)富集培養將0.5g樣品加入2216E培養基中，25°C，140rpm培養24h，得富集液；(3)平板制備2216E平板制備蛋白胨5g/L，酵母膏lg/L，磷酸高鐵0.1g/L，瓊脂20g/L，pH7.0，海水配制；每個直徑9cm的平皿加入15ml2216E固體培養基；有機溶劑、橄欖油雙層平板制備下層培養基將橄欖油、甲苯、20g/LPVA按體積比1:1:6置于燒杯中，300W超聲波乳化，超聲5s,間歇5s，再超聲5s，共5min，制備成乳化液;體積比20%乳化液，20g/L瓊脂、Ig/LCaCl2,0.01g/L羅丹明B，海水配制，pH7.0;每個直徑9cm的平皿加入8mL培養基；上層培養基5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2，海水配制，pH7.0;待下層瓊脂凝固后，再向平皿中加入8mL下層培養基；橄欖油雙層平板制備下層平板將橄欖油、20g/LPVA按體積比I:3置于燒杯中，300W超聲波乳化，超聲5s，間歇5s,再超聲5s，共5min,制備成乳化液；體積比10%乳化液，20g/L瓊脂、Ig/LCaCl2,0.01g/L羅丹明B，海水配制，pH7.0;每個直徑9cm的平皿加入8mL培養基；上層平板5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2，海水配制，pH7.0;待下層瓊脂凝固后，再向平皿中加入8mL下層培養基；(4)分離篩選對富集液進行梯度稀釋，取50yL不同稀釋度的稀釋液涂布2216E平板，25°C倒置培養36h，用一小塊滅菌的絲絨固定在直徑較平板小的圓柱形木塊上做成影印工具，將菌落影印到有機溶劑、橄欖油雙層平板和橄欖油雙層平板，22°C倒置培養值菌落36h，分別測定兩個雙層平板同樣位置產生的熒光圈直徑，計算有機溶劑、橄欖油雙層平板上熒光圈直徑和橄欖油雙層平板上熒光圈直徑的比值，比值越大，脂肪酶耐有機溶劑性能越強，依此篩選得到分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物。海洋微生物菌株的培養特征及生理生化鑒定，參照《常見細菌鑒定手冊》和((Bergeyjsmanualofdetrerminativebacteriology))(ninthedition)進行。實施例2，快速篩選分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物的方法應用實驗。將淮海工學院海洋學院微生物研究室保存的海洋耐有機溶劑脂肪酶產生菌BacillussubtilisDS9(ShuL,YaoweiF,ffeifeng,MingshengL,Shujunff,LiC.Screeningandidentificationofanovelorganicsolvent-stablelipaseproducer,AnnalsofMicrobiology,2009,59:539-543)和非耐有機溶劑脂肪酶產生菌PseudomormsfluorescensTS182,(劉姝,房耀維，王淑軍，呂明生，陳麗，焦豫良.一株海洋低溫堿性脂肪酶產生菌TS182的分離與鑒定研究，淮海工學院學報，2009，18，83-86)接種到250ml三角瓶中裝入的30ml2216E培養基中，25°C，140rpm培養24h。用無菌水對培養液進行梯度稀釋，取稀釋IO7倍的稀釋液50yL涂布2216E平板，25°C倒置培養36h，分別用一小塊滅菌的絲絨固定在直徑較平板略小的圓柱形木塊上做成影印工具，將菌落影印到有機溶劑橄欖油雙層平板和橄欖油雙層平板，22°C倒置培養值菌落36h，隨即選取兩種菌的10個菌落，測定兩個雙層平板同樣位置產生的熒光圈直徑，計算有機溶劑、橄欖油雙層平板上熒光圈直徑和橄欖油雙層平板上熒光圈直徑的比值。結果顯示耐有機溶劑脂肪酶產生菌subtilisDS9在有機溶劑、橄欖油雙層平板上熒光圈直徑和橄欖油雙層平板上熒光圈直徑的平均比值為96.9%，普通脂肪酶產生菌/vulgarisT6的平均比值為36.3%。權利要求1.一種快速篩選分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物的方法，其特征在于，其步驟如下(1)樣品采集用無菌取樣瓶采集海水或海泥樣品，4°C保存；(2)富集培養將0.5g樣品加入2216E培養基中，25°C，140rpm培養24h，得富集液；(3)平板制備2216E平板制備蛋白胨5g/L，酵母膏lg/L，磷酸高鐵0.1g/L，瓊脂20g/L，pH7.0，海水配制；每個直徑9cm的平皿加入15ml2216E固體培養基；有機溶劑、橄欖油雙層平板制備下層培養基將橄欖油、甲苯、20g/LPVA按體積比1:1:6置于燒杯中，300W超聲波乳化，超聲5s,間歇5s，再超聲5s，共5min，制備成乳化液;體積比20%乳化液，20g/L瓊脂、Ig/LCaCl2,0.01g/L羅丹明B，海水配制，pH7.0;每個直徑9cm的平皿加入8mL培養基；上層培養基5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2，海水配制，pH7.0;待下層瓊脂凝固后，再向平皿中加入8mL下層培養基；橄欖油雙層平板制備下層平板將橄欖油、20g/LPVA按體積比I:3置于燒杯中，300W超聲波乳化，超聲5s，間歇5s,再超聲5s，共5min,制備成乳化液；體積比10%乳化液，20g/L瓊脂、Ig/LCaCl2,0.01g/L羅丹明B，海水配制，pH7.0;每個直徑9cm的平皿加入8mL培養基；上層平板5g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，Ig/LCaCl2，海水配制，pH7.0;待下層瓊脂凝固后，再向平皿中加入8mL下層培養基；(4)分離篩選對富集液進行梯度稀釋，取50yL不同稀釋度的稀釋液涂布2216E平板，25°C倒置培養36h，用一小塊滅菌的絲絨固定在直徑較平板小的圓柱形木塊上做成影印工具，將菌落影印到有機溶劑、橄欖油雙層平板和橄欖油雙層平板，22°C倒置培養值菌落36h，分別測定兩個雙層平板同樣位置產生的熒光圈直徑，計算有機溶劑、橄欖油雙層平板上熒光圈直徑和橄欖油雙層平板上熒光圈直徑的比值，比值越大，脂肪酶耐有機溶劑性能越強，依此篩選得到分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物。全文摘要本發明是一種快速篩選分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物的方法，該方法以采集的海水或海泥為樣品進行富集培養，再制備2216E平板制備、有機溶劑、橄欖油雙層平板和橄欖油雙層平板，然后對富集液進行梯度稀釋，測定平板同樣位置產生的熒光圈直徑，計算有機溶劑、橄欖油雙層平板上熒光圈直徑和橄欖油雙層平板上熒光圈直徑的比值，比值越大，脂肪酶耐有機溶劑性能越強，依此篩選得到分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物。本發明能夠快速、直觀、高效的篩選到分泌耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物，為耐有機溶劑脂肪酶的海洋微生物的研究提供了極大方便。文檔編號C12N1/00GK102643746SQ20121012745公開日2012年8月22日申請日期2012年4月27日優先權日2012年4月27日發明者劉姝,呂明生,房耀維,焦豫良,王淑軍申請人:淮海工學院